藍(lán)玉簪龍膽提取物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、藍(lán)玉簪龍膽提取物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究?1024?中國藥理學(xué)通報(bào)ChinesePharmacologicalBulletin2011Jul;27(7):10247網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:201161617:14網(wǎng)絡(luò)出版地址:藍(lán)玉簪龍膽提取物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究劉菁菁,李旭波,耿錚,張弦,侯穎,劉水冰,許文忠,田瓊.(1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥理學(xué)教研室,陜西西安710032;2.中國人民解放軍66347部隊(duì),河北保定071000;3.云南耿馬縣人民醫(yī)院藥劑科,云南耿馬677500)doi:10.3969/j.issn.10011978.2011.07.031文

2、獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):10011978(2011)07102404中國圖書分類號(hào):R-332;R282.71;R284.1;R378.11;R515;R978.1摘要:目的研究藍(lán)玉簪龍膽對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的體內(nèi)外抗菌活性.方法體外實(shí)驗(yàn)部分:藍(lán)玉簪龍膽分別以乙醇,氯仿,正丁醇,蒸餾水提取,得到極性不同的4部分產(chǎn)物,利用肉湯稀釋法測定其對MRSA和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)的最低抑菌濃度(MIC);體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分:采用腹腔注射MRSA法建立小鼠感染模型,分別給予藍(lán)玉簪龍膽水提液高,中,低劑量,銀黃膠囊治療15d,并與模型對照組比較,觀察存活率.結(jié)果體外實(shí)驗(yàn):藍(lán)玉簪龍膽

3、各極性組分對MRSA和MSSA菌株均有不同程度的抑菌作用,其中正丁醇組分抑菌作用最強(qiáng),其次為乙醇,水層組分;體內(nèi)試驗(yàn):除了藍(lán)玉簪龍膽大劑量組,其余各治療組存活率均高于模型對照組,而藍(lán)玉簪龍膽中劑量組存活率最高.結(jié)論藍(lán)玉簪龍膽對MRSA和MSSA均具有一定的抗菌作用,而且敏感性差異無顯著性;對MRSA感染小鼠有一定治療作用.關(guān)鍵詞:藍(lán)玉簪龍膽;提取物;耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;體外抑菌實(shí)驗(yàn);肉湯稀釋法;腹腔感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillinresist.antstaphylococcusaureus,MRSA)是醫(yī)院,社區(qū)感染的主要病原菌,幾乎對所有B-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥,甚

4、至累及到大環(huán)內(nèi)酯類,喹諾酮類和氨基糖苷類等抗菌藥物¨,自1997年報(bào)道首例金黃色葡萄球菌對萬古霉素敏感度降低后,其對替考拉寧也出現(xiàn)中介敏感,這一現(xiàn)狀成為臨床亟待解決的問題之一.尋找新的抗耐藥菌藥物是各國藥學(xué)研究者面臨的重大任務(wù),除了新型抗生素外,我國的中醫(yī)中藥正收稿日期:20110321,修稿日期:20110406基金項(xiàng)目:中國人民解放軍軍隊(duì)"十一五"課題(No06MA231)作者簡介:劉菁菁(1980一),女,碩士生,研究方向:中藥藥理學(xué),E-mail:yaopier163.corn;田瓊(1952一),女,教授,碩士生導(dǎo)師,通訊作者,Tel:029-84773

5、701,E-mail:.ell顯現(xiàn)出獨(dú)特療效.藍(lán)玉簪龍膽(GentianaveitchiorumHeme1),系龍膽科龍膽屬植物,生長于我國西藏中東部的高海拔草地中,藥用部位為其干燥花及地上部分.味苦性寒,無毒,主治天花,氣管炎,目赤頭痛,咽炎,濕熱黃疸等癥5J.在前期研究中,藍(lán)玉簪對于慢性支氣管炎,肺纖維化動(dòng)物模型有較好的療效.J,由于細(xì)菌感染是慢性支氣管炎,肺纖維化的致病因素之一,并且清熱,解毒,燥濕類中草藥有一定抑菌作用,本實(shí)驗(yàn)針對肺部疾病常見的MRSA感染,對藍(lán)玉簪龍膽的抑菌作用做一研究.1材料與方法1.1材料與儀器1.1.1儀器DH-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱

6、,北京科偉永興儀器有限公司;SWCJ一1F工作臺(tái),蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;麥?zhǔn)媳葷峁?西安市君利生物科技有限公司;電子天平,手術(shù)器械等.1.1.2試劑胃粘蛋白(mucin),Sigma公司,配成體積分?jǐn)?shù)為0.05后121cc15min滅菌,用于稀釋菌液.MH培養(yǎng)基(MuellerHintonAgar),批號(hào):20080326,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;營養(yǎng)瓊脂(NutrientAgar),批號(hào):20080602,北京奧博星生物技術(shù)有限公司;MuellerHinton肉湯(MHB),批號(hào):080430,北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;用于MR-SA的M.H肉湯及培養(yǎng)基加入體積分?jǐn)?shù)為0.

7、02的氯化鈉.氯化鈉,天津市津北精細(xì)化工有限公司.甲醛溶液,天津市紅巖化學(xué)試劑廠;乙醇,批號(hào):0806073301,安徽安特生物制品有限公司;石油醚,批號(hào):20081222,天津化學(xué)試劑有限公司;乙酸乙酯,批號(hào):20080228,天津化學(xué)試劑有限公司;三氯甲烷,批號(hào):20080115,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;正丁醇,批號(hào):20080430,天津津北精細(xì)化工有限公司,以上試劑均為分析純.1.1.3實(shí)驗(yàn)藥品藍(lán)玉簪龍膽采自西藏高原,為藍(lán)玉簪龍膽的花及莖葉.藍(lán)玉簪龍膽有機(jī)溶劑提取物制備:藍(lán)玉簪龍膽1.5kg,浸泡于30L體積分?jǐn)?shù)為中國藥理學(xué)通報(bào)ChinesePharmacologicalBullet

8、in2011Jul;27(7)?1025?0.75的乙醇中48h,重復(fù)3次,收集濾液.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾至無醇浸膏,得640.21g藍(lán)玉簪乙醇提取物.蒸餾水溶解醇提物至8L,依次用氯仿,正丁醇萃取,分別得到氯仿提取物72.13g;正丁醇提取物57.92g,水層提取物482.65g.藍(lán)玉簪龍膽水煎液制備:稱取藍(lán)玉簪龍膽40g水煎2次,濾液合并濃縮至250ml,得到濃度為0.16g?ml受試藥物(相當(dāng)4g?kg一).注射用頭孢唑啉,批號(hào):8081037308,哈藥集團(tuán)制藥總廠;銀黃膠囊,批號(hào):100101065,重慶陪都藥業(yè)股份有限公司.1.1.4動(dòng)物清潔級昆明種小鼠50只,6各半,體質(zhì)量(20&

9、#177;2)g,動(dòng)物:微生物控制為SPF級,由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,SCXK(軍)字第20025號(hào).1.1.5實(shí)驗(yàn)細(xì)菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA(國家細(xì)菌耐藥性監(jiān)測中心提供);甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌MSSA標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213(購自中國藥品生物制品檢定所).1.2方法1.2.1體外實(shí)驗(yàn):肉湯稀釋法測MIC每組排列無菌試管13只,除第1支試管外,每支試管內(nèi)加MH肉湯2ml.然后第1,2管中加入2ml稀釋的極性組分藥液,依次倍比稀釋至第l3管(這時(shí)藥物最高及最低濃度分別為:乙醇61.00.015g?L,氯仿48.00.012g?L,正丁醇94.00.024g?L,水層51

10、.00.013g?L).用微量加樣器取0.1mlMRSA菌液(MRSA過夜培養(yǎng)后0.5麥?zhǔn)媳葷?再用M.H肉湯1:10稀釋,使之含量10加個(gè)?L)依次由低濃度到高濃度,最終接種菌量為5×10個(gè)?L.另取兩支試管,做"肉湯對照","MR.SA生長對照",35孵育24h觀察,以肉眼可見生長判定最低有效濃度MIC(minimalinhibitoryconcentration,MIC).1.2.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn):感染小鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)感染菌液制備:將MRSA于實(shí)驗(yàn)前1d接種于2mlM.H肉湯中,35培養(yǎng)6h,取菌液0.1ml轉(zhuǎn)接于10ml肉湯中,35培養(yǎng)18h,為

11、增毒原菌液.于臨用前,0.5麥?zhǔn)媳葷嵩龠m當(dāng)稀釋后用體積分?jǐn)?shù)為0.05的mHcin(以1份菌液與9份mucin混合)稀釋至感染動(dòng)物L(fēng)D.所需的終濃度j.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:前述小鼠早6各半,分別隨機(jī)分成5組:感染模型對照組,藍(lán)玉簪龍膽水煎液高,中,低劑量組,銀黃膠囊陽性對照組,每組10只.方法:每只小鼠腹腔注射0.5ml感染菌液,隨后分組給藥,藍(lán)玉簪龍膽水煎液組4g?kg一(原藥)灌胃給藥0.5ml,高劑量組每天4次,中劑量組每天3次,低劑量組每天2次;銀黃膠囊陽性對照組灌胃給藥0.75g?kg,每天4次.逐日觀察并記錄感染小鼠存活數(shù)量,共15d.之所以用銀黃膠囊做陽性對照,是因?yàn)闆]有明確的用于MRS

12、A的中草藥,銀黃膠囊由黃芩,金銀花配方而成,在以往的體外研究中這兩種草藥均有很好的抗MRSA作用J.此外,在之前預(yù)實(shí)驗(yàn)中做過單獨(dú)mucin注射對照,小鼠無死亡.1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理記錄小鼠死亡或存活情況進(jìn)行x檢驗(yàn)判斷.2結(jié)果2.1體外抗菌作用肉湯稀釋法結(jié)果發(fā)現(xiàn),藍(lán)玉簪龍膽各極性組分對MRSA和MSSA均有體外抗菌作用.結(jié)果見Tab1.Tab1Invitroantibacterialtest(MIC/g?L)ExtractiveSta二p=h二_ylococcusaureusMRSAMSSA藍(lán)玉簪龍膽的各提取物對MRSA和MSSA的敏感性差異無顯著性,可能是由于中草藥在機(jī)體內(nèi)的抗菌活性有別于抗生素J

13、.其中,正丁醇組分的MIC值在各極性組分中最低,即有效濃度最低.2.2藍(lán)玉簪龍膽水煎液對小鼠腹腔耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的作用小鼠腹腔感染2h后出現(xiàn)畏寒,寒戰(zhàn),10h后眼睛有膿性物質(zhì)分泌,活動(dòng)減少,無進(jìn)食,20h后出現(xiàn)腹瀉,體溫降低等癥狀,并開始死亡.死亡小鼠尸檢,各組小鼠的肝,腎均出現(xiàn)不同程度膿點(diǎn),其他臟器未見異常.無菌操作取存活及死亡小鼠的心血,接種于瓊脂平板,35C孵育,24h后存活小鼠的心血培養(yǎng)無菌落,死亡小鼠的心血均有菌落生長.治療15d后結(jié)果見Tab2,中劑量組與對照組相比較差異有顯著性(P<0.01).Tab2ProtectiveeffectofGentiana

14、veitchiorumHemelonmiceinfectedwithMRSA(n=15)?1026?中國藥理學(xué)通報(bào)ChinesePharmacologicalBulletin2011Jul;27(7)3討論在耐藥菌大量涌現(xiàn)的情況下,我國傳統(tǒng)中草藥并沒有出現(xiàn)明顯的耐藥情況,有研究者認(rèn)為中草藥除直接的抗菌作用外,還可增強(qiáng)機(jī)體的免疫力,有其獨(dú)特機(jī)制¨"J,這些可能是中草藥不易產(chǎn)生耐藥性的原因.本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi),體外兩部分證實(shí)了藍(lán)玉簪龍膽的抗菌作用.體外肉湯稀釋法顯示,藍(lán)玉簪龍膽各極性組分存在抑菌差異,由于苷類物質(zhì)較易溶于正丁醇,生物堿較易溶于乙醇,氯仿,由實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測藍(lán)玉簪龍膽發(fā)揮抑

15、菌作用的有效物質(zhì)可能為苷類或生物堿,為該藥有效成分分析做參考.感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,藍(lán)玉簪龍膽各治療組比對照組小鼠的癥狀稍輕,發(fā)病緩,恢復(fù)快,就死亡小鼠而言,有效延長死亡時(shí)間12d.但在此實(shí)驗(yàn)中,高劑量組死亡率高于中劑量組,雖然藍(lán)玉簪龍膽在之前的急毒,長毒實(shí)驗(yàn)中,均未出現(xiàn)毒副作用,但是對于感染小鼠,說明此藥并非劑量越大療效越好.對于銀黃膠囊組,主成分黃芩,金銀花,雖在體外抗MRSA研究中取得很好效果,但本次體內(nèi)用藥只是參考臨床治療上呼吸道疾病的用量,可能對于抗MRSA劑量還需調(diào)整,所以本次銀黃膠囊的治療不理想.清熱解毒中藥常用于治療感染性疾病,但體外抑菌實(shí)驗(yàn)效果差異較大,有些與抗生素聯(lián)用往往能增強(qiáng)

16、抗生素的殺菌療效.體外研究結(jié)果進(jìn)一步促進(jìn)了清熱解毒中藥的臨床研究和應(yīng)用,形成了中藥"抗菌增敏"的概念¨-14.藍(lán)玉簪龍膽作為單方制劑,對于急癥感染作用還是很明顯的,本研究為臨床控制MRSA感染提供了新思路.參考文獻(xiàn):1胡迎霞.金黃色葡萄球菌的分布及耐藥性研究J.中外醫(yī)療,2009,28(14):1.1HUYX.Thedistributionanddrugtoleranceofstaphylococcus_dureusJ.ChinaForeMedTreat,2009,28(14):1.2ChangS,SievertDM,HagemanJC,eta1.Infectio

17、nwithvancomy-cin-resistantstaphylococcusanrcuscontainingthevanAresistancegeneJ.NEnglJMed,2003,348(14):13427.3李永紅,白玉蘭,褚云卓.抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對MRSA體外抗菌活性研究J.中國藥理學(xué)通報(bào),2007,23(3):4189.3LiYH,BaiYLChuYZ.StudyontheantibacterialactivityofcombinedantibacterialagentsagainstMRSAinvitroJ.ChinPharmacolBu/Z,2007,23(3):4189.4

18、鄧永中,陸夢怡.中藥抗菌有效化學(xué)物質(zhì)的研究進(jìn)展J.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2008,2(18):121.4DengYZ,LuMY.ResearchprogressoneffectiveantibacterialchemicalsubstancesoftraditionalchinesemedicineJ.ChinJ55667788991O10111112121314ModDrugappl,2008,2(18):121.中國科學(xué)院西北高原生物研究所.藏藥志M.蘭州:青海人民出版社,1991:188.NorthwestPlateauInstituteofBiology,Chineseacademyofs

19、eiences.TibetanChiM.Lanzhou:People'spublishingHouseofQinghai,1991:188.侯穎,曹蔚,李濤,等.藍(lán)玉簪顆粒治療小鼠慢性支氣管炎作用機(jī)理的研究J.第四軍醫(yī)大,2008,29(14):3313.HouY,CaoW,LiT,eta1.TherapeuticeffectofGentianaveitchi-OFllmparticlesonchronicbronchitisinmiceJ.JFourthMilitMedUniv,2008,29(14):3313.李鵬,唐堅(jiān),李安,等.藍(lán)玉簪龍膽對二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化的治療研究J

20、.時(shí)珍國醫(yī)國藥,2008,19(7):15657.LiP.TangJ.IJiA.eta1.ExperimentalstudyofgentiaoaveitchiorumonDMN-inducedearlyliverfibrosisinratsJ.LishizhenMedMatMedRes,2008,19(7):15657.陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)M.北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:262.CengQ.TraditionalChinesemedicinepharmacologicalresearchmethodologyM.Beijing:PeoplesMdicalPublishingHouse,

21、2000:262.田應(yīng)彪,陳澤慧,楊名慧,等.16種中藥水煎液對MRSA和MSSA體外抑菌試驗(yàn)觀察J.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2009,29(11):8979.TianYB,ChenZH,YangMH,eta1.InvitroBacteriostaticin-vestigationof16chinesematerialformuladecocyiononMRSAandMSSAJ.ChinJHosP0rm,2009,29(11):8979.陳勇川,謝林利,熊麗蓉,等.黃芩苷/黃芩素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗藥性的逆轉(zhuǎn)作用研究J.中國藥房,2008,19(9):6446.ChenYC,XieLL,Xi

22、ongLR.Reverseeffectofbaiealin/baiealeinonantibioticresistanceofmethicillin-resistantstaphylococcusau?-teasJ.ChinPharm,2008,19(9):6446.楊明煒,陸付耳,徐麗君,等.2O種清熱解毒中藥對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗藥性的影響J.中草藥,2004,35(7):799800.YangMW,LuFE,XuLJ,eta1.Influenceofheatclearinganddetoxicatingof20Chinesematerialonantibioticresistanc

23、eofMRSAJ.ChinTradHerbDrugs,2004,35(7):799800.王繼武,李金炎.抗菌中藥和抗菌素協(xié)同抑菌作用的探討J.鐵道醫(yī)學(xué),1981(2):937.WangJW.LiJY.ResearchonsynergisticinhibitionofAntibacte-rialChineseherbalmedicineandantibioticJ.RailwayMedJ,1981(2):937.LewisK.InsearchofnaturalsubstratesandinhibitotsofMDRpumpsJ.JMolMicrobiolBioteehnol,2001,3(2)

24、:2471.DaviesD.UnderstandingbiofilmresistancetoantibacterialagentsJ.NatRevDrugDiscov,2003,2(2):114.中國藥理學(xué)通報(bào)ChinesePharmacologicalBulletin2011Jul;27(7):102730?1027?網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:201161617:14網(wǎng)絡(luò)出版地址:實(shí)驗(yàn)方法學(xué)小鼠骨髓抑制模型的建立許晶晶,劉奐弟,朱依純(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科,河南鄭州450052;2.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系,上海200032)doi:10.3969/j.issn.10011978.

25、2011.07.032文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):10011978(2011)07102704中國圖書分類號(hào):R一332;R331.22;R363332;R551.3;R979.1摘要:目的建立小鼠骨髓抑制模型.方法選用810周的早BALB/c小鼠,體質(zhì)量2022g.每只小鼠腹腔注射1mg的卡鉑注射液后立即行6MV直線加速器照射,照射劑收稿日期:20110323,修回日期:20110415基金項(xiàng)目:國家"重大新藥創(chuàng)制"科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(No2009ZX09303-006)作者簡介:許晶晶(1980一),女,博士,研究方向:氣體遞質(zhì)的生理藥理作用,Tel:0371691333

26、0,Email:happyxujignjing163.tom;劉奐弟(1984一),女,碩士生,研究方向:氣體遞質(zhì)的生理藥理作用,TelE?mail:huandi1984163.con,貢獻(xiàn)等同于第一作者;朱依純(1963一),男,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向:心血管生理藥理學(xué),通訊作者,Tel/FaxEmail:yczhu量為每只2Gy,從而產(chǎn)生骨髓抑制.觀察小鼠血常規(guī);骨髓涂片進(jìn)行HE染色,觀察骨髓的變化.結(jié)果模型組小鼠有潛在出血傾向,外周血各系細(xì)胞下降明顯,紅細(xì)胞計(jì)數(shù),血紅蛋白含量,血小板計(jì)數(shù)均在卡鉑和放療聯(lián)合處理后14d達(dá)到最低點(diǎn),

27、此后慢慢恢復(fù),處理后28d可基本恢復(fù)至正常水平.相比紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白含量,血小板計(jì)數(shù)恢復(fù)較為緩慢.外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)在卡鉑和放療聯(lián)合處理后7d達(dá)到最低點(diǎn),此后慢慢恢復(fù),至處理后28d可基本恢復(fù)到正常水平.結(jié)論腹腔注射卡鉑注射液和放療共同誘導(dǎo)的小鼠骨髓抑制模型重復(fù)性好,易于操作,可以作為其他藥物研究的基礎(chǔ).關(guān)鍵詞:卡鉑;放療;骨髓抑制模型;BALB/c小鼠;骨髓涂片;HE染色骨髓抑制是臨床上常見的造血系統(tǒng)疾病,它的誘發(fā)因素很多,包括各系統(tǒng)腫瘤性疾病的放射治療或化學(xué)治療;電離輻射引起的放射損傷;病毒性肝炎,艾滋病病毒等感TestofGentianaveitchiorumHemelagainstM

28、RSALIUJing-jing一,LIXubo,GENGZheng,ZHANGXuan,HOUYing,LIUShuibing,XUWenzhong,TIANQiong(1.DeptofPharmacology,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China;2.Troops66347ofP,BaodingHebei071000,China;3.DeptofPharmacy,People'sHospitalofGengma,GengmaYunnan677500,China)Abstract:AimTostudytheGentianaveitchiorumHemelonmethicillinresistantstaphylococcusaureus(MRSA)inantibacterialactivity.MethodsGentianaveitchiorumHemelwasextractedw