RTCIM自動化實時檢測細胞遷移和侵潤

1、Automated and Real-time Cell Migration and Cell Invasion Assay Using theRT-CIMTM System 使用RT-CIMTM系統(tǒng)自動化實時檢測細胞遷移和侵潤實驗目錄NO.1 簡介NO.2 材料和方法NO.3 應用NO.4 總結(jié)NO.1 簡介RT-CIM系統(tǒng)是用于檢測細胞侵潤和遷移的新型實時細胞分析系統(tǒng)。16孔RT-CIM系統(tǒng)主要由4部分組成： 1. W200微電子細胞分析儀 2.16孔RT-CIM工作臺 3. 計算機（預裝SP軟件） 4.16孔RT-CIM檢測板 RT-CIM檢測板由上室板和下室板組成。 上室板中的16個孔

2、的底部具微孔膜，其下表面整 合了微電子生物傳感器。 下室板則作為細胞培養(yǎng)基的容器。 當上室板中的細胞通過微孔發(fā)生遷移時就可被生 物傳感器檢測到。通過RT-CIM系統(tǒng)測量的阻抗得到的指數(shù)，反映了遷移細胞的數(shù)量。在SP軟件的控制下，微電子細胞分析儀連接16孔RT-CIM工作臺，自動選擇16孔RT-CIM檢測板上的每個生物傳感器進行測試，并把測試數(shù)據(jù)傳輸給軟件。SP軟件根據(jù)此數(shù)據(jù)得到細胞指數(shù)，并繪制曲線。RT-CIM系統(tǒng)的優(yōu)點： 1. 對16孔一次測試時間小于10s 2.可靈活的配置16-96個測試孔 3.系統(tǒng)高可靠性 4.可根據(jù)需求靈活制定實驗流程 5.強大的數(shù)據(jù)分析能力NO.2 材料和方法遷移和

3、侵潤使用RT-CIM。遷移實驗和趨觸性實驗中一般情況下，首先，細胞血清饑餓4小時，然后用胰蛋白酶消化細胞，停止旋轉(zhuǎn)，并懸浮在顯示細胞密度是“0.2牛血清白蛋白”的無血清培養(yǎng)基中。在此之前電鍍細胞，制備涂布膜。為制備胞外外基質(zhì)涂層，將稀釋適當濃度的ECM并將其添加到在膜的兩側(cè)進行遷移實驗和傳感器側(cè),僅用于30分鐘-1小時的趨觸性實驗?？刂颇ね恳許FM或牛血清白蛋白 PBS/0.2。涂布后，用PBS洗滌膜，并用PBS/0.2牛血清白蛋白封阻15-30分鐘。底部室都充滿了牛血清白蛋白 SFM/0.2及趨化因子為完成遷移實驗或完成介質(zhì)趨觸性實驗。設備組裝和細胞補充至頂端室,然后進行細胞遷移監(jiān)控。對于侵

4、潤實驗，所用試劑和細胞處理類似于遷移實驗中所描述的方法和其它的涂層。定量遷移。經(jīng)過幾個小時的遷移或侵潤，裝置確定RTCIM位置站和最后一個細胞指數(shù)。此外，對于手動計數(shù)，設備會被分解,頂部室會被浸入的PBS洗滌。經(jīng)染色后，膜頂部的細胞被輕輕擦拭除去并對膜底部一側(cè)細胞的進行定量。定量用顯微鏡為4個單獨欄的每個樣品計數(shù)。 RT-CIM遷移設備的示意圖遷移設備的示意圖 A）的橫截面組裝設備描繪上下腔。 B）底部（膜側(cè)）上腔顯示裝有金制的微型傳感器。 C-D）組件的上部和下部腔室的RT-CIM用的螺栓和螺絲。 E）RT-CIM站是為了RT-CIM遷移的設備置于恒溫箱。NO.3 應用3.1代表性的細胞株和

5、原代細胞遷移的評定： 為監(jiān)視遷移的侵潤性細胞系MDA-MB-231和HT1080，原代細胞，人臍靜脈內(nèi)皮細胞和非侵潤性的細胞系，頂部室中加入NIH-3T3，2和4X104細胞,底室培養(yǎng)基填充5血清作為趨化因子。遷移過程每兩分鐘檢測一次，總計超過14小時。所選擇的終止點是這些細胞系的倍增時間小于消除細胞增殖時。當它通過并在膜的底面落戶時，膜的集成傳感器可直接連續(xù)監(jiān)測底側(cè)上的頂部室的細胞。加入細胞后，觀察每個細胞系遷移的特征模式。在第一個2 - 4小時觀察到HT1080，NIH-3T3，和人臍靜脈內(nèi)皮細胞的細胞指數(shù)快速增加。這通過陡峭的趨化梯度反映了存在多數(shù)移動的細胞。隨著時間的推移細胞指數(shù)增加減

6、慢。這時梯度變淺，較少的細胞遷移。與此相反，隨著時間的推移遷移，MDA-MB-231細胞顯示出相比其它細胞系更加持久的增長。對于所有細胞系研究RT-CIM能夠測量鍍層細胞密度的數(shù)量上的高低差異。代表細胞株和原細胞遷移實時定量測量A）2和4x104細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞和MDA-MB-231B）HT1080和NIH-3T3細胞的頂端超過14小時監(jiān)控室和遷移。3.2細胞遷移的定量RT-CIM系統(tǒng)對RT-CIM技術(shù)的重要特征之一是允許進行簡單的定量分析細胞遷移。對于統(tǒng)計評估的質(zhì)量測量，添加不同密度的HT1080和COS7細胞到頂腔的電子室，對遷移實驗進行定量RT-CIM計數(shù)和手動細胞計數(shù)。類似早期觀

7、察到的HT1080遷移模式，前幾個小時可觀察到細胞指數(shù)快速增長，接著細胞指數(shù)增加較慢。隨著時間的推移鍍層細胞密度相對細胞指數(shù)計量按比例增加。要確定相關(guān)遷移定量RT-CIM與更傳統(tǒng)的定量方法，如細胞計數(shù)，遷移電子室細胞指數(shù)值經(jīng)過14個小時的細胞遷移手工計數(shù)，與電鍍細胞數(shù)成反比。結(jié)果表明：細胞計數(shù)和細胞指數(shù)值與鍍層細胞密度密切相關(guān)，并通過一定范圍內(nèi)的細胞密度，定量遷移細胞的類似的變化趨勢和相對差異。此外，演示和統(tǒng)計學評估這些量化的電鍍技術(shù)和細胞數(shù)之間的關(guān)系，測得的遷移細胞用RT-CIM和細胞計數(shù)繪制細胞數(shù)的圖形和顯示相關(guān)系數(shù)，這個測量顯示這兩個變量間有很強的關(guān)聯(lián)性。圖中顯示遷移的細胞指數(shù)和鍍層細胞

8、數(shù)很強的相關(guān)性之間。進行COS7細胞的分析，并得到類似的結(jié)論。3.3遷移定量評估不同的趨化因子和細胞外基質(zhì)（ECM）有關(guān)的細胞遷移的激活幾個水溶性和非水溶性因素。細胞在響應空間梯度的定向運動被描述為可溶性因子的趨化，響應于諸如ECM的非可溶性因子被稱為haptotaxis。使用RT-CIM，我們能夠定量評估這些因素對遷移的效果。 COS7細胞治療各種趨化因子表現(xiàn)出不同的遷移模式（圖4A）。在整個遷移過程中 ，COS7細胞與肝細胞生長因子治療、表皮生長因子或血清治療相比，細胞指數(shù)的變化顯示最高的細胞趨化因子。為了驗證這些細胞指數(shù)的變化與遷移的細胞數(shù)量，細胞染色遷移膜的底面進行計數(shù)。對于指數(shù)在14

9、小時內(nèi)比較，細胞和細胞計數(shù)細胞指數(shù)值與細胞遷移的數(shù)量。使用不同的ECM和趨化因子對原代細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞的遷移進行定量評估。頂部室添加4X104人臍靜脈內(nèi)皮，細胞膜涂血清（NC）或FN，試驗箱底部填充血清或VEGF作為趨化因子的介質(zhì)。haptotaxis的研究的研究3.4有代表性的細胞株入侵的定量評估除了遷移，可用RT-CIM通過生物屏障同時進行細胞浸潤的評估和定量。研究侵潤，可用被稀釋的基質(zhì)膠覆蓋在膜的頂部；研究遷移，用涂有血清的膜。饑餓后的血清細胞頂室中孔的底部加入含有作為趨化因子的血清的培養(yǎng)基。如前所述，含血清的HT1080細胞和NIH-3T3細胞可以觀察到迅速增加的細胞指數(shù)（圖6A）?？芍毎笖?shù)增加依賴于血清，無血清時細胞指數(shù)的增加很少。有趣的是，存在基質(zhì)膠的條件下，觀察到有5