探究性實驗實施

1、探究性實驗實施探究性實驗課程的目的是為了能充分調動學生的學習主動性、積極性和創(chuàng)造性，并把所學得的基礎醫(yī)學知識綜合地應用于課題的立項、設計、實施、結果分析和論文撰寫。 探究性實驗根據(jù)其實驗自行設計程度和時間跨度可分為平臺性擴展設計實驗和自行設計實驗二類。第一節(jié) 自行設計性實驗自行設計性實驗是指在教師的指導下，學生通過在一段時間內(nèi)對文獻進行復習與查閱，尋找同學感興趣的研究內(nèi)容，自行設計性實驗方案，完成實驗操作、觀察和分析實驗結果、實驗課題匯報等全過程。自行設計性實驗持續(xù)時間較長，約二個學期。在自行設計性實驗過程中，學生可以充分地利用實驗室或教研室提供的電生理學、血流動力學、呼吸力學、細胞生物學和分

2、子生物學等儀器設備。同時，進一步培養(yǎng)了學生的開拓與創(chuàng)新精神，養(yǎng)成良好的科學精神和嚴謹務實的科學作風。一、文獻查閱、綜述寫作（一）文獻查閱（1）以實驗小組為單位，根據(jù)已學的基礎知識和近期將要學習的知識，利用圖書館專業(yè)期刊及 Internet網(wǎng)查閱相關的文獻資料，提出各自感興趣的研究方向和內(nèi)容。（2）在教師的指導下，經(jīng)過小組集體醞釀、討論，凝練一個共同的研究目標與內(nèi)容。（二）綜述寫作（1）圍繞一個共同的研究目標與內(nèi)容，通過小組內(nèi)成員的答辯與討論產(chǎn)生綜述寫作的主筆同學，并合理分配每個同學在查閱文獻與綜述寫作中的任務。（2）通過文獻查閱，了解本研究內(nèi)容的國內(nèi)外現(xiàn)狀，寫出實驗課題的背景綜述或文獻綜述（包

3、括涉及研究所需的材料、設計與實驗方法）。（3）在文獻查閱過程中，每個小組需定期進行文獻閱讀匯報會（23次），加深對課題的研究方向的理解和把握，增強自主學習和終生學習的能力。（4）在完成背景綜述或文獻綜述基礎上，確定研究方向中的某個論點或熱點，由12個同學主筆完成發(fā)表綜述的寫作。（5）發(fā)表綜述應嚴格按照刊物的要求進行撰寫，力爭公開發(fā)表。二、立題與課題標書（一）立題（1）經(jīng)過小組集體醞釀、討論，確立一個既有科學性又有一定創(chuàng)新的課題。（2）指導老師對課題的目的性、科學性、先進性、創(chuàng)新性和可行性進行初審，必要時可通過預實驗進行實驗方案論證。（二）課題標書（1）明確課題研究的目的、意義和研究內(nèi)容，了解國

4、內(nèi)外研究現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢。（2）制定較為清晰的研究方法、技術路線、時間接點和可行性分析。（3）課題組長應組織小組成員在老師指導下，按照基礎醫(yī)學院大學生自然科學研究基金項目的要求完成課題標書填寫任務。三、實驗方案設計（一）方案設計1方案設計原則在立題基礎上，依據(jù)文獻資料和預實驗結果認真地按照規(guī)定的格式寫出實驗操作的設計方案。設計方案的內(nèi)容應詳細并具可操作性。2具體格式要求：（1）題目，班級、設計者。（2）立題依據(jù)（研究的目的、意義，以及欲解決的問題和國內(nèi)外研究現(xiàn)狀）。（3）實驗動物或細胞的品系、規(guī)格和數(shù)量。（4）實驗器材與試劑：器材名稱、型號、規(guī)格和數(shù)量；藥品或試劑的名稱、規(guī)格、劑型和使用量

5、，包括特殊儀器與藥品需要。（5）實驗方法與操作步驟：包括實驗的技術路線、實驗的進程安排、每個研究項目的具體操作過程，以及設立的觀察指標和指標的檢測手段。（6）實驗日程安排與進度的控制節(jié)點。（7）觀察結果的記錄表格制作。（8）預期結果。（9）可能遇到的困難、問題及解決的措施。（二）實驗準備根據(jù)實驗的設計方案列出實驗所需的動物、細胞株、器械、藥品、試劑等預算清單，在實驗前兩周提交指導老師。對一些特殊藥品或試劑應列出供應商的公司名稱。四、開題報告1由基礎醫(yī)學院組織開題報告，邀請相關領導和專家參加評審。2課題小組應在組長領導下，選好主匯報人，做好多媒體匯報材料，同時小組每個成員都要積極做好準備，接受其

6、他同學、專家和領導的詢問。3開題報告后，應認真總結，發(fā)現(xiàn)問題和修正方案。五、預實驗、結果分析、正式實驗（一）預實驗（1）按照實驗設計方案和操作步驟，認真進行預實驗。（2）實驗過程中，做好各項實驗的原始記錄。（二）結果分析（1）應及時整理實驗結果，發(fā)現(xiàn)和分析預實驗中存在的問題和改進與調整的實驗方案。（2）對實驗出現(xiàn)與預期結果不同時應及時向指導老師進行匯報。（3）如果指導老師認為預實驗已基本達到目的和要求時，可不再進行正式實驗。（三）正式實驗操作（1）依據(jù)修改后的實驗設計方案和操作流程認真地進行正式實驗。（2）做好各項實驗的原始記錄，及時整理分析實驗數(shù)據(jù)。（3）對一些實驗試劑成本昂貴、實驗操作難度

7、較大，以及環(huán)境不允許的實驗可由教師親自完成。六、論文撰寫1在認真完成實驗數(shù)據(jù)的整理與分析后，按照醫(yī)學院校的學報格式進行論文撰寫。2實驗小組的每個成員按照自己對實驗數(shù)據(jù)的認識，以及對本課題研究意義的不同思考，可獨立完成一篇論文撰寫。實驗小組在討論后應共同完成一篇論文撰寫。3根據(jù)老師要求時間節(jié)點上交論文，力爭公開發(fā)表。七、課題匯報1在指導老師修改下，小組每個成員共同完成多媒體制作，做好論文答辯準備工作。2實驗小組通過協(xié)商產(chǎn)生一名同學作為主答辯人，其他同學共同參與，組成論文答辯隊。3在論文答辯過程中，應體現(xiàn)事實求實，尊重實驗結果和良好的科學態(tài)度，以及縝密的思維模式和優(yōu)秀的表達藝術。4由指導老師和專家

8、組成的答辯委員會及其他同學將對研究論文匯報結果進行提問。并由答辯委員會對整個研究課題的科學性、先進性、創(chuàng)新性，論文撰寫、匯報的表達能力進行綜合打分，給出最終成績。第二節(jié) 擴展性設計實驗多學科擴展性設計實驗是指由教師指定的實驗平臺條件下，完成從實驗設計、實驗操作到結果分析與論文撰寫全過程。實驗操作過程基本在一次實驗課內(nèi)完成，然后再安排一次以小組為團隊的結果匯報與討論。例如，以家兔失血性休克作為自主設計實驗平臺，學生可自主設計休克實驗方案，包括失血程度，搶救措施（藥物施加的方式），實驗觀察指標的設立。設計方案經(jīng)指導教師同意后，在實驗課完成實驗操作和結果分析等過程，并用多媒體匯報與討論實驗結果。一、

9、基于家兔為實驗對象的多學科整合性擴展設計（一）實驗目的以哺乳動物家兔為實驗對象，依托PowerLab實驗系統(tǒng)，多參數(shù)多器官系統(tǒng)實驗同時開展，進行多功能學科（正常生理、病理生理和藥理）的整合性實驗。在擴展實驗中同時采樣記錄動物的心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多系統(tǒng)參數(shù)，各系統(tǒng)參數(shù)的有機組合，輔以各種實驗手段和措施（如人為建立病理模型，病理模型的藥物治療等），可明確所設計課題中動物的正常生理過程，病理變化和藥物治療效果。（二）實驗原理疾病的發(fā)生必然伴隨著相應的生理過程的變化。PowerLab實驗系統(tǒng)使多參數(shù)同步記錄的可能得以實現(xiàn)。記錄此生理參數(shù)，可直觀地反映機體從正常生理情況轉變?yōu)椴±砩淼倪^程

10、，以及反映藥物對疾病的治療情況。（三）實驗條件1實驗動物家兔，體重 1.52.0 kg。2藥品與器材基礎實驗中用于家兔實驗的所有藥品和器械。（四）實驗基本過程根據(jù)設計實驗的步驟而變化（五）討論分析（1）對實驗目的、原理進行闡釋，實驗結果進行總結與歸納。（2）對實驗中出現(xiàn)的各種觀察指標變化進行分析，探討其變化的發(fā)生機制。（3）如實驗結果不理想，請分析其失敗的原因和提出改進的措施。（六）時間節(jié)點（1）完整、詳細的實驗設計方案必須在實驗課的前一周完成，設計方案不合格者將取消實驗資格。（2）實驗操作時間必須控制在1天以內(nèi)。（3）一周后以小組為單位用多媒體匯報實驗結果和討論分析。（七）附錄及注意事項1家

11、兔正常生理指標（見第二章） 2所需參數(shù)參見相應的基礎實驗。3儀器連接參見各相應參數(shù)記錄時的實驗。4實驗過程不得危害人體健康和污染環(huán)境。（王紅衛(wèi)）二、基于多因素對離體心臟功能影響的擴展性實驗（一）實驗目的離體心臟灌注是指將動物心臟取出胸腔，連接上一個特定的灌流裝置，用相應的緩沖液灌注其冠脈系統(tǒng)，使離體心臟在人工控制的條件下自主跳動或人工起搏下收縮與舒張。自主設計多因素對大鼠離體心臟功能影響的實驗，并觀察心臟在不同條件下的功能變化規(guī)律。（二）實驗原理離體心臟模型主要分為兩種：主動脈逆行灌注（Langendorff）模型和工作心臟模型(Working heart)。這種模型的主要優(yōu)點是不受神經(jīng)，體液

12、的調節(jié)，影響因素少，而且可控性強（如前負荷、后負荷、營養(yǎng)液成分、溫度等均可調節(jié)）。因此，離體心臟模型廣泛運用于醫(yī)學各領域生理，藥理、生化等基礎與臨床相關科室的研究領域。（三）實驗條件1實驗動物大白鼠，體重200300 g左右。2藥品與器材戊巴比妥鈉，Krebs-Henseleit緩沖液，主動脈插管，灌流槽，恒溫灌流裝置，微電極放大器，哺乳動物手術器械，臺氏液，PowerLab 8S主機，微操縱器，冷光源，含95% O2+5% CO2混和氣體。（四）實驗基本過程自主設計各種不同試劑或藥物觀察對心臟功能的影響。1主動脈逆行灌注（Langendorff，逆行灌注，retrograde perfusi

13、on）（1）取大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50mg/kg）麻醉，舌下靜脈注射1的肝素抗凝（0.5ml/kg）（腹腔注射亦可，5000 IU/kg），開胸迅速取出心臟置于4或室溫下的Krebs-Henseleit緩沖液。（2）心臟自主收縮與舒張可排出心腔內(nèi)大部分血液，立即用兩眼科鑷持主動脈，接上主動脈插管，此管道通過一調節(jié)拴連接入可以調節(jié)灌注壓的灌注管道。（3）心尖部掛一個金屬小鉤連接生物信號轉換儀，可以測量心率，心功能。整個灌注系統(tǒng)及心臟周圍用恒溫水浴循環(huán)器維持在37左右。（4）將一與PE管連接的水囊由左房插入左心室，PE管接壓力換能器至MPA生物信號記錄系統(tǒng)，調節(jié)水囊內(nèi)壓至510 mmHg（前負

14、荷），通過水囊可以測定左室發(fā)展壓（developed pressure）及dp/dt。（5）灌流液儲槽內(nèi)常用Krebs-Henseleit液（NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO4 1.2，MgSO2 1.2，CaCl2 2.9，NaHCO3 25，Glucose 11.1，EDTA 0.5 mmol），灌注液以95的O2 和5的CO2充分飽和，使氧分壓維持在500550mmHg，二氧化碳分壓維持在3642mmHg左右，pH值左右，灌注壓一般在90cmH2O。（6）心臟恢復自主心跳后平衡灌注15min，待心臟跳動平穩(wěn)后便可開始實驗。（7）在藥物實驗中，可以將藥物直接加入儲槽內(nèi)，或用微電

15、腦輸液泵從主動脈根部給藥。揮發(fā)性藥物（如揮發(fā)性麻醉藥）可以使灌注液在一定濃度下飽和該藥物，再行灌注。Langendorff灌注最大的優(yōu)點是簡單而且相對穩(wěn)定（只要灌注壓和灌注液恰當）。然而，它不完全符合生理，其本質是主動脈逆行灌注，心臟是空收縮，沒有起到泵的作用，而且沒有前負荷。將一水囊置于左心室，使心臟有了一些前負荷，另外通過水囊還可以測定左室發(fā)展壓（developed pressure）及dp/dt，但這種模型心臟做功較少，在測定心肌代謝方面還很困難。這是因為水囊大小是固定的，與心室內(nèi)壁結合不會太緊密，因此，與生理狀態(tài)下的前負荷相差較遠。2工作心臟模型（Working Heart，順行灌注，

16、antegrade perfusion）此模型的最大特點是左室有了可以調節(jié)的前負荷，這樣，心臟就能和在體模型一樣做功，而且在測量心臟能量代謝和心肌酶譜方面和在體模型接近。（1）動物及灌流液同Langendorff模型，與Langendorff模型不同的是，工作心臟模型是一種雙灌流裝置，它不僅有主動脈灌流系統(tǒng)而且還有左房灌流系統(tǒng)，主動脈流入道和流出道通過三通連接互相轉換，流出道的壓力（后負荷）可以通過管道內(nèi)液平面高度來調節(jié)。前負荷可以調節(jié)左房灌注系統(tǒng)儲槽的液面高度。（2）操作的前半部分同Langendorff模型，在實行完主動脈逆行灌注后行肺靜脈插管入左房連接左房灌流系統(tǒng)，結扎固定。（3）由心尖

17、部向左室插入一充滿營養(yǎng)液的PE管，連接換能器至生物信號轉換儀，可以測量左室內(nèi)壓變化及心率。（4）持續(xù)主動脈逆行灌流10min待心臟搏動平穩(wěn)后，關閉主動脈流入道，打開主動脈流出道，并開始心房灌流，預灌流1520min，待心跳平穩(wěn)后開始實驗。（五）觀察項目自行設計多因素影響離體心臟的觀察項目或心功能指標。（六）討論分析（1）對實驗目的、設計原理進行闡釋，實驗結果進行總結與歸納。（2）對實驗中出現(xiàn)的各種觀察指標變化進行分析，探討其變化的發(fā)生機制。（3）如實驗結果不理想，請分析其失敗的原因和提出改進的措施。（七）時間節(jié)點（1）完整、詳細的實驗設計方案必須在實驗課的前一周完成，設計方案不合格者將取消實驗

18、資格。（2）實驗操作時間必須控制在1天以內(nèi)。（3）一周后以小組為單位用多媒體匯報實驗結果和討論分析。（八）注意事項（1）主動脈懸掛結扎的位置不能太深，以免阻塞冠狀動脈入口或損傷主動脈瓣造成關閉不全。（2）在整個實驗過程中要注意保持心臟周圍溫度37左右，上下波動不超過0.5（3）灌流液事先要用氧氣充分飽和，一般為2030min。（4）灌流液經(jīng)心臟冠脈循環(huán)后由冠狀靜脈竇流入右心房及右心室，最后從肺動脈流出，因此，在操作中如果結扎了肺動脈，會出現(xiàn)右室迅速彭出的情況或將。 （陳紅）三、大鼠離體主動脈血管功能的擴展性實驗（一）實驗目的通過離體主動脈血管張力變化記錄觀察血管的收縮功能與舒張功能。如果采用動

19、物疾病模型，如遺傳性高血壓動物可以觀察到血管內(nèi)皮或平滑肌功能損傷。（二）實驗條件1實驗動物大白鼠。2藥品與器材戊巴比妥鈉，Krebs-Henseleit緩沖液，克氏液，離體血管灌流槽，恒溫灌流裝置，微電極放大器，培養(yǎng)皿，哺乳動物手術器械， PowerLab 8S主機，微操縱器，冷光源，含95% O2+5% CO2混和氣體等。（三）實驗基本過程1血管環(huán)制備（1）大鼠麻醉后開胸剪除心臟，將肺組織向前翻開剪除，用有齒鑷夾住主動脈上端并輕輕提起，在主動脈后方延胸壁向下剪開結締組織，分離主動脈，剪除有齒鑷夾持而損傷的部位。（2）將主動脈放入含有Krebs-Henseleit緩沖液的平皿，Krebs-He

20、nseleit緩沖液成份（mmol/L）：NaCl 118.0，KCl 4.7，CaCl2 2.5，MgSO4 1.2，KH2PO4 1.2，NaHCO3 25.0，glucose 11.0，Na2-EDTA 0.5。（3）仔細分離剪除血管外脂肪組織與疏松血管外膜，然后將血管剪成23 mm長的血管環(huán)。（4）用一不銹鋼掛鉤將血管環(huán)挑起并懸掛于張力換能器上，調整掛鉤血管環(huán)與另一固定掛鉤的距離，然后將血管環(huán)穿入另一掛鉤，調整血管環(huán)在兩掛鉤間的相對位置，掛鉤位置固定后緩慢施加前負荷（靜息張力）至2 g（扣除掛鉤重量）。（5）將掛鉤連同血管環(huán)浸入含有預平衡緩沖液（37）的血管槽，緩沖液持續(xù)通以95氧氣5

21、二氧化碳，使每一血管環(huán)在血管槽內(nèi)的位置相對一致，平衡4060min，期間每1015min更換液體一次，待血管張力穩(wěn)定后可開始實驗。2血管收縮舒張功能檢測（1）以60 mmol/L 氯化鉀使血管環(huán)平滑肌去極化,反復重復此過程2次使血管環(huán)收縮達坪值；沖洗。（2）重新平衡血管環(huán)，再用1mmol/L苯腎上腺素預收縮血管, 待張力上升并穩(wěn)定（通常1mmol/L苯腎上腺素加入后1015min達平臺）后, 加入1mmol/L乙酰膽堿舒張血管,以檢測血管內(nèi)皮的完整性（或稱內(nèi)皮依賴性血管舒張反應）。（3）最大舒張反應大于80 %的血管環(huán)可被認為內(nèi)皮完整,并用于內(nèi)皮依賴性血管實驗。（4）去血管內(nèi)膜的主動脈血管環(huán)制

22、備：以直徑與血管環(huán)相似的細綿簽穿入血管腔內(nèi)，在濕紗布上輕輕來回摩擦血管內(nèi)腔35次，或以PE10或PE50管穿入血管腔內(nèi)，將血管在濕紗布上輕輕滾動摩擦以去除血管內(nèi)膜。用苯腎上腺素預收縮血管后在用乙酰膽堿檢驗血管舒張反應，如血管對乙酰膽堿無舒張反應或呈收縮反應，說明血管去除完全。（四）觀察項目自行設計與確定影響主動脈血管的實驗條件、觀察項目，記錄實驗結果。（五）討論分析1對實驗目的、設計原理進行闡釋，實驗結果進行總結與歸納。2對實驗中不同藥物使用后的各種觀察指標變化進行分析，探討其變化的發(fā)生機制。3如實驗結果不理想，請分析其失敗的原因和提出改進的措施。（六）時間節(jié)點1完整、詳細的實驗設計方案必須在

23、實驗課的前一周完成。2實驗操作時間控制在1天以內(nèi)。3一周后以小組為單位用多媒體匯報實驗結果和討論分析。（七）附錄及注意事項1血管收縮與舒張工具藥及其使用濃度：（1）緩沖溶液的配制1）Krebs-Henseleit緩沖溶液的配制：Krebs-Henseleit溶液為離體血管及離體心臟實驗常用的一種緩沖溶液，按下述固定比例配制后pH值為7.4，具體配制試劑及用量（見表7-1）。表7-1Krebs-Henseleits Solution for Isolated Vessel PerfusionSalt Molecular weightmmol/lg/lg/2lg/5l1NaCl58.441186.

24、9013.834.52KCl74.554.70.350.71.753MgSO4 anhydrous120.361.20.140.280.74NaHCO384.01252.104.210.55KH2PO4136.091.20.160.320.826Glucose.H2O198.17112.184.3610.97CaCl2 anhydrous110.992.50.280.561.48EDTA-Na2372.240.50.190.380.952）高鉀收縮溶液的配制：以氯化鉀替代原KrebHenseleit中的部分氯化鉀，制成等滲透壓的緩沖溶液，用于刺激血管收縮，具體（見表7-2）。表7-2 高鉀60

25、mM收縮液Salt Molecular weightmmol/lg/lg/500ml1NaCl58.4462.63.661.832KCl74.55604.472.2353MgSO4 anhydrous120.361.20.140.074NaHCO384.01252.101.055KH2PO4136.091.20.160.086Glucose.H2O198.17112.181.097CaCl2 anhydrous110.992.50.280.148EDTA-Na2372.240.50.190.095 （陳紅）四、家兔失血性休克的擴展性實驗（一）實驗目的本實驗的目的是為了能充分調動同學的學習主動性

26、、積極性和創(chuàng)造性，尤其將所學到的生理學、藥理學、病理生理學知識應用于實驗的自行設計。以失血性休克為動物實驗平臺，在一定的實驗條件和范圍內(nèi)，完成從實驗設計到親自動手操作全過程。在實驗過程中，通過自主設計不同類型、不同程度、不同治療措施的實驗，觀察動物的各種功能與代謝變化，分析和掌握其發(fā)生的主要原因和機制，使同學能較好地把理論課學到的基礎知識與動物實驗實踐相結合，達到強化與提高發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的能力，以及初步掌握一些簡單的、基本的實驗操作技能。（二）實驗原理失血可使有效循環(huán)血量減少。失血途徑和程度不同，對機體影響也不同，少量失血可通過機體的一系列抗損傷措施，使血壓不出現(xiàn)明顯的降低；當快速失血量過

27、多、過快時，可超出機體的抗損傷能力，導致休克發(fā)生。但積極藥物治療措施可有效地改善血液動力學變化和增強機體的抗休克能力。（三）實驗條件自行設計不同類型失血性休克的病理模型，完成失血性休克的造病、治療和死亡的全過程，并觀察休克和抗休克時動物的血液動力學變化特點和機體的功能、代謝變化，分析和掌握休克發(fā)生和抗休克治療的主要機制，以及對機體的影響。1實驗動物家兔，體重 1.52.0 kg。2實驗藥品與器材25烏拉坦溶液，葡萄糖溶液，生理鹽水，腎上腺素，0.7%肝素。兔手術臺，電子稱，天平，i-STAT血氣分析儀，微循環(huán)生物信號處理系統(tǒng)，手術器械，動脈插管，氣管插管，靜脈插管，注射器。（四）實驗基本過程1

28、按照實驗要求，以及提供的動物、實驗器材與藥品，自主設計不同類型的失血性休克的病理模型（包括實驗原理和觀察指標的確立）。（1）立題：以實驗小組為單位，根據(jù)以往學的知識和預習“休克”和相關藥理章節(jié)的內(nèi)容，或查閱有關文獻資料，由小組集體醞釀、討論確立失血性休克實驗方案（包括觀察指標和抗休克措施）。但是，一定要注意動物實驗立題的科學性、目的性和在現(xiàn)有的條件下所具有的可操作性。同時，也提倡實驗思路的新穎和獨特性。（2）方案設計的格式與內(nèi)容：每實驗小組在立題基礎上，寫出動物實驗的設計方案。實驗設計方案的內(nèi)容應詳細和具可操作性，具體的內(nèi)容和格式要求如下：題目；立題依據(jù)（實驗的目的、原理）；實驗動物品種與數(shù)量

29、；實驗器材（型號、規(guī)格和數(shù)量）與藥品（規(guī)格、劑型和使用量），包括特殊儀器與藥品需要（器材型號、規(guī)格和數(shù)量與藥品規(guī)格、劑型和使用劑量）；實驗內(nèi)容（方法和操作步驟），以及觀察指標；實驗觀察結果記錄表格制作；預期結果；注明參閱文獻資料。2失血性休克的動物模型復制（見 頁）3并按實驗的自行設計方案完成動物實驗操作步驟和指標觀察。（五）討論分析1對實驗目的、原理進行闡釋，實驗結果進行總結與歸納。2對實驗中出現(xiàn)的各種觀察指標變化進行分析，探討其變化的發(fā)生機制。3如實驗結果不理想，請分析其失敗的原因和提出改進的措施。（六）時間節(jié)點1完整、詳細的實驗設計方案必須在實驗課的前一周完成，設計方案不合格者將取消實驗

30、資格。2實驗操作時間必須控制在1天以內(nèi)。3一周后以小組為單位用多媒體匯報實驗結果和討論分析。（六）附錄及注意事項1家兔正常生理指標（見第二章）2實驗過程不得危害人體健康和污染環(huán)境。五、基于家兔缺血-再灌注損傷的擴展性實驗（一）實驗目的通過關閉某組織器官的動脈血管造成缺血狀態(tài)，并維持一段時間后，再開放其動脈血管，恢復組織器官的動脈血供應，造成缺血-再灌注損傷的病理過程。采取積極藥物或干預措施可有效地改善組織細胞的功能與代謝狀態(tài)和增強機體的抗損傷能力。（二）實驗原理隨著臨床溶栓療法、動脈搭橋術、斷肢再植、器官移植、心臟手術等方法的不斷推廣應用，人們發(fā)現(xiàn)在一定條件下恢復組織器官的血液再灌注后，有部分

31、患者器官功能代謝障礙及結構破壞不但未減輕反而加重，出現(xiàn)了缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury）。目前認為，缺血-再灌注損傷發(fā)生的始動環(huán)節(jié)是缺血、缺氧導致能量代謝障礙，主要機制是自由基大量產(chǎn)生、細胞內(nèi)鈣超載，以及中性粒細胞活化、無復流現(xiàn)象和高能磷酸化合物生成障礙等。因此，干預和治療缺血-再灌注損傷的發(fā)生是近十多年來研究的熱點之一。（三）實驗條件以家兔缺血-再灌注損傷為自行設計性動物實驗平臺，在一定的實驗條件和范圍內(nèi)，自行設計不同類型組織臟器的缺血-再灌注損傷模型，同時采用不同治療措施的實驗方案。1實驗動物家兔，體重 1.52.0 kg。2藥品與器材25烏拉坦溶

32、液，葡萄糖溶液，生理鹽水，腎上腺素，0.7%肝素，3%戊二醛，TNF-檢測試劑盒，IL-6檢測試劑盒等。兔手術臺，電子稱，天平，生物信號處理系統(tǒng)，動物呼吸機，顯微鏡，酶標儀、低溫離心機、電動勻漿機、手術器械，動脈夾，動脈插管，氣管插管，注射器。（四）實驗基本過程1按照實驗要求，以及提供的動物、實驗器材與藥品，自主設計不同類型缺血-再灌注損傷的病理模型（含原理和觀察指標確立）。（1）立題：以實驗小組為單位，根據(jù)以往學的知識和預習相關章節(jié)的內(nèi)容，或查閱有關文獻資料，開展集體醞釀、討論確立缺血-再灌注損傷實驗方案（包括觀察指標和抗再灌注損傷措施）。但是，一定要注意動物實驗立題的科學性、現(xiàn)實性和可操作

33、性，以及實驗思路的新穎和獨特性。（2）方案設計的格式與內(nèi)容：每實驗小組在缺血-再灌注損傷實驗平臺的基礎上，依據(jù)實驗目的編制出動物實驗的設計方案。實驗設計方案的內(nèi)容應詳細和具可操作性，具體的內(nèi)容和格式要求如下：題目；立題依據(jù)（實驗的目的、原理）；實驗動物品種與數(shù)量；實驗器材（型號、規(guī)格和數(shù)量）與藥品（規(guī)格、劑型和使用量），包括特殊儀器與藥品需要（器材型號、規(guī)格和數(shù)量與藥品規(guī)格、劑型和使用劑量）；實驗內(nèi)容（方法和操作步驟），以及觀察指標；實驗觀察結果記錄表格制作；預期結果；注明參閱文獻資料。2缺血-再灌注的動物模型復制（1）心臟缺血-再灌注模型制備：1）動物分組與處理：將家兔分成A、B動物，A為缺

34、血-再灌注的對照動物，B為去甲腎上腺素預處理動物。2）用20%烏拉坦（5ml/kg）靜脈麻醉，固定于兔臺。頸部去毛，手術分離氣管和右頸總動脈，并進行氣管插管和動脈插管。氣管插管與呼吸機連接（潮氣量50ml，吸呼比2: 1, 呼吸頻率40次/min）；動脈插管與血壓換能器連接；四肢連接心電圖導聯(lián)，記錄心電圖。3）剪去胸壁左側被毛，沿胸骨左緣24肋剪斷肋軟骨，打開胸腔。開胸后立即行正壓呼吸。4）用眼科剪剪開心包，暴露心臟，用止血鉗輕輕提起左心耳，于冠狀動脈左支起始部約2mm處用縫合針繞其穿一無創(chuàng)縫合線，穩(wěn)定15min。然后予A動物靜脈注射生理鹽水0.1ml/kg，B動物靜脈注射去甲腎上腺素0.1ml/kg，各持續(xù)3min。待心率基本穩(wěn)定后，墊線結扎冠脈左支，20min后松開結扎線，再灌注30min。復制模型的可靠性用連續(xù)監(jiān)測之ECG導聯(lián)的變化來判斷，以ST段抬高為心肌缺血存在，以深大Q波出現(xiàn)確定心肌壞死形成。（見圖7-2、7-3）圖7-2 缺血-再灌注損傷ECG導聯(lián)圖7-1 正常ECG導聯(lián)（2）肝缺血-再灌注模型制備：1）家兔術前禁食12h。2）