β-內酰胺類抗生素高分子雜質及分析方法

1、B-內酰胺類抗生素高分子雜質及分析方法審評三部霍秀敏摘要：本文簡要介紹了高分子雜質的定義、來源和分類，使讀者對B-內酰胺類抗生素高分子雜質有一個全面的了解；闡述了高分子雜質的分析方法，對凝膠色譜-自身對照外標法定量的原理和方法驗證的主要內容進行了詳細的說明，供注冊申請人和業(yè)內人士在進行高分子雜質質量控制研究時參考。關鍵詞：B-內酰胺類抗生素，高分子雜質，分析方法。B-內酰胺類抗生素(B-lactamantibiotics)系指化學結構中具有B-內酰胺環(huán)的一大類抗生素，包括臨床最常用的青霉素(penicillins)與頭抱菌素(cephalosporin),以及近年開發(fā)的頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)

2、B-內酰胺類等其他非典型B-內酰胺類抗生素。一般來說，該類抗生素較為安全，不良反應少，但對特異體質的患者也可發(fā)生致命性的不良反應，如過敏性休克，致使此類藥物在臨床的應用中受到限制。本文介紹了B-內酰胺類抗生素高分子雜質的定義、來源、分類和分析方法，詳細地闡述了凝膠色譜-自身對照外標法定量的原理和方法驗證的主要內容，供注冊申請人和業(yè)內人士在進行高分子雜質質量控制研究時參考。一、介內酰胺類抗生素中的高分子雜質1、高分子雜質的定義高分子雜質系指藥物中分子量大于藥物本身的雜質的總稱。分子量一般在10005000道爾頓，個別可至10000道爾頓。2、高分子雜質的來源B-內酰胺類抗生素高分子雜質有外源性和

3、內源性兩種。外源性一般源于發(fā)酵工藝，為蛋白、多肽、多糖等雜質與抗生素結合的雜質。內源性系指抗生素藥物自身聚合的產(chǎn)物。聚合物既可來自生產(chǎn)過程，又可在貯藏過程中形成，甚至在用藥時也可以產(chǎn)生。如阿莫西林顆粒在采用開水沖服時，其高分子雜質可增加100倍。隨著現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的不斷改進和提高，目前產(chǎn)品中外源性雜質日趨減少，對內源性聚合物的控制是當前抗生素藥物高分子雜質控制的重點。3、高分子雜質的分類B-內酰胺類抗生素主要包括青霉素和頭抱菌素兩大類，除青霉素G和V外，臨床中常用的B-內酰胺類抗生素均為半合成抗生素，故除青霉素G和V中還含有少量的青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽外，其他產(chǎn)品中的高分子雜質主要是聚合物。

4、（1）青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽的分子量在35002400道爾頓左右，由青霉素的B-內酰胺環(huán)和多肽上的伯氨基按親核反應機理縮合而成，主要在發(fā)酵工藝中形成。高pH環(huán)境有利于縮合反應的進行；樣品在貯藏過程中，多肽類雜質殘留的自由氨基仍能和B-內酰胺環(huán)反應，直至被飽和；反應速度與樣品本身水分含量和貯藏溫度有關，青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽的性質比較穩(wěn)定。（2）青霉素聚合物青霉素的聚合反應有兩種方式：一種是一分子青霉素的母核開環(huán)，形成活性位點，與另一分子青霉素母環(huán)上的活性基團聚合，側鏈上的活性基團不參與反應。另一種是一分子青霉素的母核開環(huán)，形成活性位點，與側鏈上的活性基團聚合。

5、對側鏈不含氨基等活潑基團的青霉素，聚合反應只按一種方式進行；對氨芐青霉素等側鏈含有氨基的青霉素，聚合反應可按兩種方式進行。（3）頭孢菌素聚合物頭抱菌素的聚合反應亦有兩種方式：一種是只發(fā)生于母核的N型聚合反應，另一種是側鏈參與的L型聚合反應。對于7位側鏈中不含自由氨基的頭孢菌素，如頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢哌酮等只能發(fā)生N型聚合反應。位側鏈中有自由氨基的頭抱菌素（如頭抱氨芐、頭抱拉定、頭抱噻肟等），在酸性條件下，氨基主要以季銨鹽的形式存在，一般只發(fā)生N型聚合反應。在堿性條件下，N型和L型聚合反應均可以發(fā)生。N型和L型聚合反應的相對強度由化合物的結構決定。如頭孢曲松、頭孢他啶等側鏈的自由氨基應可直接

6、與噻唑環(huán)連接，但由于共軛效應的存在使得自由氨基的親核攻擊能力大大減弱，故產(chǎn)品中的聚合物主要為N型聚合物。二、仕內酰胺類抗生素高分子雜質的分析方法高分子雜質的分析方法主要有：反相色譜法、離子交換色譜法和凝膠色譜法（分子排阻色譜法）。由于結構不同的高分子雜質通常具有相似的生物學特性（過敏性），因此在藥品質量控制中一般只需控制藥品中高分子雜質的總量而不必控制不同結構的雜質。因此，根據(jù)樣品分子量差異進行分離的凝膠色譜法則具有明顯的優(yōu)勢。凝膠色譜法（分子排阻色譜法）是根據(jù)分子大小進行分離的一種液相色譜技術。藥物分子進入凝膠孔徑內部，而高分子雜質則被排阻在外，在色譜過程中不被保留，最早被洗脫出來，保留時間

7、較短，而藥物被保留，保留時間較長。凝膠色譜法是按分子大小依次被洗脫。根據(jù)B-內酰胺類抗生素和其高分子雜質的分子量，比較了數(shù)種凝膠介質，最后選用SephadexG-10作為B-內酰胺類抗生素高分子雜質分離色譜系統(tǒng)的凝膠介質，SephadexG-10排阻分子量在1000道爾頓左右。凝膠色譜方法驗證的內容主要有：系統(tǒng)適用性試驗（理論塔板數(shù)和拖尾因子）、分離度、對照溶液的線性、對照溶液的精密度（RSD）、最低檢測限與定量限、F值的重現(xiàn)性、聚合物測定結果的重現(xiàn)性等。B-內酰胺類抗生素的高分子雜質具有高度的不均一性和不確定性，故無法制備對照品,不能采用對照品法定量。中國藥品生物制品檢定所金少鴻教授等，根據(jù)B-內酰胺類抗生素在不同離子強度的介質中具有不同表現(xiàn)狀態(tài)的性質，首次建立了凝膠色譜自身對照外標法定量測定B-內酰胺類抗生素中的聚合物。此方法已經(jīng)載入中國藥典2000年版和2005年版，用于國產(chǎn)B-內酰胺類抗生素的質量控制，并已被國內外B-內酰胺類抗生素生產(chǎn)廠家廣泛使用。實驗證明，在以水，0.01%SDS或0.5%葡萄糖溶液作為流動相時，B-內酰胺類抗生素可締合形成表觀分子量較大的締合物，該締合物在SephadexG10凝膠色譜系統(tǒng)中的色譜行為與高分子雜質一樣，表現(xiàn)為單一