重組克隆的篩選與鑒定

1、第七章第七章 重組克隆的篩選和鑒定重組克隆的篩選和鑒定n內(nèi)容提要內(nèi)容提要n第一節(jié)第一節(jié) 載體表型選擇法載體表型選擇法n第二節(jié)第二節(jié) DNA電泳檢測法電泳檢測法n第三節(jié)第三節(jié) 核酸雜交檢測法核酸雜交檢測法n第四節(jié)第四節(jié) 免疫化學(xué)檢測法免疫化學(xué)檢測法n第五節(jié)第五節(jié) 轉(zhuǎn)譯篩選法轉(zhuǎn)譯篩選法n第六節(jié)第六節(jié) 真核重組基因的選擇方法真核重組基因的選擇方法一般克隆與篩選策略一般克隆與篩選策略第一節(jié)第一節(jié) 載體表型選擇法載體表型選擇法n根據(jù)載體提供的表型進行選擇的方法：根據(jù)載體提供的表型進行選擇的方法：n抗生素抗性基因的插入失活選擇法抗生素抗性基因的插入失活選擇法n -半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)選擇法半乳糖苷酶的顯色

2、反應(yīng)選擇法一般原理一般原理n一種利用一種利用抗生素抗性基因抗生素抗性基因或或其他基因其他基因的的插入失活，來篩選重組子的方法。插入失活，來篩選重組子的方法。n通常外源通常外源DNA插入的位點設(shè)計在特定基插入的位點設(shè)計在特定基因上，一旦外源因上，一旦外源DNA插入，該基因就被插入，該基因就被破壞而失去活性。由此來判斷載體上是破壞而失去活性。由此來判斷載體上是否帶有外源否帶有外源DNA。一、插入失活法的原理一、插入失活法的原理二、利用抗生素抗性基因：二、利用抗生素抗性基因：pBR322n以以pBR322為例，說明利用抗生素抗性基因的為例，說明利用抗生素抗性基因的插入失活的原理。插入失活的原理。1.

3、 原理原理n在在pBR322上有多個單一的限制酶位點，如上有多個單一的限制酶位點，如BamH I位點，恰好在一個四環(huán)素抗性基因內(nèi)。位點，恰好在一個四環(huán)素抗性基因內(nèi)。如果有外源如果有外源DNA插入插入BamH I位點，那么涉及位點，那么涉及四環(huán)素抗性的基因就損壞，因此，帶有重組四環(huán)素抗性的基因就損壞，因此，帶有重組pBR322質(zhì)粒的細(xì)胞，仍對氨芐青霉素有抗性，質(zhì)粒的細(xì)胞，仍對氨芐青霉素有抗性，但對四環(huán)素的抗性消失（敏感）。但對四環(huán)素的抗性消失（敏感）。2. 篩選的方法篩選的方法n轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素的固體培轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，并培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)。養(yǎng)基上，并培養(yǎng)至菌落

4、出現(xiàn)。n用一個牙簽接觸培養(yǎng)基的表面，將沾有不用一個牙簽接觸培養(yǎng)基的表面，將沾有不同菌落的牙簽，放到另一含有四環(huán)素的固體同菌落的牙簽，放到另一含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基表面接觸一下。培養(yǎng)基表面接觸一下。n適溫培養(yǎng)，有的克隆生長，有的不生長。適溫培養(yǎng)，有的克隆生長，有的不生長。n根據(jù)不會生長的位置，再回到帶氨芐的培根據(jù)不會生長的位置，再回到帶氨芐的培養(yǎng)基上去找那些原始的克隆。養(yǎng)基上去找那些原始的克隆。n這些克隆因為喪失了對四環(huán)素的抗性，就這些克隆因為喪失了對四環(huán)素的抗性，就是含有重組是含有重組pBR322質(zhì)粒的重組子。質(zhì)粒的重組子。圖圖 pBR322的結(jié)構(gòu)圖的結(jié)構(gòu)圖3. 抗菌素標(biāo)記的選擇抗菌素標(biāo)記的選

5、擇（1）Ampr 氨芐青霉素抗性基因氨芐青霉素抗性基因n產(chǎn)生產(chǎn)生 -內(nèi)酰胺酶。酶使氨芐青霉素變?yōu)榍嗝箖?nèi)酰胺酶。酶使氨芐青霉素變?yōu)榍嗝雇?。青霉酮酸使藍灰色的酮酸。青霉酮酸使藍灰色的碘碘-青霉素指示液青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）褪色褪色。nAmpr有有Pst I、Sca I等多個插入位點。等多個插入位點。（2）四環(huán)素）四環(huán)素n抑制細(xì)菌生長，但不殺死細(xì)菌。抑制細(xì)菌生長，但不殺死細(xì)菌。（3）環(huán)絲氨酸）環(huán)絲氨酸n殺死生長的細(xì)菌，但不殺停止生長的細(xì)菌。殺死生長的細(xì)菌，但不殺停止生長的細(xì)菌。4. 選擇的過程選擇的過程（1）四環(huán)素抗性插入失活）四環(huán)素抗性插入失活n如果在如果在Tetr上

6、上插入外源插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用素抗性基因失活，可用四環(huán)素環(huán)絲氨四環(huán)素環(huán)絲氨酸酸的平板，選擇重組克隆。的平板，選擇重組克隆。nTetr插入失活的細(xì)菌，其生長可被四環(huán)插入失活的細(xì)菌，其生長可被四環(huán)素素抑制抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來；，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來； nTetr不失活的細(xì)菌，能抗四環(huán)素，正常不失活的細(xì)菌，能抗四環(huán)素，正常生長，但可被環(huán)絲氨酸殺死。生長，但可被環(huán)絲氨酸殺死。無環(huán)絲氨酸無環(huán)絲氨酸圖圖 四環(huán)素抗性插入失活四環(huán)素抗性插入失活重組克隆重組克?。?）氨芐青霉素抗性插入失活）氨芐青霉素抗性插入失活n氨芐青霉素抗性基因編碼產(chǎn)生氨芐青霉素抗性基因編

7、碼產(chǎn)生 -內(nèi)酰胺內(nèi)酰胺酶。酶使氨芐青霉素變?yōu)榍嗝雇?。青酶。酶使氨芐青霉素變?yōu)榍嗝雇?。青霉酮酸使霉酮酸使藍灰色藍灰色的碘的碘-青霉素指示液青霉素指示液褪褪色色。n如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，就不能使碘青霉素抗性基因失活，就不能使碘-青青霉素指示液褪色霉素指示液褪色-呈呈藍灰色。藍灰色。據(jù)此選擇據(jù)此選擇陽性克隆陽性克隆。圖圖 氨芐青霉素抗性插入失活氨芐青霉素抗性插入失活三、利用三、利用 -半乳糖苷酶顯色半乳糖苷酶顯色n選擇重組子的原理選擇重組子的原理1. -半乳糖苷酶與半乳糖苷酶與Lac Z基因基因n由由E.coli lac操縱子上的操縱子上

8、的Lac Z基因編碼。基因編碼。分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。2. Lac Z 基因基因n突變的突變的Lac Z基因，只編碼基因，只編碼 -半乳糖苷半乳糖苷酶的酶的部分肽段部分肽段（氨基端）（氨基端） 。2. 培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中IPTG、X-gal 的作用的作用（1）IPTG作用作用n異丙基硫代異丙基硫代-D-半乳糖苷是誘導(dǎo)物，可誘導(dǎo)半乳糖苷是誘導(dǎo)物，可誘導(dǎo)lacZ 基因的表達基因的表達 -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。（2）X-gal作用作用n5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚- -D-半乳糖苷。作為半乳糖苷。作為 -半乳半乳糖苷酶水解的底物。糖苷酶水解的底物。（3）X-ga

9、l的顯色反應(yīng)的顯色反應(yīng)n-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 (四聚體四聚體)將將X-gal水解成半乳糖水解成半乳糖苷和苷和藍色藍色的吲哚衍生物的吲哚衍生物(靛藍靛藍) 。在。在4藍色加藍色加深。深。n -互補作用是互補作用是pUC質(zhì)粒質(zhì)粒載體載體的特性。的特性。npUC載體：載體：含有含有Lac Z 基因，編碼基因，編碼 -半乳糖苷半乳糖苷酶的部分肽段（酶的部分肽段（ 片段，氨基端）片段，氨基端） 。n受體菌：受體菌：基因組中帶有基因組中帶有突變的突變的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因（缺失基因（缺失 片段），可被片段），可被IPTG誘導(dǎo)表達誘導(dǎo)表達（只編碼（只編碼 -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 -肽）。肽）。

10、 n載體和受體菌基因組互補：載體和受體菌基因組互補：只有當(dāng)受體菌吸只有當(dāng)受體菌吸收了帶有收了帶有LacZ 基因的基因的 pUC質(zhì)粒，才能合成質(zhì)粒，才能合成完整的有活性的完整的有活性的 -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。3. -互補作用互補作用n氨芐青霉素抗性基因氨芐青霉素抗性基因nLac Z 基因：編碼基因：編碼 -半乳糖苷酶的部分半乳糖苷酶的部分肽段。肽段。nLac Z 上有插入外源上有插入外源DNA的的MCS位點。位點。 pUC18/19的結(jié)構(gòu)圖的結(jié)構(gòu)圖n利用藍白斑法篩選利用藍白斑法篩選pUC8/9重組子，是重組子，是一種直接檢測一種直接檢測 -半乳糖苷酶活性的方法。半乳糖苷酶活性的方法。n先將轉(zhuǎn)

11、化子涂于含有氨芐青霉素的培先將轉(zhuǎn)化子涂于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基，能合成養(yǎng)基，能合成 -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。n然后再通過檢測然后再通過檢測 -半乳糖苷酶的活性，半乳糖苷酶的活性，來選擇重組子，如果既能抗氨芐青霉素，來選擇重組子，如果既能抗氨芐青霉素，又能合成又能合成 -半乳糖苷酶的細(xì)胞，就是重半乳糖苷酶的細(xì)胞，就是重組子細(xì)胞。組子細(xì)胞。4. 篩選的方法：藍白斑法篩選的方法：藍白斑法n -半乳糖苷酶分解半乳糖苷酶分解X-gal的顯色反應(yīng)很的顯色反應(yīng)很靈敏。當(dāng)在含有氨卡青霉素、靈敏。當(dāng)在含有氨卡青霉素、X-gal、IPDG的培養(yǎng)基中，那些能合成完整的的培養(yǎng)基中，那些能合成完整的 -半乳糖苷酶的非

12、重組子克隆，會因它半乳糖苷酶的非重組子克隆，會因它能分解能分解X-gal而變成藍色；而變成藍色；而重組子而重組子克隆因克隆因Lac Z 基因被破壞，不能合成完基因被破壞，不能合成完整的整的 -半乳糖苷酶，故不能分解半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而而呈白色。呈白色。5. 選擇培養(yǎng)的原理選擇培養(yǎng)的原理n在含有在含有X-gal 和和IPTG 的選擇培養(yǎng)基上，的選擇培養(yǎng)基上，載體上載體上沒有沒有插入片段的轉(zhuǎn)化子為插入片段的轉(zhuǎn)化子為藍色藍色菌菌落，而落，而攜帶攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為為白色白色菌落。菌落。n平板平板37培養(yǎng)后，放于冰箱培養(yǎng)后，放于冰箱3-4 小時，小時，可

13、使顯色反應(yīng)充分，菌落為藍色?？墒癸@色反應(yīng)充分，菌落為藍色。圖圖 -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)半乳糖苷酶顯色反應(yīng)* - -半乳半乳糖苷酶糖苷酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖X-gal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛藍氯靛藍+藍色藍色圖圖 LacZ 插入外源插入外源DNA圖圖 白色菌落與藍色菌落的挑選白色菌落與藍色菌落的挑選四、四、pBS重組質(zhì)粒的篩選實驗重組質(zhì)粒的篩選實驗n使用的載體為使用的載體為pBS質(zhì)粒。質(zhì)粒。n轉(zhuǎn)化受體菌為轉(zhuǎn)化受體菌為E. coli DH5菌株。菌株。n由于由于pBS上帶有上帶有Ampr 和和lacZ 基因，故基因，故重組子的篩選采用重組子的篩選采用Amp 抗性篩選與抗性篩選與-

14、互補現(xiàn)象篩選互補現(xiàn)象篩選相結(jié)合的方法。相結(jié)合的方法。載體載體n-供體供體為羧基末端缺失的為羧基末端缺失的-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。如如pUC、pGEM系列載體。系列載體。菌株菌株n-受體受體為氨末端缺失的為氨末端缺失的-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。如如DH5(LacZM15)、JM101110(LacZM15)等。等。1. 抗性篩選抗性篩選n因因pBS質(zhì)粒帶有質(zhì)粒帶有Ampr 基因，而外源基因，而外源DNA片段上不帶該基因，故轉(zhuǎn)化受體菌片段上不帶該基因，故轉(zhuǎn)化受體菌后，只有帶有后，只有帶有pBS DNA 的轉(zhuǎn)化子，才的轉(zhuǎn)化子，才能在含有能在含有Amp 的的LB 平板上存活下來；平板上存活下來；而只

15、帶有自身環(huán)化的外源而只帶有自身環(huán)化的外源DNA片段的轉(zhuǎn)片段的轉(zhuǎn)化子則不能存活。此為初步的抗性篩選?；觿t不能存活。此為初步的抗性篩選。2. lacZ 基因的插入失活基因的插入失活npBS質(zhì)粒上帶有質(zhì)粒上帶有-半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的調(diào)調(diào)控序列和控序列和-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N 端端146 個氨基個氨基酸的編碼序列酸的編碼序列。該編碼區(qū)有一個多克隆。該編碼區(qū)有一個多克隆位點，但并不破壞位點，但并不破壞lacZ 的閱讀框架，不的閱讀框架，不影響其正常功能。影響其正常功能。3. DH5菌株菌株nE. coli DH5菌株帶有菌株帶有-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端的部分編碼序列。端的部分編碼序

16、列。n在各自獨立的情況下，在各自獨立的情況下，pBS 和和DH5編編碼的碼的-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在但在pBS 和和DH5融為一體時，可形成融為一體時，可形成具有具有-半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。4. -互補現(xiàn)象互補現(xiàn)象nlacZ 基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半半乳糖苷酶陰性突變體之間實現(xiàn)互補的現(xiàn)乳糖苷酶陰性突變體之間實現(xiàn)互補的現(xiàn)象。象。n由由-互補產(chǎn)生的互補產(chǎn)生的Lac+ 細(xì)菌較易識別，細(xì)菌較易識別，它在生色底物它在生色底物X-gal 存

17、在下，被存在下，被IPTG 誘導(dǎo)，形成誘導(dǎo)，形成藍色菌落藍色菌落。n當(dāng)外源當(dāng)外源DNA片段插入到片段插入到pBS 質(zhì)粒的多克質(zhì)粒的多克隆位點后，導(dǎo)致讀碼框架改變，表達蛋隆位點后，導(dǎo)致讀碼框架改變，表達蛋白失活，產(chǎn)生的肽段失去白失活，產(chǎn)生的肽段失去-互補能力?；パa能力。因此，在同樣條件下，含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)因此，在同樣條件下，含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，只能形成化子，在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，只能形成白色菌落白色菌落。互補作用互補作用/現(xiàn)象現(xiàn)象n當(dāng)當(dāng)pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LacZ基因的氨基未端基因的氨基未端編碼序列缺失的編碼序列缺失的Lac- 指示菌株時，能恢指示菌株時，能恢復(fù)復(fù)-半乳糖苷酶活

18、性，從而在含半乳糖苷酶活性，從而在含IPTG和和X-gal的平板上，分解的平板上，分解X-gal成成5-溴溴-4-氯靛藍，出現(xiàn)氯靛藍，出現(xiàn)藍色菌落藍色菌落的現(xiàn)象。的現(xiàn)象。n當(dāng)外源當(dāng)外源DNA插入插入pUC的的MCS時，時，-互互補作用被破壞，在補作用被破壞，在IPTG和和X-gal平板上平板上則不顯藍色而出現(xiàn)則不顯藍色而出現(xiàn)白色菌落白色菌落。第三節(jié)第三節(jié) DNA電泳檢測法電泳檢測法 PFGEn從轉(zhuǎn)化后的克?。ㄞD(zhuǎn)化子）中快速抽提從轉(zhuǎn)化后的克?。ㄞD(zhuǎn)化子）中快速抽提重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳比較其分子重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳比較其分子量大小。量大小。n插入外源插入外源DNA的重組質(zhì)粒分子量大，沒的重組

19、質(zhì)粒分子量大，沒有插入外源有插入外源DNA的質(zhì)粒分子量小。的質(zhì)粒分子量小。n比較不同質(zhì)粒在凝膠中的遷移率，遷移比較不同質(zhì)粒在凝膠中的遷移率，遷移快慢不同，即可選出重組子。快慢不同，即可選出重組子。一、直接電泳檢測法一、直接電泳檢測法Marker載體載體重組重組圖圖 瓊脂糖凝膠電泳圖譜的比較瓊脂糖凝膠電泳圖譜的比較已知已知未知未知二、酶切產(chǎn)物電泳篩選法二、酶切產(chǎn)物電泳篩選法n1. 原理原理n根據(jù)已知的外源根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切圖譜，選擇圖譜，選擇12種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后泳后比較比較DNA帶數(shù)和長度。帶數(shù)和長度。n或用一種內(nèi)切酶切下插入片段，再

20、用另或用一種內(nèi)切酶切下插入片段，再用另一種酶酶切這個片段，電泳后一種酶酶切這個片段，電泳后比較兩者比較兩者是否符合預(yù)計的結(jié)果是否符合預(yù)計的結(jié)果。圖圖 酶切產(chǎn)物的電泳篩選酶切產(chǎn)物的電泳篩選圖圖 限制性內(nèi)切酶酶切圖譜限制性內(nèi)切酶酶切圖譜圖圖 表型篩選加酶切篩選表型篩選加酶切篩選nAATTAATT三、三、PCR擴增檢測法擴增檢測法1. 原理原理n在模板序列上擴增出預(yù)期在模板序列上擴增出預(yù)期DNA片斷。片斷。2. 過程過程（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。）。（2）用插入的）用插入的DNA片段的引物作片段的引物作PCR。（3）PCR產(chǎn)物電泳檢查。產(chǎn)物電泳檢查。（4）PC

21、R產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致。產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致。第四節(jié)第四節(jié) 核酸的分子雜交核酸的分子雜交n核酸雜交技術(shù)由核酸雜交技術(shù)由Hall、Nygaard等于等于70年代建立，應(yīng)用年代建立，應(yīng)用DNA或或RNA探針，探針，與與靶序列在溶液中雜交，靶序列在溶液中雜交，檢測固定在硝酸檢測固定在硝酸纖維素（纖維素（NC）膜上的核酸序列的技術(shù)。）膜上的核酸序列的技術(shù)。n核酸雜交法利用標(biāo)記的核酸探針，與轉(zhuǎn)核酸雜交法利用標(biāo)記的核酸探針，與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的化細(xì)胞的DNA進行雜交，可以直接篩選進行雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。和鑒定目的序列克隆。n常用的方法：將轉(zhuǎn)化后生長的菌落，復(fù)常用的方法：將轉(zhuǎn)化后生

22、長的菌落，復(fù)印到硝酸纖維膜上，再用堿裂細(xì)菌菌落，印到硝酸纖維膜上，再用堿裂細(xì)菌菌落，釋放的釋放的DNA就吸附在膜上，再與標(biāo)記的就吸附在膜上，再與標(biāo)記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結(jié)合在核酸探針溫育雜交，核酸探針就結(jié)合在含有目的序列的菌落含有目的序列的菌落DNA上。上。n該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因的表達、基因該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因的表達、基因定位、克隆基因的篩選、酶切圖譜的制定位、克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列檢測、遺傳作、基因組中特定基因序列檢測、遺傳病疾病的診斷及生物分類等方面。病疾病的診斷及生物分類等方面。 一、核酸分子雜交的基礎(chǔ)一、核酸分子雜交的基礎(chǔ)1. 變性與退火變性

23、與退火nDNA以雙鏈形式存在，在進行分子雜交以雙鏈形式存在，在進行分子雜交時，先將雙鏈時，先將雙鏈DNA分子解聚為單鏈，這分子解聚為單鏈，這一過程稱為一過程稱為變性變性。n兩條單鏈通過堿基互補，聚合成穩(wěn)定的兩條單鏈通過堿基互補，聚合成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)的過程稱為雙鏈區(qū)的過程稱為退火或復(fù)性退火或復(fù)性。2. 同源序列同源序列n不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補順序，即某種程度的同源定程度的互補順序，即某種程度的同源性，就可形成雜交雙鏈。性，就可形成雜交雙鏈。n分子雜交可在分子雜交可在DNA與與DNA（Southern blot）、）、RNA與與DNA（Nor

24、thern blot）或或RNA與與RNA（In situ）的二條單鏈之）的二條單鏈之間進行。間進行。3. 分子雜交法分子雜交法n分子雜交是通過一定方法，將核酸分子分子雜交是通過一定方法，將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的記的探針探針與被固定的核酸分子雜交，經(jīng)與被固定的核酸分子雜交，經(jīng)顯影后，顯示出目的顯影后，顯示出目的DNA或或RNA所處所處的位置。的位置。n分子雜交就是將一種核酸單鏈用同位素分子雜交就是將一種核酸單鏈用同位素或非同位素標(biāo)記成為探針，再與另一種或非同位素標(biāo)記成為探針，再與另一種核酸單鏈進行雜交。核酸單鏈進行雜交。4. 探針探針n

25、經(jīng)過同位素或非同位素標(biāo)記的已知序列經(jīng)過同位素或非同位素標(biāo)記的已知序列的寡核苷酸。的寡核苷酸。n單一的已知序列的寡核苷酸探針，能與單一的已知序列的寡核苷酸探針，能與它們的目的序列配對，可以準(zhǔn)確地設(shè)計它們的目的序列配對，可以準(zhǔn)確地設(shè)計雜交條件，以保證探針只與目的序列雜雜交條件，以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對序列雜交而不與序列相近的非完全配對序列雜交，對于一些未知序列的目的片段則無交，對于一些未知序列的目的片段則無效。效。5. 雜交的靈敏度和特異性雜交的靈敏度和特異性n核酸分子雜交具有高度的靈敏度和特異核酸分子雜交具有高度的靈敏度和特異性。性。n可以根據(jù)所使用的探針的已知序列，

26、進可以根據(jù)所使用的探針的已知序列，進行特異性的靶序列檢測。行特異性的靶序列檢測。二、探針的類型二、探針的類型n根據(jù)核酸的性質(zhì)，可分為：根據(jù)核酸的性質(zhì)，可分為：nDNA探針、探針、RNA探針、探針、 cDNA探針和寡核酸探針和寡核酸探針。探針。n根據(jù)是否使用放射性標(biāo)記物，可分為：根據(jù)是否使用放射性標(biāo)記物，可分為：n放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針。放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針。n根據(jù)是否存在互補鏈，可分為：根據(jù)是否存在互補鏈，可分為：n單鏈和雙鏈探針。單鏈和雙鏈探針。n根據(jù)放射性標(biāo)記物摻入情況，可分為：根據(jù)放射性標(biāo)記物摻入情況，可分為：n均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針。均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針。1.

27、雙鏈雙鏈DNA探針探針n雙鏈雙鏈DNA探針的合成方法探針的合成方法n主要有兩種：主要有兩種：n切口平移法。切口平移法。n隨機引物合成法。隨機引物合成法。2. 單鏈單鏈DNA探針探針n單鏈單鏈DNA探針主要有兩種合成方法探針主要有兩種合成方法:n以以M13載體衍生序列為模板，用載體衍生序列為模板，用Klenow片段合成單鏈探針。片段合成單鏈探針。n以以RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針。探針。3. 末端標(biāo)記末端標(biāo)記DNA探針探針n以以Klenow片段標(biāo)記片段標(biāo)記3末端為例說明末端末端為例說明末端標(biāo)記的方法。標(biāo)記的方法。4. 寡核苷酸探針寡核苷酸探針n利用寡核苷

28、酸探針可檢測到靶基因上單利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。個核苷酸的點突變。n常用的寡核苷酸探針主要有兩種常用的寡核苷酸探針主要有兩種:n單一已知序列的寡核苷酸探針單一已知序列的寡核苷酸探針n許多簡并性寡核苷酸探針組成的寡核苷許多簡并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫。酸探針庫。三、探針的標(biāo)記方法與選擇三、探針的標(biāo)記方法與選擇1. 探針標(biāo)記的方法探針標(biāo)記的方法n缺口平移法缺口平移法nDNA快速末端標(biāo)記快速末端標(biāo)記nT4多核苷酸激酶標(biāo)記多核苷酸激酶標(biāo)記DNA 5末端法末端法n隨機引物延伸法隨機引物延伸法n聚合酶鏈反應(yīng)法。聚合酶鏈反應(yīng)法。2. 標(biāo)記方法的選擇標(biāo)記方法的選擇n根據(jù)實

29、驗的要求如靈敏度和顯示方法等，選根據(jù)實驗的要求如靈敏度和顯示方法等，選擇合適的標(biāo)記方法。擇合適的標(biāo)記方法。 n一般放射性探針比非放射性探針的靈敏度一般放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。高。n在檢測單拷貝基因序列時，應(yīng)選用標(biāo)記效在檢測單拷貝基因序列時，應(yīng)選用標(biāo)記效率高、顯示靈敏的探針標(biāo)記方法。率高、顯示靈敏的探針標(biāo)記方法。n在對靈敏度要求不高時，可采用保存時間在對靈敏度要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術(shù)，或比較穩(wěn)定的堿性磷長的生物素探針技術(shù)，或比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)或過氧化物酶系統(tǒng)。酸酶顯示系統(tǒng)或過氧化物酶系統(tǒng)。四、分子雜交四、分子雜交1.1.常用的核酸雜交方法常用的核酸雜交方

30、法n Southern印跡雜交（印跡雜交（ Southern blot ） n Northern印跡雜交（印跡雜交（Northern blot）n菌落原位雜交（菌落原位雜交（Colony in situ hybridization）n組織原位雜交（組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）等。等。n點雜交（點雜交（Dot blot）2. 分子雜交的分類分子雜交的分類n根據(jù)被測定的對象不同，可分為根據(jù)被測定的對象不同，可分為2大類大類:(1) Southern雜交雜交n被檢對象為被檢對象為DNA，探針為，探針為DNA或或RNA。DNA片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到

31、硝酸纖片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。(2) Northern雜交雜交nRNA片段經(jīng)電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖片段經(jīng)電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜（維濾膜（NC）上，然后用探針雜交。被檢對）上，然后用探針雜交。被檢對象為象為RNA，探針為，探針為DNA或或RNA。五、五、 Southern blot1. Southern雜交或雜交或DNA印跡印跡n1975年由年由Southern創(chuàng)建，稱為創(chuàng)建，稱為Southern印跡印跡技術(shù)。用技術(shù)。用DNA或或RNA探針檢測樣品探針檢測樣品DNA。 2. 特點特點nSout

32、hern雜交用以檢測經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割雜交用以檢測經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列。片段中是否存在與探針同源的序列。n從宿主細(xì)胞中提取基因組從宿主細(xì)胞中提取基因組DNA或質(zhì)粒載體，或質(zhì)粒載體，再用探針雜交。只有插入目的片段的重組體，再用探針雜交。只有插入目的片段的重組體，才能與探針雜交，并在才能與探針雜交，并在X光底片上曝光顯示光底片上曝光顯示印跡。印跡。3. 雜交的方法雜交的方法轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜：n將將DNA樣本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂樣本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變糖凝膠電泳，分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性、性、Tris緩沖液

33、中和、高鹽下通過毛吸作用，緩沖液中和、高鹽下通過毛吸作用，將將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素（從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素（NC）濾）濾膜上，烘干固定后，即可用于雜交。膜上，烘干固定后，即可用于雜交。雜交：雜交：n在一定條件下，探針與同源在一定條件下，探針與同源DNA片段雜交，片段雜交，然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。通過自然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。通過自顯影檢查目的顯影檢查目的DNA所在位置。所在位置。4. 雜交的步驟或程序雜交的步驟或程序n(1) 酶切待測目的酶切待測目的DNA，凝膠電泳分離各酶切，凝膠電泳分離各酶切片段，并使片段，并使DNA原位變性為單鏈。原位變性為單鏈。n(2) 將單

34、鏈將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）濾膜或尼龍膜上。濾膜或尼龍膜上。n(3) 預(yù)雜交濾膜，掩蓋濾膜上非特異性位點。預(yù)雜交濾膜，掩蓋濾膜上非特異性位點。n(4) 讓單鏈的探針與同源讓單鏈的探針與同源DNA片段雜交，漂洗片段雜交，漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。除去非特異性結(jié)合的探針。n(5) 通過自顯影檢測目的通過自顯影檢測目的DNA所在位置。所在位置。Southern雜交雜交 (Southern印跡法印跡法)n將混合在一起的限制性酶切將混合在一起的限制性酶切DNA片段，片段，用瓊脂糖電泳分開，并變性為單鏈用瓊脂糖電泳分開，并變性為單鏈DNA，再轉(zhuǎn)移到一張硝酸纖維素膜上。

35、在膜上再轉(zhuǎn)移到一張硝酸纖維素膜上。在膜上的單鏈的單鏈DNA可用可用32p標(biāo)記的單鏈標(biāo)記的單鏈DNA探探針雜交。再用放射自顯影方法，顯示出針雜交。再用放射自顯影方法，顯示出與探針順序互補的限制性酶切與探針順序互補的限制性酶切DNA片段片段的位置。的位置。n這個方法能將上萬個片段中的某一個特這個方法能將上萬個片段中的某一個特殊的目的片段鑒定出來。殊的目的片段鑒定出來。圖圖 Southern blot圖圖 Southern blot凝膠電泳凝膠電泳底片顯示雜交印跡底片顯示雜交印跡圖圖 Southern印跡印跡六、六、Northern blot1. Northern印跡雜交印跡雜交n對被檢測的對被檢測

36、的RNA進行變性凝膠電泳，以進行變性凝膠電泳，以除去除去RNA中的二級結(jié)構(gòu)，使大小不同的中的二級結(jié)構(gòu)，使大小不同的RNA完全分離。完全分離。n將變性后將變性后RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，然后與探針雜交。酸纖維素膜上，然后與探針雜交。2. 特點特點n用用DNA或或RNA探針檢測探針檢測RNA樣品。樣品。n從宿主細(xì)胞中提取從宿主細(xì)胞中提取RNA，再用探針雜交。，再用探針雜交。主要檢測插入片段是否被轉(zhuǎn)錄。主要檢測插入片段是否被轉(zhuǎn)錄。n用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛變性用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛變性RNA，變性后的變性后的RNA有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝有利于在轉(zhuǎn)印過程中與

37、硝酸纖維素膜結(jié)合，以及保持其單鏈狀態(tài)。酸纖維素膜結(jié)合，以及保持其單鏈狀態(tài)。用用NaOH會水解會水解RNA。七、七、DNA-RNA雜交雜交nDNA-RNA雜交采用雜交采用R-環(huán)檢測法環(huán)檢測法。n選擇過程選擇過程n用用mRNA與重組載體雜交。與重組載體雜交。n在在70%甲酰胺中，甲酰胺中，DNA雙鏈變性，復(fù)雙鏈變性，復(fù)性時，性時，DNA-RNA雜交分子比雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。雙鏈更穩(wěn)定。n電鏡下可見到電鏡下可見到R-環(huán)形結(jié)構(gòu)。環(huán)形結(jié)構(gòu)。圖圖 DNA-RNA雜交（雜交（ R-環(huán)）環(huán)）八、菌落原位雜交八、菌落原位雜交n Colony in situ hybridization1. 雜交的

38、方法雜交的方法n將細(xì)菌從平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。將細(xì)菌從平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。n將濾膜上的菌落原位裂解，以釋出將濾膜上的菌落原位裂解，以釋出DNA。n烘干，將烘干，將DNA固定于膜上。固定于膜上。n與與32P標(biāo)記的探針雜交。標(biāo)記的探針雜交。n平板置于平板置于4，放射自顯影，檢測菌落雜交，放射自顯影，檢測菌落雜交信號（結(jié)果），并與平板上的菌落對應(yīng)。信號（結(jié)果），并與平板上的菌落對應(yīng)。2. 特點特點n對應(yīng)的菌斑對應(yīng)的菌斑(或噬菌斑或噬菌斑)位置不變，可以位置不變，可以直接找出陽性菌落。直接找出陽性菌落。n對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落(200)進行克

39、隆篩選時可采用本法。進行克隆篩選時可采用本法。n將分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落將分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素膜上。個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進行原位裂經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進行原位裂解。解。圖圖 菌落原位雜交菌落原位雜交Colony in situ hybridization九、組織原位雜交九、組織原位雜交nTissue in situ hybridization，簡稱原位，簡稱原位雜交雜交1. 方法方法n組織或細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透組織或細(xì)胞經(jīng)適

40、當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，探針直接進入細(xì)胞內(nèi)與性增加，探針直接進入細(xì)胞內(nèi)與DNA或或RNA雜交。雜交。2. 特點特點n組織的原位雜交與菌落的原位雜交不同，組織的原位雜交與菌落的原位雜交不同，可以確定可以確定探針的互補序列探針的互補序列在細(xì)胞內(nèi)的空在細(xì)胞內(nèi)的空間位置。間位置。n例如，通過與細(xì)胞例如，通過與細(xì)胞RNA的雜交，可分析的雜交，可分析一種一種RNA在細(xì)胞組織中的分布、顯示細(xì)在細(xì)胞組織中的分布、顯示細(xì)胞及病原微生物的存在方式和部位等。胞及病原微生物的存在方式和部位等。 十、斑點雜交十、斑點雜交n斑點雜交是指將斑點雜交是指將DNA或或RNA樣品直接點在硝樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上酸纖維素

41、濾膜上,然后與核酸探針分子雜交然后與核酸探針分子雜交,以以顯示樣品中是否存在特異的顯示樣品中是否存在特異的DNA或或RNA。同。同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,還可以得到半定還可以得到半定量的結(jié)果。所以它是一種簡便、快速、經(jīng)濟量的結(jié)果。所以它是一種簡便、快速、經(jīng)濟的分析的分析DNA或或RNA的方法的方法,在基因分析和基因在基因分析和基因診斷中經(jīng)常用到診斷中經(jīng)常用到,是研究基因表達的有力工具。是研究基因表達的有力工具。但由于目的序列未與非目的序列分離但由于目的序列未與非目的序列分離,不能了不能了解目的序列的長度。尤其在本底干擾較高時解目的序列的長度。尤其在本底干擾較高時,難以

42、區(qū)分目的序列信號和干擾信號。難以區(qū)分目的序列信號和干擾信號。點雜交法（點雜交法（Dot blot）n將被檢測標(biāo)本點到膜上，烘烤固定。將被檢測標(biāo)本點到膜上，烘烤固定。n這種方法耗時短，可做半定量分析，一這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。張膜上可同時檢測多個樣品。n為使點樣準(zhǔn)確方便，有多種多管吸印儀為使點樣準(zhǔn)確方便，有多種多管吸印儀如如Bio-Dot (BioRad ) ，它們有許多孔，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會流到膜上樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀，反復(fù)沖洗進樣孔，呈斑點狀或狹縫狀，反復(fù)沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，取出

43、膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時的膜就可以進行雜交。這時的膜就可以進行雜交。n凝膠中凝膠中DNA片段的相對位置在片段的相對位置在DNA片片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著。段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著。n附著在濾膜上的附著在濾膜上的DNA與與32P標(biāo)記的探針標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補的每條的每條DNA帶的位置，從而可以確定在帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。片段的位置和大小。1. 核酸雜交核酸雜交n重組克隆與探針雜交。重組克隆與探針雜交。2. 檢測用的探針檢測用的探針

44、n與外源與外源DNA插入片段互補的序列。插入片段互補的序列。3. 識別標(biāo)記識別標(biāo)記n（1）放射性同位素：）放射性同位素：32P 或或 125I 。n（2）非放射性標(biāo)記：熒光素）非放射性標(biāo)記：熒光素一、原理一、原理酶切前酶切前酶切后酶切后插入片段插入片段載體載體載體載體 載體載體重組體重組體重組體重組體第五節(jié)第五節(jié) 免疫化學(xué)檢測法免疫化學(xué)檢測法 n對表達產(chǎn)物的檢測。對表達產(chǎn)物的檢測。n蛋白蛋白蛋白蛋白“雜交雜交” n利用抗體作為利用抗體作為“探針探針”，檢測轉(zhuǎn)入受體，檢測轉(zhuǎn)入受體菌并且表達出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。菌并且表達出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。一、放射性抗體檢測法一、放射性抗體檢測法n1.

45、 抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式n根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：待測基因待測基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 標(biāo)記的二標(biāo)記的二 抗結(jié)合蛋白抗結(jié)合蛋白固相支固相支持濾膜持濾膜待測基因待測基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗125I標(biāo)記的二抗標(biāo)記的二抗固相支固相支持濾膜持濾膜待測基因待測基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗固相支固相支持濾膜持濾膜固相支固相支持濾膜持濾膜待測基因待測基因 產(chǎn)物蛋白產(chǎn)物蛋白一抗一抗 二抗二抗125I 標(biāo)記的二抗標(biāo)記的二抗 結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白125I標(biāo)記的二抗標(biāo)記

46、的二抗2. 放射性抗體檢測法過程放射性抗體檢測法過程3. Broome-Gilbert雙位點檢測法雙位點檢測法n檢測融合蛋白檢測融合蛋白n既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物物質(zhì)?；蛸|(zhì)粒基因A插入基因插入基因B表達表達質(zhì)粒蛋白質(zhì)粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B融合蛋白融合蛋白固相支固相支 持濾膜持濾膜抗抗A抗體抗體125I標(biāo)記的標(biāo)記的 抗抗B抗體抗體質(zhì)粒蛋白質(zhì)粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B質(zhì)粒蛋白質(zhì)粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B固相支固相支 持濾膜持濾膜抗抗A抗體抗體發(fā)光，底片曝光發(fā)光，底片曝光二、免疫沉淀檢測法二、免疫沉淀檢測法n1. 原理原理n利用抗原利用抗原抗體

47、凝集反應(yīng)?？贵w凝集反應(yīng)。n用于檢測分泌型產(chǎn)物。用于檢測分泌型產(chǎn)物。n2. 方法方法n把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)插入基因的表達產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到菌落插入基因的表達產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到菌落周圍時，就會與抗體反應(yīng)形成周圍時，就會與抗體反應(yīng)形成“沉淀沉淀圈圈”。n對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體進行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。誘發(fā)）。三、酶聯(lián)免疫吸附測（三、酶聯(lián)免疫吸附測（ELISA）nEnzyme-linked immunosorbant assayn1. 原理原理n一抗（一抗（pri

48、mary antibody） 與目標(biāo)分子的特異結(jié)合與目標(biāo)分子的特異結(jié)合 n二抗（二抗（secondary antibody） 與一抗的特異性結(jié)合與一抗的特異性結(jié)合 n酶連（酶連（enzyme-linke） n 二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強度），通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強度），從而推測目標(biāo)分子的含量。從而推測目標(biāo)分子的含量。待測基因產(chǎn)物蛋白待測基因產(chǎn)物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待測基因產(chǎn)物蛋白待測基因產(chǎn)物蛋白 一抗一抗二抗二抗無色的底物無色

49、的底物有色的產(chǎn)物有色的產(chǎn)物比色觀察酶酶 2. ELISA檢測的一般步驟檢測的一般步驟n（1）固定樣品）固定樣品n將待測樣品加入將待測樣品加入96孔微量滴定板孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就）的孔中，干燥后就被固定在孔底。被固定在孔底?？椎卓椎祝?）一抗結(jié)合）一抗結(jié)合n加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體一抗一抗（3）二抗結(jié)合）二抗結(jié)合n加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識別一抗。二抗沖洗掉。二抗只識別一抗。n二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物

50、酶、脲酶等）?；锩?、脲酶等）。二抗二抗（4）顯色反應(yīng)）顯色反應(yīng)n加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）?；磻?yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。圖圖 ELISA assay（5）比色）比色n在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果。打印出結(jié)果。圖圖 Safire多功能掃描型酶標(biāo)儀多功能掃描型酶標(biāo)儀3.ELISA的局限性的局限性n有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。的特異性）。 n必須與其他方法一起綜合考慮。必須與其他方法一起綜合考慮。n最好用單克隆抗體（最

51、好用單克隆抗體（monoclonal antibody）臨床檢驗常用的單抗臨床檢驗常用的單抗四、免疫印跡法（四、免疫印跡法（western blotting）n在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶n1.原理原理n（1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE）n SDSn是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷n 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

52、（Polyacrylamide gel electrophoresis）n在電場的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介在電場的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動，移動的速率主要取決于其分子量質(zhì)中向正極移動，移動的速率主要取決于其分子量大小（鏈的長短），從而把不同分子量的肽鏈分開。大?。ㄦ湹拈L短），從而把不同分子量的肽鏈分開。電泳電泳buffer電泳電泳buffer圖 電泳槽 點樣點樣電泳方向電泳方向圖n蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)n已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分

53、子量估計。估計。n商品化供應(yīng)商品化供應(yīng)n道爾頓道爾頓(質(zhì)量單位質(zhì)量單位, 等于一氧原子質(zhì)量的等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。十六分之一。 n一克約為一克約為61023道爾頓道爾頓Dalton凝膠中的蛋白質(zhì)染色：凝膠中的蛋白質(zhì)染色：n1）直接染色）直接染色n考馬斯亮藍：考馬斯亮藍： 靈敏度底、只能檢出靈敏度底、只能檢出0.3-1g/帶，但可帶，但可褪色回收。褪色回收。 n硝酸銀：硝酸銀： 靈敏度高、可檢出靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。帶。n2）轉(zhuǎn)到膜上進行染色。）轉(zhuǎn)到膜上進行染色。圖 直接染色電泳結(jié)果（2）Western blottingn Western（轉(zhuǎn)膜）（轉(zhuǎn)膜）n電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以

54、用電轉(zhuǎn)的方法，電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、膜、中性尼龍膜等）中性尼龍膜等）n膠里的蛋白質(zhì)帶在電場的作用下橫向轉(zhuǎn)膠里的蛋白質(zhì)帶在電場的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上移到正極一側(cè)的膜上膜膜膠膠蛋白蛋白圖 Western裝置 Blottingn原理與原理與ELISA相同。相同。n辣根過氧化物酶：辣根過氧化物酶：HRPO待測蛋白待測蛋白硝酸纖硝酸纖 維素膜維素膜一抗一抗 二抗二抗辣根過氧辣根過氧 化物酶化物酶底物底物產(chǎn)物，產(chǎn)物， 并發(fā)出光并發(fā)出光PAGE膠膠待測蛋白待測蛋白底片曝光底片曝光 Blotting過程過程n1）先用一抗（待測

55、蛋白的單克隆抗體）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與與 膜上的蛋白結(jié)合。膜上的蛋白結(jié)合。n2）洗去未結(jié)合的一抗。）洗去未結(jié)合的一抗。n3）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有HRPO）。）。n4）清洗掉未結(jié)合的二抗。）清洗掉未結(jié)合的二抗。n5）用）用HRPO的底物浸泡膜。的底物浸泡膜。n6）暗室里曝光，沖洗膠片。）暗室里曝光，沖洗膠片。Immuno Blotting結(jié)果結(jié)果圖 單抗blotting結(jié)果圖 多克隆抗體Blotting的結(jié)果第六節(jié)第六節(jié) 翻譯篩選法翻譯篩選法 n借助無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，通過表達或抑制借助無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，通過表達或抑制所選擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)

56、錄，所選擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)錄，來篩選其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。來篩選其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。n適用于適用于mRNA轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因。轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因。一、無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)一、無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)n能把外源的能把外源的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物。提取物。 如：麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織如：麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物系統(tǒng)。紅細(xì)胞提取物系統(tǒng)。二、轉(zhuǎn)譯篩選二、轉(zhuǎn)譯篩選n與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符？與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符？mRNA無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)35S標(biāo)記的標(biāo)記的 甲硫氨酸甲硫氨酸翻譯翻譯35S標(biāo)記的肽鏈標(biāo)記的肽鏈PAGE電泳電泳放射自顯影放射自顯影比較放射性比較放射性

57、帶紋的位置帶紋的位置載體載體+外源外源DNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄三、雜交抑制轉(zhuǎn)譯法三、雜交抑制轉(zhuǎn)譯法n1. 原理原理nmRNA一旦與一旦與DNA雜交成雜交成RNA-DNA雙雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被抑制）。譯被抑制）。單鏈單鏈mRNA核糖體核糖體 小亞基小亞基核糖體核糖體 大亞基大亞基能翻譯能翻譯mRNADNA核糖體核糖體 小亞基小亞基核糖體核糖體 大亞基大亞基不能翻譯不能翻譯2. 過程過程四、雜交釋放轉(zhuǎn)譯法四、雜交釋放轉(zhuǎn)譯法n1. 原理原理n在高甲酰胺溶液中載體上克隆的在高甲酰胺溶液中載體上克隆的cDNA與它的與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋雜交吸附，

58、然后洗脫，釋放出與它對應(yīng)的放出與它對應(yīng)的mRNA，進行體外轉(zhuǎn)錄。，進行體外轉(zhuǎn)錄。 研究其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基研究其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物（如分子量、免疫源性等）。因產(chǎn)物（如分子量、免疫源性等）。2. 過程過程硝酸纖硝酸纖 維素濾膜維素濾膜載體和插載體和插 入的入的cDNA總總mRNAcDNA基因的基因的 mRNA雜交雜交洗脫洗脫cDNA基因的基因的 mRNA體外翻譯體外翻譯cDNA編編碼的蛋白碼的蛋白電泳電泳凝膠放射自顯影凝膠放射自顯影cDNA編編 碼的蛋白碼的蛋白硝酸纖硝酸纖 維素濾膜維素濾膜載體和插載體和插 入的入的cDNA硝酸纖硝酸纖 維素濾膜維素濾膜載體和插載體和插

59、 入的入的cDNA收集收集35S標(biāo)記的氨基酸標(biāo)記的氨基酸五、五、DNA-蛋白質(zhì)相互作用篩選蛋白質(zhì)相互作用篩選法法n專門設(shè)計檢測能同專門設(shè)計檢測能同DNA特異結(jié)合的蛋白特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。質(zhì)因子。待測蛋白質(zhì)待測蛋白質(zhì)硝硝 酸酸 纖纖 維維 素素 濾濾 膜膜能與蛋白質(zhì)結(jié)能與蛋白質(zhì)結(jié) 合的合的DNA序列序列放射性標(biāo)記放射性標(biāo)記待測蛋白質(zhì)待測蛋白質(zhì)硝硝 酸酸 纖纖 維維 素素 濾濾 膜膜能與蛋白質(zhì)結(jié)能與蛋白質(zhì)結(jié) 合的合的DNA序列序列放射性標(biāo)記放射性標(biāo)記第七節(jié)第七節(jié) 真核重組基因的選擇方法真核重組基因的選擇方法n一、哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的選擇標(biāo)記一、哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的選擇標(biāo)記n1. 胸苷激酶（胸苷激酶（

60、thymidine kinase, tk）n（1）TK選擇原理選擇原理n四氫葉酸的必要性四氫葉酸的必要性n真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。供甲基。二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶dihydrofolate reductase，DHFR二氫葉酸二氫葉酸四氫葉酸四氫葉酸DHFRn氨甲喋啉（氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作）的抑制作用用n氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似物。物。 能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻斷斷dATP、dCTP和和dTTP的合成：的合成：dUMP dATP TTP d