精制蟒蛇油抗炎抗過敏止癢作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、·119·新中醫(yī)2010年12月第42卷第12期JOURNAL OF NEW CHINESE MEDICINEDecember2010Vol 42No 12收稿日期20100822作者簡介黃國鑫(1985 ，男，碩士研究生，研究方向：中藥新藥研究與開發(fā)。通訊作者蘇子仁(1964 ，男，研究員，研究方向：中藥新藥研究與開發(fā)。精制蟒蛇油抗炎抗過敏止癢作用的實(shí)驗(yàn)研究黃國鑫，任薇，武文，蘇冀彥，賴正權(quán)，易宇陽，蘇子仁廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心，廣東廣州510006摘要目的：研究蟒蛇油抗炎、抗過敏、止癢的作用。方法：用二甲苯致小鼠耳腫脹法和組胺致小鼠皮膚毛細(xì)血管擴(kuò)張法觀察其抗炎作

2、用；用2，4二硝基氯苯(DNCB 誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)(DTH 觀察其抗過敏作用；用4氨基吡啶(4AP 誘導(dǎo)小鼠皮膚過敏性瘙癢觀察其止癢作用。結(jié)果：蟒蛇油能顯著對抗二甲苯所致小鼠耳腫脹和抑制組胺所致小鼠皮膚毛細(xì)血管擴(kuò)張，同時(shí)降低DNCB 誘導(dǎo)的小鼠過敏反應(yīng)，并且能明顯減少4AP 誘導(dǎo)的瘙癢反應(yīng)的舔體次數(shù)。結(jié)論：蟒蛇油有顯著的抗炎、抗過敏、止癢作用。關(guān)鍵詞蟒蛇油；抗炎；抗過敏；止癢；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；小鼠中圖分類號(hào)R2855文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)02567415(2010 12011903蟒蛇油為蟒科動(dòng)物蟒蛇的脂肪經(jīng)煉制提取而成。本草綱目拾遺里又叫蟒油，調(diào)疾飲食辨里稱蚺蛇油。蟒蛇油味甘，性平。祛風(fēng)，解毒

3、，清熱潤膚。主治風(fēng)毒癩疾，漏瘡，凍瘡，燙火傷，皮膚皸裂。蛇油的應(yīng)用在我國歷史悠久，中醫(yī)常用它治療凍瘡、皸裂、濕疹、燙傷等皮膚疾患。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道蛇油具有抗炎、止痛、加速皮膚的新陳代謝、增強(qiáng)細(xì)胞活力等功能1。因此，本研究從抗炎、抗過敏、止癢等幾個(gè)方面對蟒蛇油進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)研究。1材料與方法11材料111動(dòng)物昆明小鼠，體重(20 2 g ，SPF 級(jí)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。112藥品精制蟒蛇油，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心提供；復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(皮炎平 由三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：0911251s ；二甲苯由廣東光華化學(xué)廠有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20090721；組胺由國藥集

4、團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：F20090423；2，4二硝基氯苯(DNCB 由天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)，批號(hào)：20070713；4氨基吡啶(4AP 由sigma 公司生產(chǎn)；生理鹽水由佛山雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：0909204D 。12方法121抗炎實(shí)驗(yàn)健康昆明種小鼠72只，雌雄各半，體重18 22g ，隨機(jī)分為精制蟒蛇油高劑量組(10mL /kg 、精制蟒蛇油中劑量組(5mL /kg 、精制蟒蛇油低劑量組(25mL /kg 、模型對照組、正常對照組、復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(皮炎平 陽性對照組(05g /kg ，每組12只。高、中、低劑量組、陽性組和模型組小鼠分別在右耳前后兩面涂二甲

5、苯致炎(002mL /只 ，正常對照組在右耳前后兩面涂相同劑量蒸餾水，致炎05、1、2小時(shí)后分別用相應(yīng)劑量的藥物在右耳涂藥，正常對照組和模型對照組同時(shí)涂蒸餾水(5mL /kg 。4小時(shí)后將小鼠頸椎脫臼處死，剪下雙耳，用8mm 打孔器分別在左右耳相同部位打下圓耳片，在分析天平稱重，以兩耳片重量差為炎癥腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率。抑制率%=(對照組給藥組 /對照組 100%。122組胺致小鼠皮膚血管滲透性實(shí)驗(yàn)健康昆明種小鼠72只，雌雄各半，體重18 22g ，隨機(jī)分為精制蟒蛇油高劑量組(10mL /kg 、精制蟒蛇油中劑量組(5mL /kg 、精制蟒蛇油低劑量組(25mL /kg 、模型對照組、正常對

6、照組、復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(皮炎平 陽性對照組(05g /kg ，每組12只。用8%硫化鈉酒精溶液法2背部脫毛(2cm 3cm ，將受試藥涂布于背部脫毛區(qū)，連續(xù)給藥7天，模型對照組和正常對照組同時(shí)涂布相同劑量蒸餾水。末次涂藥1小時(shí)后于背部脫毛區(qū)皮下注射01%組胺(生理鹽水配制 005mL /只，同時(shí)靜脈注射05%伊文思蘭生理鹽水10mL /kg ，正常對照組注射相同劑量生理鹽水。30分鐘后處死動(dòng)物，剪下藍(lán)斑皮膚，剪碎后用(1 1 丙酮生理鹽水8mL 浸泡24小時(shí)，離心取上清液，在610nm 測定光密度，從而確定染料滲出量。通過對局部炎癥部位滲出液中伊文思藍(lán)的含量來判斷藥物對組胺所致的皮膚血管滲

7、透性的變化程度。123抗過敏實(shí)驗(yàn)健康昆明種小鼠72只，雌雄各半，體重18 22g ，隨機(jī)分為精制蟒蛇油高劑量組(10mL /kg 、精制蟒蛇油中劑量組(5mL /kg 、精制蟒蛇油低劑量組(25mL /kg 、·120·新中醫(yī)2010年12月第42卷第12期JOURNAL OF NEW CHINESE MEDICINEDecember2010Vol 42No 12模型對照組、正常對照組、復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(皮炎平 陽性對照組(05g /kg ，每組12只。用8%硫化鈉酒精溶液法背部、腹部脫毛(2cm 3cm ，24小時(shí)后用5%DNCB (005mL /只 涂布于小鼠脫毛后

8、的腹部皮膚致敏，次日強(qiáng)化1次，正常對照組涂布相同劑量蒸餾水。致敏前1天開始皮膚涂布給藥，每天1次，連續(xù)給藥7天，模型對照組和正常對照組涂布蒸餾水(5mL /kg 。末次給藥40分鐘后，用1%DNCB 丙酮液(002mL /只 涂右耳激發(fā)過敏反應(yīng)，正常對照組涂布相同劑量蒸餾水，24小時(shí)后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下雙耳，用8mm 打孔器分別在左右耳相同部位打下圓耳片，在分析天平稱重，以兩耳片重量差為腫脹度，作為遲發(fā)性超敏反應(yīng)(DTH 強(qiáng)度指標(biāo)。剖取胸腺、脾臟稱重，計(jì)算胸腺、脾臟的腫脹指數(shù)。124止癢實(shí)驗(yàn)4 5健康昆明種小鼠72只，雌雄各半，體重18 22g 。隨機(jī)分為精制蟒蛇油高劑量租(10mL /

9、kg 、精制蟒蛇油中劑量租(5mL /kg 、精制蟒蛇油低劑量組(25mL /kg 、模型對照組、正常對照組、復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(皮炎平 陽性對照組(05g /kg ，每組12只。用8%硫化鈉酒精溶液脫毛法背部脫毛(2cm 3cm ，將受試藥涂布于脫毛區(qū)皮膚上，每天1次，連續(xù)給藥7天，模型對照組和正常對照組涂布蒸餾水(5mL /kg 。末次給藥40分鐘后頸背部皮下注射4AP (生理鹽水配成002% 溶液001mL /g ，正常對照組注射生理鹽水。記錄各組在10分鐘內(nèi)的舔體次數(shù)(以連續(xù)舔體至出現(xiàn)短暫停頓，作舔體1次計(jì)算 。13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS130統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，所得數(shù)據(jù)用( s

10、表示，組間差異用t 檢驗(yàn)分析；多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA ，當(dāng)總體方差齊時(shí)選擇LSD 法分析；當(dāng)方差不齊時(shí)選擇Dunnet C 法分析。2結(jié)果21蟒蛇油對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響見表1。造模后模型對照組耳腫脹度增大，與正常對照組比較，差異有非常顯著性意義(P 001 ，說明造模成功。各給藥組小鼠耳腫脹度與模型對照組比較，差異均有非常顯著性意義(P 001 ；且與正常對照組比較，差異均無顯著性意義(P 005 ，說明蟒蛇油對二甲苯所致小鼠的耳廓腫脹有顯著的抑制作用，并能使其恢復(fù)到正常水平。各給藥組與陽性對照組比較，差異均無顯著性意義(P 005 ，提示蟒蛇

11、油抗炎效果與陽性藥效果相當(dāng)。22蟒蛇油對組胺致小鼠皮膚血管擴(kuò)張的影響見表2。造模后模型對照組與正常對照組比較，差異有非常顯著性意義(P 001 ，說明造模成功；高劑量組與模型對照組比較，差異有非常顯著性意義(P 001 ；中劑量組與模型對照組比較，差異有顯著性意義(P 005 ；且與正常對照組比較，差異無顯著性意義(P 005 ，說明蟒蛇油高、中劑量能夠?qū)菇M胺所致小鼠皮膚血管擴(kuò)張，使其恢復(fù)到正常水平；高、中劑量組與陽性對照組比較，差異均無顯著性意義(P 005 ，提示蟒蛇油抑制皮膚血管通透性的效果與陽性藥效果相當(dāng)。表1蟒蛇油對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響( s 與正常對照組比較，P 001；與

12、模型對照組比較，P 001表2蟒蛇油對組胺致小鼠皮膚血管擴(kuò)張的影響( s 與模型對照組比較，P 005，P 00123蟒蛇油對DNCB 誘導(dǎo)的小鼠DTH 的影響見表3。模型對照組與正常對照組比較，差異有顯著性或非常顯著性意義(P 005，P 001 ，說明造模成功；蟒蛇油高劑量組、中劑量組與模型對照組比較，差異有顯著性或非常顯著性意義(P 005，P 001 ，且與正常對照組比較，差異均無顯著性意義(P 005 ，說明蟒蛇油對DNCB 所致小鼠皮膚DTH 引起的耳廓腫脹有顯著的對抗作用，能使其恢復(fù)到正常水平。給藥組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與正常對照組比較，差異均無顯著性意義(P 005 ，說明蟒蛇

13、油對機(jī)體免疫系統(tǒng)無不良影響。表3蟒蛇油對DNCB 誘導(dǎo)的小鼠DTH 的影響( s 與模型對照組比較，P 005，P 00124蟒蛇油對4AP 誘導(dǎo)的小鼠過敏性皮膚瘙癢反應(yīng)的影響見表4。模型對照組與正常對照組比較，差異有非常顯著組別正常對照組模型對照組陽性對照組高劑量組中劑量組低劑量組n121212121212給藥劑量(mL /kg 05g /kg 10mL /kg 5mL /kg 25mL /kg耳腫脹度(mg 110 012277 021077 080081 022088 064093 036抑制率(%72716866組別正常對照組模型對照組陽性對照組高劑量組中劑量組低劑量組n 121212

14、121212給藥劑量(mL /kg 05g /kg 10mL /kg 5mL /kg25mL /kg610nm0035 00180062 00180038 00220041 00180046 00220054 0007組別正常對照組模型對照組陽性對照組高劑量組中劑量組低劑量組n 121212121212給藥劑量(mL /kg 05g /kg10mL /kg5mL /kg25mL /kg耳腫脹度(mg 061 016138 093059 011066 009091 014110 021胸腺指數(shù)(mg /10g 2130 9023449 9551032 1932089 8312018 742208

15、3 1291脾臟指數(shù)(mg /10g3590 7564400 5521152 2623796 10083250 7513165 761·121·新中醫(yī)2010年12月第42卷第12期JOURNAL OF NEW CHINESE MEDICINEDecember2010Vol 42No 12性意義(P 001 ，提示皮膚瘙癢模型造模成功；蟒蛇油高、中、低劑量組均能明顯減少4AP 誘導(dǎo)的皮膚瘙癢模型的舔體反應(yīng)次數(shù)，與模型對照組比較，差異均有非常顯著性意義(P 001 ，說明蟒蛇油具有抑制小鼠過敏性皮膚瘙癢的作用。表4蟒蛇油對4AP 誘導(dǎo)的小鼠過敏性皮膚瘙癢反應(yīng)的影響( s 與模

16、型對照組比較，P 0013討論二甲苯所致小鼠耳廓腫脹是常規(guī)的急性炎癥模型，采用二甲苯刺激小鼠耳廓可在短時(shí)間內(nèi)引起小鼠耳廓充血、水腫等急性炎癥表現(xiàn)，此法簡單易行，不需特殊的設(shè)備，且具有見效快、用藥量少的特點(diǎn)，常用于篩選、評價(jià)抗炎藥物，故選用此法來研究蟒蛇油的抗炎作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蟒蛇油具有顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹程度的作用。蟒蛇油抗炎機(jī)理可能在于其能通過阻止生物活性物質(zhì)作用于效應(yīng)器官以及阻礙或解除效應(yīng)器官應(yīng)答來減輕或消除炎性反應(yīng)。炎癥是機(jī)體受各種致炎刺激物損害后機(jī)體對被損害組織的一種防御和修復(fù)反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)介質(zhì)組胺是致炎劑，組胺可引起血管擴(kuò)張、毛細(xì)血管通透性增加、局限性水腫。其作

17、用機(jī)制為組胺激動(dòng)H 1受體，通過G 蛋白激活與H 1受體相耦聯(lián)的磷脂酶C ，后者使膜磷脂分解為三磷酸肌醇(IP 3 和二?；视?DG 。IP 3引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子(Ca 2+ 快速釋放，而Ca 2+又激活靶細(xì)胞內(nèi)的磷脂酶A 2(PLA 2 ，PLA 2促進(jìn)前列環(huán)素(PGI 2 和血管內(nèi)皮細(xì)胞依賴因子(EDRF 的釋放，引起毛細(xì)血管通透性增加。蟒蛇油抗炎的機(jī)理可能為其能夠阻斷H 1受體或者有對抗組胺的效應(yīng)，從而降低毛細(xì)血管通透性，減少炎性滲出，從而減輕或消除過敏癥狀。遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH 是由T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的一種超敏反應(yīng)。在致敏機(jī)體接觸致敏源后約24小時(shí)以上才出現(xiàn)病變，其組織損傷機(jī)制是T 細(xì)

18、胞與抗原結(jié)合而活化，釋放出多種淋巴因子，導(dǎo)致反應(yīng)局部組織發(fā)生以單個(gè)核細(xì)胞浸潤和細(xì)胞變性壞死為特征的局部變態(tài)的炎癥反應(yīng)。DTH 小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)可以從不同側(cè)面反映機(jī)體免疫功能6。蟒蛇油的抗過敏作用機(jī)理可能與影響炎癥小鼠的一些細(xì)胞因子有關(guān)。4氨基吡啶(4AP 是一種鉀通道阻滯劑，近年來發(fā)現(xiàn)4AP 能誘導(dǎo)小鼠舔體反應(yīng)與促進(jìn)肥大細(xì)胞(Mast cell ，MC 釋放組織胺3，且小鼠舔體反應(yīng)與皮膚MC 釋放組織胺有關(guān)4 5。它能阻斷神經(jīng)細(xì)胞突觸前膜的K +通道，導(dǎo)致Ca 2+通道開放，使有更多的Ca 2+進(jìn)入突觸前膜，從而促進(jìn)遞質(zhì)(比如組胺 的釋放5，引起舔體反應(yīng)。癢是皮膚過敏反應(yīng)時(shí)的一個(gè)癥狀，也與局部MC 釋放組織胺有關(guān)7。由于4AP 誘發(fā)的小鼠舔體反應(yīng)發(fā)生率高達(dá)100%，方法簡便，指示明確，且多種不同作用機(jī)理的抗過敏藥與止癢藥對它均有抑制作用。因此，以4AP 誘發(fā)的小鼠舔體反應(yīng)可作為評價(jià)藥物抗過敏與止癢的理想模型之一。蟒蛇油抑制4AP 所致小鼠過敏性皮膚瘙癢反應(yīng)的機(jī)理可能在于其能夠阻滯MC 的Ca 2+通道，減少Ca 2+內(nèi)流從而抑制MC 釋放組胺。本研究證實(shí)了蟒蛇油皮膚涂布給藥能顯著對抗二甲苯所致小鼠耳廓腫脹和組胺所致小鼠皮膚血管通透性增加；能明顯的抑制2，4二硝基氯苯(DNCB 所致小鼠DT