第9章真核生物基因組

1、真核生物基因組真核生物基因組一 真核生物基因結(jié)構(gòu)1 啟動子元件 開放閱讀框標(biāo)志： 由于大量內(nèi)含子的存在，真核生物中沒有發(fā)現(xiàn)原核生物具有的顯著長度的開放閱讀框標(biāo)志。 RNA聚合酶種類： 與原核生物只使用一種由多種蛋白質(zhì)聚合而成的RNA聚合酶不同，真核生物至少使用由812種蛋白質(zhì)組成的3種不同類型的RNA聚合酶。 啟動子元件多樣性： 每種真核生物RNA聚合酶都能識別一套不同的啟動子，并轉(zhuǎn)錄不同類型的基因。RNA聚合酶啟動子位置啟動子的復(fù)雜性所轉(zhuǎn)錄的基因RNA聚合酶-45至20簡單核糖體RNARNA聚合酶上游遠(yuǎn)端至-25非常復(fù)雜蛋白質(zhì)編碼基因RNA聚合酶50至100簡單tRNA和其他小RNA3種真核

2、生物RNA聚合酶2 斷裂基因內(nèi)含子和外顯子 內(nèi)含子（intron）：已發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞中至少有8種明顯不同的內(nèi)含子，但只有一種遵循GU-AG規(guī)則（GU-AGrule）的內(nèi)含子與真核細(xì)胞蛋白編碼基因有關(guān)系。 GU-AG規(guī)則：所有內(nèi)含子序列5端起始的兩個核苷酸總是5-GU-3，而3端的最后兩個堿基總是5-AG-3 。 內(nèi)含子和外顯子的長度： 內(nèi)含子至少長60bp； 在脊椎動物中外顯子長度的變化范圍也很廣，于1002000bp之間，常見的長約450bp。Eukaryotic Gene 真核基因的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)和對應(yīng)的hmRNA轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過加工后的mRNA：（a）顯示了與酵母內(nèi)含子的5和3剪接位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)

3、的保守序列。每個核苷酸旁的下標(biāo)數(shù)字表示該核苷酸在所有已知酵母基因內(nèi)含子中的出現(xiàn)頻率。（b）剪接體通過配對識別剪接位點(diǎn)，從而產(chǎn)生mRNA以供核糖體翻譯之用。 不同生物基因組內(nèi)含子的特點(diǎn)： 在簡單的真核基因組中內(nèi)含子一般出現(xiàn)得較少（如酵母基因組6000個基因中總共只有239個內(nèi)含子 95%的人類基因至少有一個內(nèi)含子，某些單個基因中就具有100個或更多內(nèi)含子 內(nèi)含子在給定基因中的位置具有進(jìn)化保守性，在同源基因的序列比對中內(nèi)含子經(jīng)常出現(xiàn)在相同的位置。3 基因的轉(zhuǎn)錄真核真核mRNA原始轉(zhuǎn)錄體（原始轉(zhuǎn)錄體（primary transcripts）：）：n 簡單原始轉(zhuǎn)錄體經(jīng)剪接僅生成一條成熟mRNA和翻譯出

4、一條多肽鏈n 復(fù)雜原始轉(zhuǎn)錄體在不同的時（不同發(fā)育階段）空（不同組織細(xì)胞），同一原始轉(zhuǎn)錄體因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)、剪接方式或終止點(diǎn)的不同，可產(chǎn)生兩種或多種成熟mRNA和多肽鏈。 例如例如果蠅肌球蛋白重鏈轉(zhuǎn)錄體，在不同發(fā)育階段有三種不同表達(dá)產(chǎn)物。相同的降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide）原始轉(zhuǎn)錄體，在甲狀腺、腦等不同組織細(xì)胞內(nèi)，因剪接方式不同使其表達(dá)產(chǎn)物不同。 1. 不同B細(xì)胞的免疫球蛋白原始轉(zhuǎn)錄體都是相同的4 轉(zhuǎn)錄后加工加帽、剪接和加尾：RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄物在加工前稱為hnRNA（異質(zhì)RNA），通過加帽（capping）、剪接和多聚腺苷酸化轉(zhuǎn)化成適合核糖體翻譯的m

5、RNA。加帽（capping）是指所有發(fā)生在hnRNA5末端的化學(xué)改變（包括甲基化作用）剪接（splicing）從hnRNA中大批地精確切除大片段的過程多聚腺酸化（polyadenylation）指用一段大約由250個腺嘌呤（A）組成的序列替換hnRNA3端的過程，這段序列不被翻譯?？勺兗羟?大部分真核基因被加工成一種類型的剪接后mRNA，約有20%的人類基因因?yàn)榭勺兗艚佣a(chǎn)生兩種或多種的人類基因因?yàn)榭勺兗艚佣a(chǎn)生兩種或多種mRNA序列序列 有一個人類基因已被證明，相同的原始轉(zhuǎn)錄物可以產(chǎn)生64種不同的mRNA 外顯子的相互排斥： 小鼠肌鈣蛋白T基因的外顯子2和3是相互排斥的，外顯子2用在平滑肌

6、中，而外顯子3用于其他所有組織中 剪接裝置： 由多種細(xì)胞核內(nèi)小RNA和一些蛋白組成，不同的細(xì)胞類型中可不同RepressorRepressor stops splicing that would otherwise occurActivatorActivator initiates splicing that otherwise wouldnt occurBasic MechanismAlternative splicingWith a few genes, alternative splicing generates more than one mRNA from the primary t

7、ranscript.Exons, or parts of exons, may be skipped.二 重復(fù)序列 重復(fù)序列是指多拷貝的相同或近似序列的DNA片段。 重復(fù)序列一般可以分為兩類： 高度重復(fù)序列和中度重復(fù)序列 串行重復(fù)DNA和分散在整個基因組中的重復(fù)片段1 高度重復(fù)序列：衛(wèi)星衛(wèi)星DNA、小、小/微衛(wèi)星微衛(wèi)星 重復(fù)頻度105。 在真核生物基因組中，約有45%60%的DNA中G：C堿基對含量較高，相對浮力密度大，將DNA打碎后，進(jìn)行密度梯度超離心分離，可見一主峰和12個小峰，這種小峰被看成是主峰的衛(wèi)星，稱為衛(wèi)星DNA，它是多種短重復(fù)序列的混合物。 根據(jù)衛(wèi)星DNA的長度，又可分成3種。衛(wèi)

8、星DNA（satellite DNA）： 其重復(fù)序列長度在5 bp 200 bp，串聯(lián)排列，通常存在著幾百萬個拷貝，總長度最長可達(dá)100 Mb， 它們主要存在于異染色體以及中心粒和端粒附近，通常不轉(zhuǎn)錄。小衛(wèi)星小衛(wèi)星DNA（mini-satellite DNA）：）： 重復(fù)序列長度在重復(fù)序列長度在1570 bp之間，串聯(lián)排列，總長度在之間，串聯(lián)排列，總長度在0.5 kb 30 kb 主要分布于常染色體，在人群中有高度的多態(tài)性（也即主要分布于常染色體，在人群中有高度的多態(tài)性（也即有高度的特異性或拷貝的多態(tài)性）。有高度的特異性或拷貝的多態(tài)性）。微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNA（micro-satellite DN

9、A） 由26個核苷酸長的重復(fù)序列組成，又稱為簡單串聯(lián)重復(fù)序列（simple tandem repeats STRs） 以(CA)n、(GT)n、(CAG)n較常見，重復(fù)次數(shù)多為1560次，總長度一般在400 bp以下。 存在于常染色體，除著絲粒及端粒區(qū)域外, 微衛(wèi)星DNA在染色體的其他區(qū)域均廣泛均勻分布。很隨機(jī)地分布在整個基因組中，而不像衛(wèi)星或小/微衛(wèi)星那樣串聯(lián)成簇存在 微衛(wèi)星DNA在基因組中的功能尚不清楚，已知其有自身特異結(jié)合蛋白，是一種非常活躍的堿基序列, 且能直接編碼蛋白質(zhì)； 另外，微衛(wèi)星DNA能參與遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，染色體折疊及端粒形成，是基因重排和變異的來源, 通過改變DNA結(jié)構(gòu)或

10、與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮其基因調(diào)控作用。 在人類基因組中，由CA重復(fù)序列構(gòu)成的微衛(wèi)星如5-CACACACACACA-3大約每1萬bp出現(xiàn)一次，占整個基因組的0.5%（總共15Mb），而單堿基重復(fù)（即5-AAAAAAAA-3）占人類基因組的0.3%微衛(wèi)星的產(chǎn)生機(jī)理 大多認(rèn)為是DNA復(fù)制和修復(fù)過程中的復(fù)制滑脫復(fù)制和修復(fù)過程中的復(fù)制滑脫( replication slippage )，滑鏈錯配滑鏈錯配（slipped-strand mispairing）或染色體減數(shù)分裂時姊妹染色單體不均等交染色體減數(shù)分裂時姊妹染色單體不均等交換換的結(jié)果。 微衛(wèi)星DNA的核心序列是高度保守的，而微衛(wèi)星DNA本身的重復(fù)

11、單位變異則是形成多態(tài)性的基礎(chǔ)，其高度多態(tài)性主要表現(xiàn)在核苷酸重復(fù)單位數(shù)目的多態(tài)性和重復(fù)序列中核苷酸的替換多態(tài)性。 重復(fù)單位數(shù)目的多態(tài)性是由于STR在精子和卵子產(chǎn)生時，以及在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂過程中發(fā)生不相等的交叉重組造成的。 由于這種不相等的交叉重組，使STR的長度在每一個個體中有差別，這也是進(jìn)行DNA指紋分析的基礎(chǔ)。 中度重復(fù)序列 由較大的片段（由100 bp到幾千bp）串聯(lián)重復(fù)組成，分散在整個基因組中，重復(fù)頻度不等 一般具有種屬特異性，可作為DNA標(biāo)記 有多種類型的中度重復(fù)序列，其表達(dá)產(chǎn)物常是細(xì)胞大量需要的，如rRNA、tRNA和組蛋白等。1、rRNA基因 真核生物的rRNA有28s、18s、

12、5.8s和5s 4種，其中28s、18s和5.8s 3種的編碼基因串聯(lián)排列，組成一個轉(zhuǎn)錄單位，在人類基因組中約有300個拷貝，分布在13、14、15、21和22號染色體上。 在每個轉(zhuǎn)錄單位的各種rRNA編碼基因間都有一個基因間隔區(qū)，在28s rRNA基因中還存在插入序列，在轉(zhuǎn)錄時一并轉(zhuǎn)錄，形成rRNA前體，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工，切除間隔區(qū)，插入序列等加工成3種成熟的rRNA。 5s rRNA基因單獨(dú)為一個轉(zhuǎn)錄單位，在人類基因組中約有2000個拷貝, 位于1號染色體。rRNA基因可以作為一種遺傳標(biāo)志，在分子遺傳學(xué)中有重要的意義。2、tRNA基因： 每一種tRNA基因的拷貝數(shù)有幾十到幾百個。同一種tRNA

13、基因常常串聯(lián)在一起排列成基因簇，各個編碼tRNA基因之間也有間隔區(qū) 有的tRNA基因編碼序列中插入有內(nèi)含子3、Alu家族：家族： 每個長度約300bp，富含CG，因在其第170bp處有一個限制性內(nèi)切酶Alu I（AGCT）的位點(diǎn)而得名 占人類基因組的3%6%，Alu家族分散于整個基因組的間隔序列中，多位于一些編碼基因的5端和3端的遠(yuǎn)端，個別的也有存在于內(nèi)含子中。 Alu序列具有種屬特異性，其功能可能與hnRNA的加工成熟，DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)。三、基因家族(gene family) 在真核細(xì)胞編碼蛋白質(zhì)的基因中，約有25%50%是以單個基因存在于基因組中。而剩余的基因都有2個或2個以上序列

14、相似而又不全相同的基因。 是一組功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因，可能由某一共同祖先基因經(jīng)重復(fù)和突變產(chǎn)生，這一組基因就稱為基因家族，被其編碼的同源蛋白稱為蛋白質(zhì)家族，具有相似的功能。 基因家族有大有小，從幾個到幾十個，少數(shù)情況可有幾百個，稱為超級家族。珠蛋白和組蛋白基因家族是研究得最多的例子。組蛋白基因家族組蛋白基因家族四 移動基因 轉(zhuǎn)座子（transposon） 插入序列(insertion sequence)（末端反向重復(fù)中間的編碼轉(zhuǎn)座酶基因），轉(zhuǎn)座酶促使對應(yīng)的轉(zhuǎn)座子以保守（重復(fù)拷貝的數(shù)目沒有變化）或復(fù)制（拷貝數(shù)增加）的方式從基因組的一個部位插入到另一個部位（轉(zhuǎn)座）。 復(fù)合轉(zhuǎn)座子（指I

15、S元件其他基因） Tn3型轉(zhuǎn)座子（一般以復(fù)制的方式轉(zhuǎn)座） 可轉(zhuǎn)座的噬菌體（將復(fù)制性轉(zhuǎn)座作為它們正常感染周期一部分的病毒） 人類基因組中的DNA轉(zhuǎn)座子數(shù)少于1000。 真核轉(zhuǎn)座子mariner長1250bp，最早是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，但現(xiàn)在包括人類在內(nèi)的多種真核生物中都發(fā)現(xiàn)了這種轉(zhuǎn)座子。Replicative Transposition; Tn3Element encodes a transposase for transposition, a repressor that regulates the transposase and an antibiotic resistance geneAgai

16、n, the ends of the element are critical for movementReplicative Transposition五 人類基因組n 人類基因組概貌：人類基因組概貌：人類基因組結(jié)構(gòu)大編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因比例極少作為真核生物，人類基因組也具有真核生物基因組的一般結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 假基因 CpG島 甲基化等。 2 假基因根據(jù)是否保留相應(yīng)功能基因的間隔序列(如內(nèi)含子)，分兩大類： 保留了間隔序列，稱為復(fù)制型假基因( duplicated pseudogene)，通常因基因的復(fù)制修飾，如點(diǎn)突變、插入、缺失和移碼突變而導(dǎo)致復(fù)制后的基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯時出現(xiàn)異常，喪失正常功能，它

17、與功能基因通常在同一條染色體上，也稱非加工假基因(non-processed pseudogene) 。 缺少間隔序列的已加工假基因(processed pseudogene)，主要是轉(zhuǎn)錄過程中mRNA以cDNA的方式重新整合進(jìn)入基因組（很可能發(fā)生在生殖細(xì)胞中），在長期進(jìn)化選擇過程中因?yàn)殡S機(jī)突變積累而喪失功能。已加工假基因序列兩邊有小的側(cè)翼定向重復(fù)序列(flanking direct repeat) ，3端多具多聚腺苷酸尾。目前已知人類基因組上的假基因，數(shù)目估計(jì)約在20 000個以上，呈現(xiàn)極不均一分布。意義：一些在醫(yī)學(xué)中非常重要的人類基因也有假基因，這可能干擾疾病的診斷和治療，系統(tǒng)和準(zhǔn)確地對基

18、因組上假基因進(jìn)行分類有助于對功能基因的預(yù)測和研究。3 DNA甲基化 是哺乳動物DNA最常見的復(fù)制后調(diào)節(jié)方式之一，由甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)?甲基胞嘧啶（5mC）。 DNA甲基化與基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，即基因在它不表達(dá)的組織中被甲基化，而在特異表達(dá)的組織中非甲基化。 甲基化一方面可在發(fā)育和分化中調(diào)控基因表達(dá)，還可中和潛在的危險(xiǎn)的DNA序列，如外源病毒和轉(zhuǎn)座子等。 DNA甲基化調(diào)控基因表達(dá)直接的機(jī)制：調(diào)控基因表達(dá)直接的機(jī)制： 可能是因?yàn)榧谆鶑腄NA分子的大溝中突出，阻止了轉(zhuǎn)錄因子與基因相互作用， 還可能直接抑制RNA聚合酶活性而抑制基因的表達(dá)。 DNA甲基化是腫瘤中最常見的一種分子改變，包

19、括基因組總體甲基化水平降低和某些基因啟動區(qū)域的高甲基化(hypermethylation)。 基因組總體甲基化水平降低導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定 發(fā)生于細(xì)胞周期調(diào)控基因、DNA 修復(fù)基因、血管形成基因及細(xì)胞凋亡基因相應(yīng)的CpG 島的甲基化，則引起轉(zhuǎn)錄沉默(silencing)，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞形成。 4 CpG島 CG兩聯(lián)核苷酸的出現(xiàn)頻率低： CG兩聯(lián)核苷酸的出現(xiàn)頻率僅為其隨機(jī)出現(xiàn)頻率的20% 許多人類基因5端的12kb片段中發(fā)現(xiàn)CpG島： 這些CpG島一般跨越-1500500，并且其CpG密度達(dá)到隨機(jī)預(yù)測的水平。 CpG島的意義： CpG與已知轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子如Sp1等的結(jié)合位點(diǎn)有關(guān) 人類基因組大約有4

20、5000個CpG島，有一半左右與已知的管家基因關(guān)聯(lián)，其余的CpG島有許多和組織特異性基因的啟動子相關(guān)聯(lián) CpG島很少出現(xiàn)在不含基因的區(qū)域或那些發(fā)生多次突變的基因中 兔類球蛋白基因族：人類基因組富含GC的一組組織特異性基因。對應(yīng)基因的區(qū)域用黑色框來表示，而兔基因組中主要短散布元件的拷貝（C重復(fù)）用數(shù)字標(biāo)注并表示為黑色箭頭。 下一幅圖顯示200bp滑動窗口中出現(xiàn)核苷酸G或C的頻率。 底部兩附圖表示200bp滑動窗口中兩聯(lián)核苷酸CpG和GpC和出現(xiàn)次數(shù)。在-1球蛋白基因的5端都出現(xiàn)了CpG島。另外兩聯(lián)核苷酸5-GC-3的出現(xiàn)次數(shù)一般比CpG高，這是因?yàn)镃pG易被甲基化而發(fā)生突變。5. 人類基因組的多

21、態(tài)性及在分子診斷中的應(yīng)用短串聯(lián)重復(fù)序列短串聯(lián)重復(fù)序列 ( short tandem repeat , STR)： STR在人類基因組內(nèi)分布廣泛，平均每15 kb20 kb就有一個STR位點(diǎn)，占基因組的10% 多存在于非編碼區(qū)及內(nèi)含子中，具高度多態(tài)性且信息量大，檢測快速，成為非常重要的一種遺傳標(biāo)記。STR的主要用途：的主要用途： 人類基因遺傳圖譜的制作。 目的基因篩選和基因診斷。若目的基因與STR位點(diǎn)鄰近且有連鎖關(guān)系，可通過對STR附近區(qū)域克隆測序而發(fā)現(xiàn)目的基因。通過家系和對照研究，運(yùn)用連鎖和相關(guān)分析，可以找到與疾病高度相關(guān)STR位點(diǎn)。1993年首先發(fā)現(xiàn)肝臟苯丙氨酸羥化酶(phenylalani

22、ne hydroxylase，PHA)基因內(nèi)含子3中，有STR位點(diǎn)（TCTA）存在于約700bp處，通過連鎖分析可對PKU患者進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷。 法醫(yī)學(xué)個體識別和親權(quán)鑒定。法醫(yī)案例中，特別對量極少和降解嚴(yán)重的生物檢材，通過PCR擴(kuò)增STR位點(diǎn)并將幾個STR位點(diǎn)聯(lián)合起來分析，可得到相當(dāng)高的累積個體識別率和父權(quán)排除率，可為司法偵案、破案提供有利的科學(xué)依據(jù)。 STR在醫(yī)學(xué)的意義： STR位點(diǎn)的不穩(wěn)定性與疾病的相關(guān)性是研究熱點(diǎn)，STR主要以三核苷酸為重復(fù)單位，如果父母本的某個或某些STR重復(fù)次數(shù)超過正常個體的上限，處于一種前突變狀態(tài)，則易造成后代相應(yīng)位點(diǎn)核心序列重復(fù)數(shù)目急劇增加。已發(fā)現(xiàn)有8種人類遺傳性

23、疾病與此相關(guān)，如脆性X 綜合癥、重癥肌無力(myasthenia gravis)、Huntington 舞蹈癥（Huntingtons chorea disease）等。 STR與腫瘤關(guān)系密切。1990年在遺傳性非息肉性結(jié)腸炎中發(fā)現(xiàn)，與正常組織比較，腫瘤組織中STR拷貝數(shù)發(fā)生明顯變異，在胃癌、食道癌、乳腺癌及肺癌等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)STR不穩(wěn)定現(xiàn)象，使STR成為腫瘤檢測的重要手段。單核苷酸的多態(tài)性 單核苷酸的多態(tài)性( single nucleotide polymorphism, SNP): 是因單個堿基的變異（主要是置換，也有缺失和插入）引起的DNA序列多態(tài)性，在特定核苷酸位置上存在兩種不同的

24、堿基，其中最少一種在群體中的頻率不小于1%。 人類基因組中每3001000個核苷酸就有一個SNP，占所有已知多態(tài)性的90%以上。 盡管遺傳密碼由4種堿基組成，但SNP通常是二等位基因（biallelic）的，CG序列出現(xiàn)最為頻繁，大多是C轉(zhuǎn)變?yōu)門，原因是CG中C常為甲基化的、自發(fā)地脫氨后即成為胸腺嘧啶。 SNP在單個基因或整個基因組中的分布不是均勻的，由于選擇壓力等原因，SNP在非轉(zhuǎn)錄序列中要多于轉(zhuǎn)錄序列，而且在轉(zhuǎn)錄區(qū)也是非同義突變的頻率比其它方式突變的頻率低得多。 在蛋白質(zhì)編碼區(qū)的SNP被稱為基因編碼區(qū)SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs），與蛋白的功能有關(guān)，在功能或致病方面具重要意義。ATGCACACACACACACACATGCACACACACACACACACACAType of variation Type of variation among populationamong populationSNPSNPSTRSTRSNP主要用途有： 疾病的連鎖分析與基因的定位，包括復(fù)雜疾?。ㄈ绻琴|(zhì)疏松癥、糖尿病、心血管疾病、腫瘤等）的基因定位、關(guān)聯(lián)分析，并可用于遺傳病的單倍型診