色譜分析方法之一高效液相色譜分析技術(shù)實用教案

1、2022-7-2一、高效(o xio)(o xio)液相色譜法的特點 特點：高壓、高效、高速 高沸點、熱不穩(wěn)定(wndng)有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。第1頁/共17頁第一頁，共17頁。2022-7-2二、流程(lichng)及主要部件1.流程(lichng)第2頁/共17頁第二頁，共17頁。2022-7-22.主要主要(zhyo)部件部件(1) 高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150350105 Pa。為了獲得高柱效而使用(shyng)粒度很小的固定相（10m），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕

2、等特性第3頁/共17頁第三頁，共17頁。2022-7-2(2) 梯度(t d)淋洗裝置外梯度(t d): 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度(t d)混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例(bl)調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例(bl)抽入高壓泵中混合。第4頁/共17頁第四頁，共17頁。2022-7-2(3) 進(jìn)樣裝置(zhungzh) 流路中為高壓力工作狀態(tài)， 通常(tngchng)使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置， 其結(jié)構(gòu)如圖所示：第5頁/共17頁第五頁，共17頁。2022-7-2(4) 高效(o xio)分離柱 柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)

3、徑(ni jn)16 mm，柱長540 cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。第6頁/共17頁第六頁，共17頁。2022-7-2(5) 高效(o xio)液相色譜檢測器 紫外光度檢測器（UV）：最小檢測量10-9gmL-1，對流量和溫度的波動(bdng)不敏感，可用于梯度洗脫。 最常用的檢測器。第7頁/共17頁第七頁，共17頁。2022-7-2光電二極管陣列(zhn li)檢測器 光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定(tdng)波長，計算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。第8頁/共17頁第八頁，共17頁。2022-7-2三、影響分離(fnl)(fnl)的因素 在高效

4、液相色譜中, 速率方程中的分子(fnz)擴(kuò)散項B/U較小，可以忽略不計，而只有兩項，即： H = A + C u 故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示： 影響分離(fnl)的主要因素有流動相的流量、性質(zhì)和極性。第9頁/共17頁第九頁，共17頁。2022-7-21. 影響影響(yngxing)分離的因素分離的因素流速流速 流速大于0.5 cm/s時, Hu曲線是一段斜率不大的直線。降低(jingd)流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。第10頁/共17頁第十頁，共17頁。2022-7-22. 固定固定(gdng)相及分離柱相及分離

5、柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。 選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高(t go)柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。 選擇短柱、細(xì)內(nèi)徑提高(t go)分析速度； 研制高效柱填料是一活躍領(lǐng)域。第11頁/共17頁第十一頁，共17頁。2022-7-23. 流動流動(lidng)相及流動相及流動(lidng)相的極性相的極性 （1）可顯著改變組分分離狀況的流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要。 液相色譜的流動相又稱為(chn wi)：淋洗液，洗脫劑。 （2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固

6、定相的極性，稱為(chn wi)正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。 （3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為(chn wi)反相液液色譜，非極性柱也稱為(chn wi)反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。 第12頁/共17頁第十二頁，共17頁。2022-7-2流動(lidng)相組成 流動相按組成不同可分為單組分和多組分； 按極性可分為極性、弱極性、非極性； 按使用方式有固定組成淋洗和梯度(t d)淋洗。常用溶劑: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。第13頁/共17頁第

7、十三頁，共17頁。2022-7-2選擇流動(lidng)相時應(yīng)注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲(zoshng)增加。（2）避免流動相與固定(gdng)相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定(gdng)液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定(gdng)相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。第14頁/共17頁第十四頁，共17頁。2022-7-2四、 高效(o xio)(o xio)液相色譜法的主要分離類型1. 吸附色譜（液-固

8、吸附色譜） 以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。2. 分配(fnpi)色譜（液-液分配(fnpi)色譜）早期通過在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定相, 現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相，即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在擔(dān)體表面。第15頁/共17頁第十五頁，共17頁。2022-7-23. 3. 離子交換離子交換(l z jio hun)(l z jio hun)色譜色譜 固定相為離子交換樹脂，流動相為無機(jī)酸或無機(jī)堿的水溶液。各種( zhn)離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離。4. 凝膠色譜（空間排阻色譜） 以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)