基因克隆的載體

1、基因克隆的載體第二節(jié)第二節(jié) 基因克隆的載體基因克隆的載體 載體的概念及特點(diǎn)載體的概念及特點(diǎn) 質(zhì)粒載體（質(zhì)粒載體（plasimid vectors） 噬菌體載體（噬菌體載體（phage vectors） 柯斯質(zhì)粒載體（柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors） 第1頁(yè)/共81頁(yè)引引 言言載體（載體（vector）：能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行）：能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行 擴(kuò)增和表達(dá)的工具。擴(kuò)增和表達(dá)的工具。作為基因克隆的載體必須具備以下特性：作為基因克隆的載體必須具備以下特性：A. 能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行獨(dú)立的復(fù)制和表達(dá)；能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行獨(dú)立的復(fù)制和表達(dá)；B. 具有具有1-2個(gè)選擇標(biāo)記基

2、因，如對(duì)抗生素的抗性基因個(gè)選擇標(biāo)記基因，如對(duì)抗生素的抗性基因等；等；C. 具備多克隆位點(diǎn)（具備多克隆位點(diǎn)（Multiple Clone Sites，MCS），），而且可攜帶外源而且可攜帶外源DNA片段的長(zhǎng)度范圍較寬片段的長(zhǎng)度范圍較寬;D. 自身分子量較小，在寄主細(xì)胞中的拷貝數(shù)高，易自身分子量較小，在寄主細(xì)胞中的拷貝數(shù)高，易于操作和于操作和DNA的制備。的制備。E. 具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移。具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移。第2頁(yè)/共81頁(yè)載體的分類載體的分類根據(jù)載體工作方式的不同可分為根據(jù)載體工作方式的不同可分為質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體（plasimid vectors）、噬菌體載體（）、噬菌體

3、載體（phage vectors）、）、 噬菌體噬菌體-質(zhì)粒雜合載體（考斯質(zhì)粒雜合載體（考斯質(zhì)粒）質(zhì)粒） 第3頁(yè)/共81頁(yè)質(zhì)粒的概念：質(zhì)粒是一種廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中獨(dú)立質(zhì)粒的概念：質(zhì)粒是一種廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中獨(dú)立于于染色體以外染色體以外的能的能自主的復(fù)制自主的復(fù)制的裸露的遺傳物質(zhì)。的裸露的遺傳物質(zhì)。大多數(shù)質(zhì)粒是閉大多數(shù)質(zhì)粒是閉合環(huán)狀雙鏈合環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更分子，比病毒更簡(jiǎn)單。在霉菌、簡(jiǎn)單。在霉菌、藍(lán)藻、酵母和一藍(lán)藻、酵母和一些動(dòng)植物細(xì)胞中些動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒。也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒。一一 質(zhì)粒載體（質(zhì)粒載體（plasimid vectors）第4頁(yè)/共81頁(yè) 質(zhì)粒的特點(diǎn)質(zhì)粒的特點(diǎn)（1）

4、自主復(fù)制性。）自主復(fù)制性。質(zhì)粒含有自己的復(fù)制起始位點(diǎn)（質(zhì)粒含有自己的復(fù)制起始位點(diǎn)（Origin,簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱ori），有些質(zhì)），有些質(zhì)粒具有獨(dú)立的復(fù)制子結(jié)構(gòu)（粒具有獨(dú)立的復(fù)制子結(jié)構(gòu)（Replicon），因此，質(zhì)粒），因此，質(zhì)粒DNA可以自主復(fù)制，形可以自主復(fù)制，形成少則幾個(gè)多則成百上千個(gè)拷貝。成少則幾個(gè)多則成百上千個(gè)拷貝。（2）可擴(kuò)增性。）可擴(kuò)增性。在格蘭氏陰性細(xì)菌中，質(zhì)粒的復(fù)制一般有兩種復(fù)制形式，即嚴(yán)在格蘭氏陰性細(xì)菌中，質(zhì)粒的復(fù)制一般有兩種復(fù)制形式，即嚴(yán)緊型（緊型（Stringent）和松弛型（）和松弛型（Relaxed）。）。第5頁(yè)/共81頁(yè) 質(zhì)粒的復(fù)制類型：質(zhì)粒的復(fù)制類型：一種質(zhì)粒在宿主細(xì)胞

5、中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的一種質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)拷貝數(shù)。根。根據(jù)拷貝數(shù)的多少將質(zhì)粒分為兩種復(fù)制型：據(jù)拷貝數(shù)的多少將質(zhì)粒分為兩種復(fù)制型：“嚴(yán)緊型嚴(yán)緊型”質(zhì)粒質(zhì)粒（stringent plasmid）,拷貝數(shù)為拷貝數(shù)為1-5；“松弛型松弛型”質(zhì)粒（質(zhì)粒（relaxed plasmid）,拷貝數(shù)為拷貝數(shù)為6-606-60。不過(guò)，即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞間也可能有很大的。不過(guò)，即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞間也可能有很大的變化。變化。第6頁(yè)/共81頁(yè) 嚴(yán)緊型質(zhì)粒（嚴(yán)緊型質(zhì)粒（Stringent）：這類質(zhì)粒的復(fù)制由細(xì)胞內(nèi)）：這類質(zhì)粒的復(fù)制由細(xì)胞內(nèi)DNA聚

6、合酶聚合酶介導(dǎo)，并被介導(dǎo)，并被質(zhì)粒上編碼的蛋白因子正調(diào)控，由于這些蛋白因子極不穩(wěn)定使得每個(gè)細(xì)胞只能復(fù)質(zhì)粒上編碼的蛋白因子正調(diào)控，由于這些蛋白因子極不穩(wěn)定使得每個(gè)細(xì)胞只能復(fù)制少數(shù)幾個(gè)質(zhì)?？截?，一般把一個(gè)細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)少于制少數(shù)幾個(gè)質(zhì)?？截?，一般把一個(gè)細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)少于5個(gè)的質(zhì)粒稱為嚴(yán)緊型質(zhì)粒。個(gè)的質(zhì)粒稱為嚴(yán)緊型質(zhì)粒。 松弛型質(zhì)粒（松弛型質(zhì)粒（Relaxed）：這類質(zhì)粒的復(fù)制）：這類質(zhì)粒的復(fù)制需要半衰期較長(zhǎng)的需要半衰期較長(zhǎng)的DNA聚合酶聚合酶、RNA聚合聚合酶及其他復(fù)制輔助蛋白因子，這類質(zhì)粒在宿酶及其他復(fù)制輔助蛋白因子，這類質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中一般可達(dá)到主細(xì)胞中一般可達(dá)到3050個(gè)拷貝，所以稱個(gè)拷貝，所以

7、稱為松弛型質(zhì)粒。為松弛型質(zhì)粒。第7頁(yè)/共81頁(yè) 質(zhì)粒的氯霉素?cái)U(kuò)增：當(dāng)宿主細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)后期，加入質(zhì)粒的氯霉素?cái)U(kuò)增：當(dāng)宿主細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)后期，加入氯霉素可以抑制宿主氯霉素可以抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的生物合成，阻斷宿主菌的大部分代謝途徑，細(xì)胞蛋白質(zhì)的生物合成，阻斷宿主菌的大部分代謝途徑，松弛型質(zhì)粒就能松弛型質(zhì)粒就能利用豐富的原料及能量進(jìn)行復(fù)制，最終每個(gè)細(xì)胞就能累積上千個(gè)利用豐富的原料及能量進(jìn)行復(fù)制，最終每個(gè)細(xì)胞就能累積上千個(gè)DNA分子，分子，把這種操作稱為質(zhì)粒的氯霉素?cái)U(kuò)增。把這種操作稱為質(zhì)粒的氯霉素?cái)U(kuò)增。第8頁(yè)/共81頁(yè)（3）可轉(zhuǎn)移性。）可轉(zhuǎn)移性。在移動(dòng)基因在移動(dòng)基因mob、轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移基因tra、順式作

8、用元件順式作用元件bom等因子的作用下，許多等因子的作用下，許多野生型質(zhì)粒可以通過(guò)細(xì)胞的接合野生型質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)細(xì)胞的接合（conjugation）作用從一個(gè)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)）作用從一個(gè)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)宿主細(xì)胞中。移到另一個(gè)宿主細(xì)胞中。第9頁(yè)/共81頁(yè)（4）不相容性。具有相同或相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)及特征的兩種不同的質(zhì)粒不能穩(wěn)）不相容性。具有相同或相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)及特征的兩種不同的質(zhì)粒不能穩(wěn)定的存在于同一個(gè)受體細(xì)胞的現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性定的存在于同一個(gè)受體細(xì)胞的現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性（incompatibility）。）。細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂第10頁(yè)/共81頁(yè)理想質(zhì)粒的改造與構(gòu)建理想質(zhì)粒的改造與構(gòu)建（1）刪除

9、不必要的）刪除不必要的DNA區(qū)域。盡量縮小質(zhì)粒的相對(duì)分子量，以提高外源區(qū)域。盡量縮小質(zhì)粒的相對(duì)分子量，以提高外源DNA的裝的裝載量；載量； 一般大于一般大于20Kb的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率很低而且不穩(wěn)定。的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率很低而且不穩(wěn)定。（2）滅活某些質(zhì)粒的編碼基因。如滅活編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的）滅活某些質(zhì)粒的編碼基因。如滅活編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的mob基因以提高質(zhì)粒的安基因以提高質(zhì)粒的安全性，滅活對(duì)質(zhì)粒的復(fù)制產(chǎn)生負(fù)調(diào)控的基因，以提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)。全性，滅活對(duì)質(zhì)粒的復(fù)制產(chǎn)生負(fù)調(diào)控的基因，以提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)。第11頁(yè)/共81頁(yè)（3）加入易于識(shí)別的選擇標(biāo)記基因。）加入易于識(shí)別的選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因：選擇標(biāo)記基因：在基因工程中

10、的一類用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞（菌）的抗性基因，在基因工程中的一類用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞（菌）的抗性基因，通過(guò)在培養(yǎng)基中加入特定的抗生素就可以篩選得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（菌）。通過(guò)在培養(yǎng)基中加入特定的抗生素就可以篩選得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（菌）。 常用的抗生素抗性基因有：常用的抗生素抗性基因有：Ampr(氨芐青霉素抗性基因氨芐青霉素抗性基因)、Kanr (卡那霉卡那霉素抗性基因素抗性基因)、Tetr (四環(huán)素抗性基因四環(huán)素抗性基因)、Cmr 或或cat(氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因)、Neor (新霉素抗性基因新霉素抗性基因)；第12頁(yè)/共81頁(yè)LacZM15缺失第缺失第11-41位的氨基酸位的氨基酸LacZ N端端140

11、個(gè)氨個(gè)氨基酸基酸LacZMCS140個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸+MCSLacZ1024個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸LacZM15F質(zhì)粒質(zhì)粒載體載體LacZE.coliLacZ M15+ LacZX-galLacZ M15+ LacZDNAX-gal篩選標(biāo)記基因：篩選標(biāo)記基因：-互補(bǔ)互補(bǔ)第13頁(yè)/共81頁(yè) 大腸桿菌大腸桿菌 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 可以和其底物可以和其底物X-Gal 相互作相互作用并且釋放出一種藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)該酶的用并且釋放出一種藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)該酶的 -片段片段和和 -片片段段分開(kāi)時(shí)就失去了這種顯色的功能。通常將分開(kāi)時(shí)就失去了這種顯色的功能。通常將缺失了第缺失了第11-41位氨基酸的編碼位氨基酸的編碼 片

12、段的片段的LacZM15構(gòu)建在構(gòu)建在F質(zhì)質(zhì)粒上先轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，而將粒上先轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，而將編碼該酶編碼該酶N端端140個(gè)氨基個(gè)氨基酸的酸的 -片段片段的的LacZ基因插入到載體的多克隆位點(diǎn)的側(cè)基因插入到載體的多克隆位點(diǎn)的側(cè)翼序列中。當(dāng)含有翼序列中。當(dāng)含有LacZ基因的載體基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細(xì)導(dǎo)入到這類寄主細(xì)胞中時(shí)，載體編碼的胞中時(shí)，載體編碼的 -片段片段就能和寄主編碼的就能和寄主編碼的 片段片段發(fā)生互補(bǔ)并具有了對(duì)底物發(fā)生互補(bǔ)并具有了對(duì)底物X-gal的作用功能（發(fā)生顯色的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象被稱為是反應(yīng)），這種現(xiàn)象被稱為是 -互補(bǔ)（互補(bǔ)（ alpha-complement

13、ation）.將這種篩選方式稱為藍(lán)白斑篩選）將這種篩選方式稱為藍(lán)白斑篩選）第14頁(yè)/共81頁(yè)藍(lán)白斑篩選第15頁(yè)/共81頁(yè)（4）在篩選標(biāo)記基因內(nèi)引入具有多種限制性）在篩選標(biāo)記基因內(nèi)引入具有多種限制性內(nèi)切酶識(shí)別及切割位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)內(nèi)切酶識(shí)別及切割位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)（Multiple Clone Site,即即MCS）,便于外便于外源基因的重組；源基因的重組；多克隆位點(diǎn)(MCS)：克隆載體中的一段用于插克隆載體中的一段用于插入外源入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)組成，而且每個(gè)密相連的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)組成，而且每個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)應(yīng)該在整

14、個(gè)載體中是唯一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)應(yīng)該在整個(gè)載體中是唯一的。的。（5）根據(jù)外源基因克隆和表達(dá)的不同）根據(jù)外源基因克隆和表達(dá)的不同要求，加裝特殊的基因表達(dá)調(diào)控元件。要求，加裝特殊的基因表達(dá)調(diào)控元件。第16頁(yè)/共81頁(yè)質(zhì)粒的分類：質(zhì)粒的分類：根據(jù)其功能和用途將根據(jù)其功能和用途將人工構(gòu)建的質(zhì)粒分為以下幾類：人工構(gòu)建的質(zhì)粒分為以下幾類：克隆質(zhì)粒、測(cè)序質(zhì)粒、整合質(zhì)粒、克隆質(zhì)粒、測(cè)序質(zhì)粒、整合質(zhì)粒、穿梭質(zhì)粒、探針質(zhì)粒、表達(dá)質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒、探針質(zhì)粒、表達(dá)質(zhì)粒等。等。第17頁(yè)/共81頁(yè)質(zhì)粒的種類及用途質(zhì)粒的種類及用途（1 1）克隆質(zhì)粒。）克隆質(zhì)粒。用于用于克隆和擴(kuò)增外源基因克隆和擴(kuò)增外源基因。第18頁(yè)/共81頁(yè)（2

15、）測(cè)序質(zhì)粒。有MCS，并在MCS兩端設(shè)有兩個(gè)不同的引物，便于DNA測(cè)序。如pUC18/19。第19頁(yè)/共81頁(yè)（3）整合質(zhì)粒。）整合質(zhì)粒。含有整合酶編碼基因及整合特異性的位點(diǎn)序列，克隆在這類質(zhì)粒上的含有整合酶編碼基因及整合特異性的位點(diǎn)序列，克隆在這類質(zhì)粒上的基因在進(jìn)入宿主細(xì)胞后能準(zhǔn)確的重組整合在受體細(xì)胞染色體基因組的特定位點(diǎn)上。基因在進(jìn)入宿主細(xì)胞后能準(zhǔn)確的重組整合在受體細(xì)胞染色體基因組的特定位點(diǎn)上。（4）穿梭質(zhì)粒。）穿梭質(zhì)粒。這類質(zhì)粒含有兩種不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的選擇標(biāo)記性基因，因此這類質(zhì)粒含有兩種不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的選擇標(biāo)記性基因，因此能在兩種不同的種屬細(xì)胞中復(fù)制并檢測(cè)。如大腸桿菌能在

16、兩種不同的種屬細(xì)胞中復(fù)制并檢測(cè)。如大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，大腸桿菌鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，大腸桿菌-酵酵母菌穿梭質(zhì)粒。母菌穿梭質(zhì)粒。（5）探針質(zhì)粒。）探針質(zhì)粒。這類載體用來(lái)構(gòu)建或篩選克隆基因的表達(dá)調(diào)控元件，如啟動(dòng)子和終止這類載體用來(lái)構(gòu)建或篩選克隆基因的表達(dá)調(diào)控元件，如啟動(dòng)子和終止子。子。第20頁(yè)/共81頁(yè)（6）表達(dá)質(zhì)粒。）表達(dá)質(zhì)粒。這類質(zhì)粒在這類質(zhì)粒在MCS的上游和下游分別裝有兩套轉(zhuǎn)錄效率較高的上游和下游分別裝有兩套轉(zhuǎn)錄效率較高的啟動(dòng)子、合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（的啟動(dòng)子、合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD-序列）以及強(qiáng)有力的終止子結(jié)構(gòu)使序列）以及強(qiáng)有力的終止子結(jié)構(gòu)使得克隆在合適位點(diǎn)上的任何外源基因均能在受體細(xì)

17、胞中高效表達(dá)，如得克隆在合適位點(diǎn)上的任何外源基因均能在受體細(xì)胞中高效表達(dá)，如pET系列質(zhì)粒。系列質(zhì)粒。第21頁(yè)/共81頁(yè)第22頁(yè)/共81頁(yè)質(zhì)粒DNA的提取與純化第23頁(yè)/共81頁(yè)大腸桿菌基因組大腸桿菌基因組DNA 第24頁(yè)/共81頁(yè)一、質(zhì)粒DNA的提取第25頁(yè)/共81頁(yè)plasmid DNAThe genomic DNA of E. coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell.Genomic DNA 第26頁(yè)/共81頁(yè)閉合環(huán)狀的

18、質(zhì)粒閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；分離，復(fù)性快；（1）原理1. 堿裂解法提取質(zhì)粒堿裂解法提取質(zhì)粒DNADNA雙鏈雙鏈變性變性DNA單鏈單鏈復(fù)性復(fù)性強(qiáng)堿中性中性第27頁(yè)/共81頁(yè)染色體染色體線性線性DNA和或和或有缺口有缺口的質(zhì)粒的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物結(jié)復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候合在一起，在離心的時(shí)候沉淀沉淀下去。下去。變性變性第28頁(yè)/共81頁(yè) 堿變性法 這種方法是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片段之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來(lái)的。通過(guò)加熱，

19、尤其是在pH值介于12.012.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，連接DNA互補(bǔ)鏈之間的氫鍵會(huì)被斷裂，但由于cccDNA的雙螺旋主鏈骨架的彼此盤(pán)繞作用，互補(bǔ)的兩條鏈仍然會(huì)緊密地結(jié)合在一起。通過(guò)致冷或恢復(fù)中性pH值更會(huì)迅速地復(fù)性，復(fù)性迅速而準(zhǔn)確。線性的染色體DNA分子，在此過(guò)程中彼此已經(jīng)分離開(kāi)來(lái)的互補(bǔ)鏈之間的復(fù)性作用就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確。它們聚集形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心分離便會(huì)與變性的蛋白質(zhì)及RNA一道沉淀下來(lái)。仍然滯留在上清液中的質(zhì)粒cccDNA則可用酒精沉淀法收集。第29頁(yè)/共81頁(yè)（2） 所用的試劑作用 溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的 -1，4糖苷鍵。 在堿性條件（pH8）下有活性。 葡

20、萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。第30頁(yè)/共81頁(yè)EDTAMg2+、Ca 2+的螯合劑，可抑制的螯合劑，可抑制DNA酶酶的的活性，防止活性，防止DNA被酶降解。被酶降解。NaOH-SDSNaOH：強(qiáng)堿，提供：強(qiáng)堿，提供pH12的堿性條件，的堿性條件，使使DNA雙鏈雙鏈變性變性。 SDS: 溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成結(jié)合成“蛋白蛋白SDS”復(fù)合物復(fù)合物，使蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)（包括（包括DNA酶）變性沉淀。酶）變性沉淀。 第31頁(yè)/共81頁(yè)用冰醋酸將醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4.8。 用來(lái)中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。高濃

21、度的高濃度的NaAc有利于變性的大分子有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。等）沉淀。用于沉淀DNA。 乙醇DNA分子以分子以水合狀態(tài)水合狀態(tài)“溶于溶于”水里，水里，乙醇能奪去乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。分子的水環(huán)境。 NaAc-HAc緩沖液第32頁(yè)/共81頁(yè) RNase A降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 TE緩沖液DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖液），有利于以后操作；液或硼酸緩沖液），有利于以后操作； EDTA抑制抑制DNA酶，防止酶，

22、防止DNA被酶降解。被酶降解。第33頁(yè)/共81頁(yè)蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。 但苯酚會(huì)殘留在DNA溶液中。 （現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。 酚-氯仿選用以上試劑有商業(yè)試劑盒；以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。也可以自己配制。第34頁(yè)/共81頁(yè)（3）堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的步驟 Solution I 的配制：的配制：使用“溶液”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶溶菌酶， RNase A（5-10mg/L）第35頁(yè)/共81頁(yè)溶液II 破壞細(xì)胞膜，蛋

23、白質(zhì)和DNA變性。第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性Solution II 的配制：第三步：中和溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。Solution III的配制：0.4N NaOH，2.0%SDS3M 醋酸鈉（用冰醋酸調(diào)醋酸鈉（用冰醋酸調(diào)pH至至4.8）第36頁(yè)/共81頁(yè)最重要的是：2. 影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素菌株的遺傳背景， 質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。一般要使用一般要使用endA基因基因發(fā)生突變的大腸桿菌發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。如菌株。如DH5 、JM109、XL1-Blue等。等。（1）受體菌株endA基因編碼基因編碼核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶，在在Mg2+的

24、存在的存在下可將雙鏈下可將雙鏈DNA消化成消化成7bp的寡核苷酸片斷。的寡核苷酸片斷。第37頁(yè)/共81頁(yè)這是直接決定這是直接決定DNA產(chǎn)量的重要因素之一。產(chǎn)量的重要因素之一。（3）質(zhì)粒大小分子量大的質(zhì)粒，拷貝數(shù)少。（2）質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒本身的性質(zhì)所決定質(zhì)粒本身的性質(zhì)所決定。第38頁(yè)/共81頁(yè)pBR3224363連接加反應(yīng)液Tet or AmpTet + AmpCK+2. 質(zhì)粒載體相關(guān)知識(shí)介紹質(zhì)粒載體相關(guān)知識(shí)介紹第39頁(yè)/共81頁(yè)質(zhì)粒的存在形式：質(zhì)粒的存在形式：有超螺旋、開(kāi)環(huán)雙螺旋和有超螺旋、開(kāi)環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種。線狀雙螺旋三種。雙螺旋共價(jià)閉合雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋）環(huán)（超螺旋）coval

25、ently closed circular DNA, 簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱cccDNA開(kāi)環(huán)雙螺旋（一開(kāi)環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口）個(gè)裂口）open circular DNA, 簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱ocDNA線狀雙螺旋（兩線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口）個(gè)裂口）linear DNA,簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱L-DNA第40頁(yè)/共81頁(yè)三種形式的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電三種形式的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳中的分離情況泳中的分離情況第41頁(yè)/共81頁(yè)第二節(jié)第二節(jié) 基因克隆的載體基因克隆的載體引引 言（言（introduction）一一 質(zhì)粒載體（質(zhì)粒載體（plasimid vectors）二二 噬菌體載體（噬菌體載體（phage vectors）三三 柯斯質(zhì)粒載體（柯

26、斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors） 第42頁(yè)/共81頁(yè)二二 噬菌體載體噬菌體載體（phage vectors）1、 噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性2、 噬菌體載體噬菌體載體3、M13噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性4、M13噬菌體載體噬菌體載體第43頁(yè)/共81頁(yè)1. 噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性The Phage consist of a linear c h r o m o s o m e enclosed in a p r o t e i n c o a t (capsid,衣殼衣殼 ). When the phage infecting the host cel

27、ls, it injects its DNA into the host bacterium. 第44頁(yè)/共81頁(yè)1. 噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性 噬菌體的生長(zhǎng)周期可分為噬菌體的生長(zhǎng)周期可分為溶菌周期（溶菌周期（Lytic cycle）和和溶原周期（溶原周期（Lysogenic cycle）兩種類型。兩種類型。前者指前者指噬菌噬菌體將體將DNADNA注入寄主細(xì)胞后很快環(huán)化，然后進(jìn)行自我復(fù)注入寄主細(xì)胞后很快環(huán)化，然后進(jìn)行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細(xì)胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。在主細(xì)胞破裂而釋放出大量的子代噬菌

28、體。在溶原周期溶原周期中，注入寄主細(xì)胞的噬菌體中，注入寄主細(xì)胞的噬菌體DNADNA是整合到寄主細(xì)胞染是整合到寄主細(xì)胞染色體上并可以隨著寄主細(xì)胞的分裂而進(jìn)行復(fù)制。色體上并可以隨著寄主細(xì)胞的分裂而進(jìn)行復(fù)制。 只有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體被稱為只有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體被稱為烈性噬菌體烈性噬菌體。只有溶原周期的噬菌體被稱為只有溶原周期的噬菌體被稱為溫和噬菌體溫和噬菌體。整合了一。整合了一套完整的噬菌體基因組的細(xì)菌被稱為套完整的噬菌體基因組的細(xì)菌被稱為溶原性細(xì)菌溶原性細(xì)菌。在。在溶原性細(xì)菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體溶原性細(xì)菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體DNADNA被稱被稱為為原噬菌體原噬菌體。第45頁(yè)/共

29、81頁(yè)溶原周期（Lysogenic cycle）溶菌周期（Lytic cycle）第46頁(yè)/共81頁(yè)1. 噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性 DNA為線狀雙鏈為線狀雙鏈DNA分子分子，長(zhǎng)度為，長(zhǎng)度為48502bp，在，在分子兩端各有分子兩端各有12個(gè)堿基的單鏈互補(bǔ)粘性末端個(gè)堿基的單鏈互補(bǔ)粘性末端。當(dāng)其注入。當(dāng)其注入到寄主細(xì)胞中后，可以迅速通過(guò)這兩個(gè)粘性末端的互補(bǔ)到寄主細(xì)胞中后，可以迅速通過(guò)這兩個(gè)粘性末端的互補(bǔ)作用形成雙鏈的環(huán)形作用形成雙鏈的環(huán)形DNA分子。上述通過(guò)粘性末端互分子。上述通過(guò)粘性末端互補(bǔ)形成的雙鏈區(qū)被稱為補(bǔ)形成的雙鏈區(qū)被稱為cos位點(diǎn)位點(diǎn)（cohesive end site）.

30、DNA至少包括至少包括61個(gè)基因，個(gè)基因，其中一部分為噬菌體生其中一部分為噬菌體生命活動(dòng)的必須基因，另一部分可以被外源基因取代而不命活動(dòng)的必須基因，另一部分可以被外源基因取代而不會(huì)影響到噬菌體的正常功能。會(huì)影響到噬菌體的正常功能。第47頁(yè)/共81頁(yè) 噬菌體的頭部外殼蛋白對(duì)噬菌體的頭部外殼蛋白對(duì)DNA分子的包裝與分子的包裝與DNA內(nèi)部的序列無(wú)內(nèi)部的序列無(wú)關(guān)，只識(shí)別兩個(gè)關(guān)，只識(shí)別兩個(gè)cos位點(diǎn)，同時(shí)對(duì)位點(diǎn)，同時(shí)對(duì)包裝的包裝的DNA分子的大小有嚴(yán)格的分子的大小有嚴(yán)格的要求：其包裝范圍為要求：其包裝范圍為 DNA 總長(zhǎng)總長(zhǎng)的的75% 105%，即，即36.4kb 50.9kb.第48頁(yè)/共81頁(yè)2.

31、DNA載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建（1）縮短野生型）縮短野生型 DNA的長(zhǎng)度，提高外源的長(zhǎng)度，提高外源DNA的裝的裝載量。即在不影響其體內(nèi)復(fù)制、裂解及包裝功能的載量。即在不影響其體內(nèi)復(fù)制、裂解及包裝功能的前提下盡量縮小其分子長(zhǎng)度；前提下盡量縮小其分子長(zhǎng)度；（2）刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)，引入單一的酶切位點(diǎn)；）刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)，引入單一的酶切位點(diǎn)；（3）滅活一些與裂解周期有關(guān)的基因，使）滅活一些與裂解周期有關(guān)的基因，使 DNA載載體只能在特殊的條件下感染裂解宿主菌，以避免可體只能在特殊的條件下感染裂解宿主菌，以避免可能出現(xiàn)的生物污染；能出現(xiàn)的生物污染；（4）引入合適的選擇標(biāo)記基因，便于重組噬菌體的）引入合適

32、的選擇標(biāo)記基因，便于重組噬菌體的檢測(cè)。檢測(cè)。第49頁(yè)/共81頁(yè)（1） 插入型載體（插入型載體（Insertion vectors ） selecting recombinant phage via insertional inactivation of the cI genecI+cI-Lysogenic cycleLytic cycleclear plaquescloudy plaques 噬菌體載體的分類及用途噬菌體載體的分類及用途第50頁(yè)/共81頁(yè)（1） Insertion vectorsLambda gt10 Lambda gt10 was designed for the cloni

33、ng of relatively short DNA fragments, especially cDNA. The vector accepts EcoRI ended fragments up to 7.6 kb. Insertion of the DNA inactivates the lambda repressor (gene i434) resulting in clear plaques. b527 is a deletion of part of the Lambda genome. A . J are structural genes. 第51頁(yè)/共81頁(yè)（1） Insert

34、ion vectorsLambda gt11 Lambda gt11 can accept fragments up to 7.2 kb in length in a unique EcoRI site near the end of the E. coli LacZ gene. This allows production of fusion proteins from the Lac promoter. Recombinant phage can then be distinguished by detection of the product of the cloned DNA usin

35、g antibodies and also by detecting the inactivation of the LacZ gene on plates containing X-Gal/IPTG. nin5 is a deletion of the Lambda genome.第52頁(yè)/共81頁(yè)（1） Insertion vectorsLambda ZAP This vector was designed to construct cDNA libraries. It can accept up to 10 kb of foreign DNA in one of six unique c

36、loning sites. Cloning in these sites results in insertional inactivation of LacZ allowing detection on X-Gal/IPTG plates. It also allows expression of the protein product under control of the Lac promoter and detection by specific antibodies. 第53頁(yè)/共81頁(yè)(續(xù)上一頁(yè)續(xù)上一頁(yè)) The vector contains the pBluescript p

37、lasmid, allowing strand-specific transcription of insert DNA. A more important feature, however, is that the pBluescript plasmid insert is flanked on one side by the initiator region of phage f1 promoter, and on the other side by the terminator region of the f1 promoter. This means that the pBluescr

38、ipt plasmid, complete with insert, can be excised and packaged by superinfection(雙重感染雙重感染) with phage f1. This can then be transferred to a suitable host E. coli strain where the plasmid is maintained and can be used for sequencing. This automatic subcloning greatly speeds up the acquisition of a se

39、quence from a clone in a gene library.第54頁(yè)/共81頁(yè)（2）取代型載體（取代型載體（Replacement vectors）第55頁(yè)/共81頁(yè)2. 噬菌體載體噬菌體載體（2）取代型載體（取代型載體（Replacement vectors） Another approach to the construction of vectors from phage Lambda is to cut out a portion of the DNA by virtue of （依靠）（依靠）a pair of restriction sites. The 49 kb

40、 Lambda genome can lose 40 % of its content which can be replaced by foreign DNA. This means that inserts of up to 20-25 kb can be cloned. These vectors are particularly useful for making gene libraries from mammalian sources. 第56頁(yè)/共81頁(yè) When such a vector is cut by a restriction endonuclease, a stuf

41、fer fragment is removed, leaving right and left arms. The stuffer is usually removed by alcohol precipitation and the arms attached to a foreign DNA insert prepared using the same restriction endonuclease. Lambda DNA has cohesive ends. These can attach to each other to form the cos site of a concato

42、mer. This polymeric molecule can then be packaged into phage using an in vitro packaging system. In order to be packaged, the distance between the cos sites must be greater than 40 kb and less than 52 kb.續(xù)前一頁(yè)續(xù)前一頁(yè)第57頁(yè)/共81頁(yè)（2） （Replacement vectors）EMBL 3 and 4 Lambda EMBL vectors are useful for clonin

43、g inserts from 9 to 23 kb in length. Polylinkers are present either side of the stuffer fragment. The order of the cloning sites in the polylinker in EMBL 3 is reversed in EMBL 4. Double digestion of the vector with, in the case of EMBL 3, EcoRI and BamHI prevents the re-association of the stufferf

44、r a g m e n t (carrying EcoRI ends) with the arms (carrying BamHI ends).第58頁(yè)/共81頁(yè)二二 噬菌體載體噬菌體載體（phage vectors）1、 噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性2、 噬菌體載體噬菌體載體3、M13噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性4、M13噬菌體載體噬菌體載體第59頁(yè)/共81頁(yè)3. M13噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性 M13是線狀的大腸桿菌噬菌體是線狀的大腸桿菌噬菌體，顆粒內(nèi)含有，顆粒內(nèi)含有6047個(gè)個(gè)核苷酸的閉合環(huán)狀單鏈核苷酸的閉合環(huán)狀單鏈DNA基因組，其基因組，其單鏈的基因組單鏈的

45、基因組DNA經(jīng)改造后可作為單鏈的經(jīng)改造后可作為單鏈的DNA載體。載體。 因?yàn)橐驗(yàn)镸13單鏈單鏈DNA的的復(fù)制型復(fù)制型（RF，replicative form）是是呈雙鏈環(huán)形呈雙鏈環(huán)形，此時(shí)的，此時(shí)的DNA可以象質(zhì)?？梢韵筚|(zhì)粒DNA一樣進(jìn)行一樣進(jìn)行提取和體外操作。不論是雙鏈還是單鏈的提取和體外操作。不論是雙鏈還是單鏈的M13 DNA均均能感染寄主細(xì)胞。而且能感染寄主細(xì)胞。而且M13的顆粒不受包裝的限制的顆粒不受包裝的限制，根，根據(jù)據(jù)DNA的多寡其噬菌體的顆?？纱罂尚　５亩喙哑涫删w的顆?？纱罂尚?。 M13噬菌體將噬菌體將DNA正鏈注入寄主細(xì)胞后與單鏈正鏈注入寄主細(xì)胞后與單鏈DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合，

46、隨后以小結(jié)合蛋白結(jié)合，隨后以小RNA鏈為引物合成負(fù)鏈而轉(zhuǎn)變鏈為引物合成負(fù)鏈而轉(zhuǎn)變成成RF。第60頁(yè)/共81頁(yè) 正鏈和負(fù)鏈出現(xiàn)不對(duì)稱性積累：正鏈和負(fù)鏈出現(xiàn)不對(duì)稱性積累：當(dāng)當(dāng)RF積累到積累到100-200個(gè)拷貝后，噬菌體個(gè)拷貝后，噬菌體DNA編碼的正鏈特異結(jié)合蛋白很編碼的正鏈特異結(jié)合蛋白很快就阻止了負(fù)鏈的進(jìn)一步生成，但以負(fù)鏈為模板的正鏈快就阻止了負(fù)鏈的進(jìn)一步生成，但以負(fù)鏈為模板的正鏈合成并未受到影響。大量游離的正鏈合成并未受到影響。大量游離的正鏈DNA很快參入到很快參入到外殼蛋白中形成大量新的噬菌體顆粒。外殼蛋白中形成大量新的噬菌體顆粒。 新組裝的噬菌體顆粒新組裝的噬菌體顆粒并不會(huì)發(fā)生溶菌現(xiàn)象并不

47、會(huì)發(fā)生溶菌現(xiàn)象，只是從，只是從寄主細(xì)胞中擠壓出去。但噬菌體的大量繁殖也干擾了寄寄主細(xì)胞中擠壓出去。但噬菌體的大量繁殖也干擾了寄主細(xì)菌的正常生長(zhǎng)，所以仍可產(chǎn)生主細(xì)菌的正常生長(zhǎng)，所以仍可產(chǎn)生模糊的噬菌斑模糊的噬菌斑。 在在M13基因組中有一段基因組中有一段507bp的基因間隔區(qū)的基因間隔區(qū)，該區(qū)，該區(qū)可以接受外源可以接受外源DNA的插入而不會(huì)影響到噬菌體的活力。的插入而不會(huì)影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體能用于單鏈這是該噬菌體能用于單鏈DNA載體的重要前提。載體的重要前提。3. M13噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性第61頁(yè)/共81頁(yè)3. M13噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性 SS RF

48、 1-1RF RF 1-20RF SS 20以上以上The typical life cycle of M13The typical life cycle of M13第62頁(yè)/共81頁(yè)二二 噬菌體載體噬菌體載體（phage vectors）1、 噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性2、 噬菌體載體噬菌體載體3、M13噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體的生物學(xué)特性4、M13噬菌體載體噬菌體載體第63頁(yè)/共81頁(yè)4. M13噬菌體載體噬菌體載體 后表現(xiàn)不穩(wěn)定，在噬菌體后表現(xiàn)不穩(wěn)定，在噬菌體增殖過(guò)程中容易發(fā)生缺失。增殖過(guò)程中容易發(fā)生缺失。所以所以一般克隆的片段在一般克隆的片段在1kb之內(nèi)之內(nèi)，克隆，克隆30

49、0-400bp的片的片段十分穩(wěn)定。段十分穩(wěn)定。 載體中含有載體中含有LacZ基因及基因及位于其中的多克隆位點(diǎn)，所位于其中的多克隆位點(diǎn)，所以以能通過(guò)能通過(guò) 互補(bǔ)在互補(bǔ)在X-Gal/ IPTG平板上平板上識(shí)別重組體識(shí)別重組體。這類載體包括了這類載體包括了 M13mp8、9 和和 M13mp18 、 19等。等。 這類載體的這類載體的突出優(yōu)點(diǎn)突出優(yōu)點(diǎn)在于其既可以提供單鏈在于其既可以提供單鏈DNA，也可，也可以提供雙鏈的以提供雙鏈的DNA。其。其最大的不足在于最大的不足在于插入大的插入大的DNA片段片段第64頁(yè)/共81頁(yè)第二節(jié)第二節(jié) 基因克隆的載體基因克隆的載體引引 言（言（introduction）

50、一一 質(zhì)粒載體（質(zhì)粒載體（plasimid vectors）二二 噬菌體載體（噬菌體載體（phage vectors）三三 柯斯質(zhì)粒載體（柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors） 第65頁(yè)/共81頁(yè)三三 柯斯質(zhì)粒載體（柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors）柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn) 柯斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有柯斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有 DNA的的cos序序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體，列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體，cosmid是是cos site carrying plasmid的縮寫(xiě)。的縮寫(xiě)?？滤官|(zhì)粒的大小為柯斯質(zhì)粒的大小為4-6kb，由由3部分組成：部分

51、組成： A.多克隆位點(diǎn)區(qū)多克隆位點(diǎn)區(qū) B. 含有含有cos位點(diǎn)的位點(diǎn)的 DNA區(qū)區(qū) C. 復(fù)制起始位點(diǎn)和抗性標(biāo)記區(qū)復(fù)制起始位點(diǎn)和抗性標(biāo)記區(qū)pHC79OriMarkerMCScos DNA第66頁(yè)/共81頁(yè)三三 柯斯質(zhì)粒載體（柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors）柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)1 1、具有、具有 噬菌體的特性噬菌體的特性 柯斯質(zhì)粒連接上適宜長(zhǎng)度的外柯斯質(zhì)粒連接上適宜長(zhǎng)度的外源源DNADNA后可以在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)寄主后可以在體外包裝成噬菌體顆粒，并能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)寄主細(xì)胞。進(jìn)入寄主細(xì)胞的細(xì)胞。進(jìn)入寄主細(xì)胞的DNADNA也能環(huán)化和復(fù)制，但是不會(huì)形成也能環(huán)化和

52、復(fù)制，但是不會(huì)形成新的噬菌體顆粒，也不能發(fā)生溶菌現(xiàn)象。新的噬菌體顆粒，也不能發(fā)生溶菌現(xiàn)象。2 2、具有質(zhì)粒載體的特性、具有質(zhì)粒載體的特性 能象質(zhì)粒一樣在寄主細(xì)胞內(nèi)復(fù)能象質(zhì)粒一樣在寄主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，且?guī)в锌剐赃x擇標(biāo)記基因，有些還帶有插入失活型的多制，且?guī)в锌剐赃x擇標(biāo)記基因，有些還帶有插入失活型的多克隆位點(diǎn)，為重組體的篩選提供了方便?？寺∥稽c(diǎn)，為重組體的篩選提供了方便。3 3、高容量的克隆能力、高容量的克隆能力 coscos質(zhì)粒本身很小，只有復(fù)制起質(zhì)粒本身很小，只有復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記和點(diǎn)、選擇標(biāo)記和coscos位點(diǎn)等構(gòu)成，所以其克隆上限可達(dá)位點(diǎn)等構(gòu)成，所以其克隆上限可達(dá)45kb45kb左右。不過(guò)由于

53、包裝的限制，其克隆片段至少要達(dá)到左右。不過(guò)由于包裝的限制，其克隆片段至少要達(dá)到30kb30kb。第67頁(yè)/共81頁(yè)三三 柯斯質(zhì)粒載體（柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectors）柯斯質(zhì)粒載體的應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體的應(yīng)用 噬菌體的位點(diǎn)特異切割體系噬菌體的位點(diǎn)特異切割體系末端酶（末端酶（terminase）體系要求兩個(gè)）體系要求兩個(gè)cos位點(diǎn)間要保持位點(diǎn)間要保持38-54kb的距離。的距離。 下面的操作中缺點(diǎn)是：下面的操作中缺點(diǎn)是：cosmid自我重組、外源自我重組、外源DNA片段串聯(lián)片段串聯(lián) 后重組。后重組。OriMarkerMCScos DNA第68頁(yè)/共81頁(yè)三三 柯斯質(zhì)粒載體（柯斯質(zhì)粒載體（c

54、osmid vectors）柯斯質(zhì)粒載體的應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體的應(yīng)用19811981年，年，Ish-HorowicsIsh-Horowics和和BurkeBurke設(shè)計(jì)了一種特設(shè)計(jì)了一種特殊的克隆方案，在所用殊的克隆方案，在所用的質(zhì)粒上的的質(zhì)粒上的BamBamHIHI位點(diǎn)位點(diǎn)的兩側(cè)各有一個(gè)的兩側(cè)各有一個(gè)EcoEcoRIRI位點(diǎn)包圍著。這樣在位點(diǎn)包圍著。這樣在BamBamHIHI位點(diǎn)克隆的位點(diǎn)克隆的DNADNA片片段可以用段可以用EcoEcoRIRI重新切重新切割下來(lái)。割下來(lái)。cosHindIIIBamHISal ISal IHindIII磷酸化酶磷酸化酶Sal IBamHIBamHIHindIIIBamHIBamHISal IHindIIISau 3A磷酸磷酸 化酶化酶32-47 kb第69頁(yè)/共81頁(yè)小