chapter7-1+免疫學技術

1、第七章 免疫學技術7.1 7.1 血清學技術血清學技術 ( (非標記免疫分析技術）非標記免疫分析技術）7.2 7.2 標記免疫分析技術標記免疫分析技術7.3 7.3 單克隆抗體技術單克隆抗體技術7.4 7.4 基因工程抗體技術基因工程抗體技術7.5 7.5 其它免疫學技術其它免疫學技術 概 論免疫學技術免疫學技術是指對抗原、抗體在體外所作的各種是指對抗原、抗體在體外所作的各種 反應實驗及抗體的制備技術。反應實驗及抗體的制備技術。 免疫學技術的特點免疫學技術的特點: :A A、診斷：診斷：人類各種傳染病的診斷：如各型肝炎，人類各種傳染病的診斷：如各型肝炎，艾滋病艾滋病、梅毒、梅毒、 SARS S

2、ARS 、炭疽病菌等；各種腫瘤的診、炭疽病菌等；各種腫瘤的診斷；妊娠、血型、法醫(yī)血痕診斷。（凝集實驗、康氏斷；妊娠、血型、法醫(yī)血痕診斷。（凝集實驗、康氏試驗試驗( (絮狀沉淀絮狀沉淀) ) 、間接凝集抑制試驗、間接凝集抑制試驗、 ELISA 、 ELISA-PCR 、 Western blot 、免疫熒光方法、免疫傳感、免疫熒光方法、免疫傳感器和抗體芯片器和抗體芯片等）。等）。 B B、預防、治療：預防、治療：傳染性疾病的免疫預防和治療；腫傳染性疾病的免疫預防和治療；腫瘤的免疫預防和治療；免疫缺陷和自身免疫性疾病預瘤的免疫預防和治療；免疫缺陷和自身免疫性疾病預防和治療等。如制備疫苗（基因工程疫

3、苗）進行預防防和治療等。如制備疫苗（基因工程疫苗）進行預防和治療。預防性抗體（如肌注人丙種球蛋白預防傳染和治療。預防性抗體（如肌注人丙種球蛋白預防傳染性肝炎，麻疹等病毒性疾?。?，抗體靶向治療腫瘤性肝炎，麻疹等病毒性疾?。?，抗體靶向治療腫瘤（如單克隆抗體，基因工程抗體）。（如單克隆抗體，基因工程抗體）。2 2、動物檢疫檢測中的應用、動物檢疫檢測中的應用免疫學技術在動物檢疫上主要應用于檢測抗原免疫學技術在動物檢疫上主要應用于檢測抗原及動物性流行病調查中檢測特異性抗體。檢測范圍及動物性流行病調查中檢測特異性抗體。檢測范圍非常廣泛，常見的主要有非常廣泛，常見的主要有禽病禽病診斷中病毒的檢測，診斷中病毒

4、的檢測，如禽流感病毒、雞痘病毒、禽腺病毒等；如禽流感病毒、雞痘病毒、禽腺病毒等；豬豬的流行的流行性腹瀉病毒、豬囊蟲；性腹瀉病毒、豬囊蟲；牛牛的口蹄疫、瘋牛病等。如的口蹄疫、瘋牛病等。如采用酶免疫測定法，采用酶免疫測定法，Western blot。3 3、植物病毒檢測中的應用、植物病毒檢測中的應用免疫學方法已被植物病毒學家廣泛應用免疫學方法已被植物病毒學家廣泛應用于植物病毒的檢測，病毒病的普查、口岸和于植物病毒的檢測，病毒病的普查、口岸和產(chǎn)地檢疫等。如產(chǎn)地檢疫等。如ELISAELISA方法方法, ,具有靈敏度高具有靈敏度高快速等特點?？焖俚忍攸c。4 4、生物學上的應用生物學上的應用A A、物種的

5、分類鑒定：物種的分類鑒定：動物、植物、微生物的鑒動物、植物、微生物的鑒定，品種品系、血清型；各種生物之間的差異定，品種品系、血清型；各種生物之間的差異都可表現(xiàn)在抗原性不同，物種種源越遠，抗原都可表現(xiàn)在抗原性不同，物種種源越遠，抗原性差異越大，可用區(qū)分抗原性的血清學反應，性差異越大，可用區(qū)分抗原性的血清學反應，進行包括微生物在內的物種鑒定、物種的分類進行包括微生物在內的物種鑒定、物種的分類等。等。B B、分子生物學研究領域：分子生物學研究領域：在基因工程中，基因的分離、在基因工程中，基因的分離、克隆、篩選、表達產(chǎn)物的定性與定量分析、表達產(chǎn)物克隆、篩選、表達產(chǎn)物的定性與定量分析、表達產(chǎn)物的純化等均

6、涉及到免疫技術。如免疫印跡，免疫親和的純化等均涉及到免疫技術。如免疫印跡，免疫親和層析等免疫分析和分離技術。層析等免疫分析和分離技術。C C、建立血清庫建立血清庫 用于各種生物資源及生態(tài)分布的調查用于各種生物資源及生態(tài)分布的調查, ,如如: :各種植物各種植物病源菌、根瘤菌、蘇云金桿菌等（用到熒光抗體標記病源菌、根瘤菌、蘇云金桿菌等（用到熒光抗體標記測定技術）。測定技術）。 5 5、食品、藥品的檢測食品、藥品的檢測 用于食品中微生物的檢測，如用用于食品中微生物的檢測，如用ELISA方法檢測方法檢測食物中毒的病原菌食物中毒的病原菌，如沙門氏菌，如沙門氏菌、霉、霉菌；菌；食品中毒素食品中毒素如黃曲

7、霉毒素的如黃曲霉毒素的檢測；檢測；食品中食品中殘留農(nóng)藥殘留農(nóng)藥的的檢測；抗哮喘的藥物如茶堿檢測；抗哮喘的藥物如茶堿、抗生、抗生素如慶大霉素的素如慶大霉素的檢測。檢測。6 6、在環(huán)境保護中的應用在環(huán)境保護中的應用 采用夾心免疫法，免疫生物傳感器檢測采用夾心免疫法，免疫生物傳感器檢測 污染物。另外，利用固定化的單鏈抗體處理污染物。另外，利用固定化的單鏈抗體處理 污染物。污染物。 7.1 血清學技術 (非標記免疫分析技術）7.1.1 1. 用已知抗原檢測未知用已知抗原檢測未知抗體抗體2. 用已知抗體檢測未知用已知抗體檢測未知抗原抗原3. 用已知抗體檢測某些藥物用已知抗體檢測某些藥物、激素等各種、激素

8、等各種半半 抗原抗原 7.1.2 7.1.2 影響血清學反應的因素影響血清學反應的因素1.1.內在因素內在因素- -抗原抗體的性質抗原抗體的性質抗原抗體反應的整體強度受抗原抗體反應的整體強度受3 3個因素控制：個因素控制： 1) 1) 結合力結合力 2) 2) 特異性特異性 3) 3) 結合價結合價 其中結合力和特異性是反應的關鍵因素。其中結合力和特異性是反應的關鍵因素。 1)1)AgAg、AbAb的分子間非共價鍵的相互作用（結合力）：的分子間非共價鍵的相互作用（結合力）：鹽鍵鹽鍵( (靜電引力靜電引力) )、氫鍵結合力、氫鍵結合力、疏水作用力和范德疏水作用力和范德瓦爾力。瓦爾力?？乖贵w分子

9、間相互作用力抗原抗體分子間相互作用力鹽鍵鹽鍵氫鍵氫鍵疏疏水力水力范德瓦爾力范德瓦爾力2)2)特異性特異性: :抗原抗體反應的專一性，這是抗抗原抗體反應的專一性，這是抗原表位（抗原決定簇）與抗體超變區(qū)中抗原表位（抗原決定簇）與抗體超變區(qū)中抗原結合點之間，化學結構和空間構型上呈原結合點之間，化學結構和空間構型上呈互補關系。如果兩個抗原有相同的抗原表互補關系。如果兩個抗原有相同的抗原表位位- -交叉反應。交叉反應。3)3)結合價：結合價：AgAg為多價，為多價，AbAb為二價或二價以為二價或二價以上。多價才形成網(wǎng)狀結構的凝聚物。上。多價才形成網(wǎng)狀結構的凝聚物。2.2.外在因素外在因素抗抗原原抗抗體體

10、的的結結合合比比例例抗抗 原原 濃濃 度度復復合合物物沉沉淀淀量量抗原過?？乖^?？贵w過?？贵w過剩適宜適宜抗體過?？贵w過剩, ,形形成最小的沉淀成最小的沉淀物物抗原抗體比例抗原抗體比例合適合適, ,形成最形成最大的沉淀物大的沉淀物抗原過?？乖^剩, ,形形成最小的沉淀成最小的沉淀物物p1562) 2) 電解質（電解質（NaClNaCl）3) pH3) pH值：值：4) 4) 溫度：溫度：7.1.3 血清學血清學分析技術主要內容 原理：原理：可溶性抗原與相應抗體混合后，在適量的電解質存在的可溶性抗原與相應抗體混合后，在適量的電解質存在的條件下發(fā)生特異性結合，形成抗原抗體復合物并出現(xiàn)可見的條件下發(fā)

11、生特異性結合，形成抗原抗體復合物并出現(xiàn)可見的反應（沉淀或沉淀線）的過程。反應（沉淀或沉淀線）的過程。 沉淀原：沉淀原：參加反應的可溶性抗原。參加反應的可溶性抗原。 沉淀素：沉淀素：參加反應的抗體。參加反應的抗體。 可溶性抗原：可溶性抗原：抗原分子較小，如蛋白質、多糖、類脂、細菌的抗原分子較小，如蛋白質、多糖、類脂、細菌的外毒素、內毒素、菌體裂解液、病毒的可溶性抗原、血清蛋外毒素、內毒素、菌體裂解液、病毒的可溶性抗原、血清蛋白、組織浸出液等。白、組織浸出液等。根據(jù)沉淀反應可在液相或半液相（凝膠）根據(jù)沉淀反應可在液相或半液相（凝膠）中進行，可分為：中進行，可分為：液相液相毛細管沉淀反應毛細管沉淀反

12、應絮狀沉淀反應絮狀沉淀反應 免疫濁度法免疫濁度法 環(huán)狀沉淀反應環(huán)狀沉淀反應瓊脂擴散實驗瓊脂擴散實驗免疫電泳免疫電泳半液相半液相p1587.1.4.1 環(huán)狀沉淀反應 (Ring precipitation reaction）原理：原理：過程：過程：用途：用途：過程：過程：原理：原理：免疫濁度法利用抗原抗體在液體內快速形成免疫濁度法利用抗原抗體在液體內快速形成 抗原抗體復合物反應液中會抗原抗體復合物反應液中會出現(xiàn)濁度出現(xiàn)濁度的特性。的特性。 可利用光學測定儀（光電比色計等）及自動可利用光學測定儀（光電比色計等）及自動 化分析系統(tǒng)對液相沉淀反應進行檢測?；治鱿到y(tǒng)對液相沉淀反應進行檢測。 包括包括

13、透射比濁法透射比濁法 散射比濁法散射比濁法 速率散射比濁法速率散射比濁法 免疫膠乳濁度法等。免疫膠乳濁度法等。 以上幾種方法均已用于臨床體液樣品的測定。以上幾種方法均已用于臨床體液樣品的測定。特點：特點：靈敏度高、測定速度快。靈敏度高、測定速度快。例：例：AbAb濃度固定，在一定范圍內，檢樣濁度與其中所濃度固定，在一定范圍內，檢樣濁度與其中所含含AgAg量呈正比，在量呈正比，在495495nmnm波長比色計上比濁。波長比色計上比濁。載體：載體：原理：原理：過程：過程：用途：用途：單向瓊脂擴散單向瓊脂擴散過程：過程：用途：用途：原理：原理：單向瓊脂擴散單向瓊脂擴散 （水平板上）（水平板上）過程：

14、過程：1)1)AgAgAgAg含抗體凝膠含抗體凝膠沉沉 淀淀 環(huán)環(huán)用途：用途：雙向擴散雙向擴散( (抗體效價測定抗體效價測定) )Ab 2 4 8 16 32 Ag CK 雙向擴散(組分分析)沉 淀 帶AbAgAbAg原理：原理：免疫電泳為區(qū)帶電泳與免疫雙擴散的結合免疫電泳為區(qū)帶電泳與免疫雙擴散的結合。 先利用區(qū)帶電泳技術將不同電荷和分子量的先利用區(qū)帶電泳技術將不同電荷和分子量的蛋白抗原在瓊脂內分離，然后在與電泳方向平行蛋白抗原在瓊脂內分離，然后在與電泳方向平行的方向上開槽，加入抗血清。的方向上開槽，加入抗血清。3737下使兩者擴散，下使兩者擴散，各區(qū)帶蛋白在相應的位置與抗體反應形成弧形沉各區(qū)

15、帶蛋白在相應的位置與抗體反應形成弧形沉淀線。淀線。過程：過程：免疫電泳（結果）免疫電泳（結果）正常人血清蛋白的免疫電泳圖象正常人血清蛋白的免疫電泳圖象特點：特點：用途：用途：1) 1) 對流免疫電泳（對流免疫電泳（counter counter immunoelectrophoresisimmunoelectrophoresis）2) 2) 火箭免疫電泳火箭免疫電泳( (rocket rocket immunoelectrophoresisimmunoelectrophoresis) )3) 3) 雙向免疫電泳雙向免疫電泳( (two dimension two dimension munoe

16、lectrophoresismunoelectrophoresis) )4) 4) 線形免疫電泳（線形免疫電泳（Line Line immunoelectrophoresisimmunoelectrophoresis）原理：原理：過程：過程：用途：用途：優(yōu)點：優(yōu)點：火箭免疫電泳火箭免疫電泳rocket immunoelectrophoresis原理：原理：過程：過程：標標 準準 抗抗 原原待待 測測 抗抗 原原含含 抗抗 體體 凝凝 膠膠+用途：用途：0.5-1g/mL雙向免疫電泳雙向免疫電泳( (Two dimension Imunoelectrophoresis)過程：過程：雙雙 向向 免

17、免 疫疫 電電 泳泳 示示 意意 圖圖用途：用途：線形免疫電泳線形免疫電泳（Line immunoelectrophoresis） 過程：過程：含含Ag 1 凝膠凝膠含含Ag 2 凝膠凝膠含含Ag 3 凝膠凝膠含含Ab凝膠凝膠+ 定義：定義：1. 直接凝集反應（直接凝集反應（direct agglutination）2.間接凝集反應（間接凝集反應（indirect agglutination ）3.間接凝集抑制試驗間接凝集抑制試驗(indirect agglutination inhibition test)4.協(xié)同凝集試驗（協(xié)同凝集試驗（Coagglutination）5.庫姆斯試驗（庫姆斯

18、試驗（Coombs test）7.1.5.17.1.5.1直接凝集反應直接凝集反應（direct agglutination）原理：原理：是指細菌、紅細胞和螺旋體等是指細菌、紅細胞和螺旋體等顆粒顆粒性抗原性抗原與相應的與相應的抗體抗體在適量的電解質存在的在適量的電解質存在的條件下，經(jīng)一定時間后凝聚成肉眼可見的凝條件下，經(jīng)一定時間后凝聚成肉眼可見的凝集物。簡稱凝集反應。集物。簡稱凝集反應。 凝集原：凝集原：參加凝集反應的顆粒性抗原。參加凝集反應的顆粒性抗原。 凝集素：凝集素：參加凝集反應的抗體。參加凝集反應的抗體。過程：過程：用途：用途：標準抗標準抗A A血清血清標準抗標準抗B B血清血清O O

19、型型B B型型A A型型ABAB型型試管法：試管法：過程：過程：用途：用途：H-AgAb生理鹽水生理鹽水每管加每管加0.5ml抗原用生理鹽水稀釋到至相當于抗原用生理鹽水稀釋到至相當于McFarlandMcFarland比濁管第比濁管第6 6支的濃度支的濃度試管凝集反應判斷指標7.1.5.2 7.1.5.2 間接凝集反應間接凝集反應（indirect agglutination）定義：定義：載體：載體：正向間接凝集反應正向間接凝集反應原理：原理：抗原：抗原：載體：載體：過程：過程：A A、抗原與載體結合抗原與載體結合（紅細胞致敏），（紅細胞致敏）， - -多數(shù)多糖抗原多數(shù)多糖抗原直接吸附直接吸附

20、 - -蛋白質抗原：用蛋白質抗原：用1%1%戊二醛和鞣酸處理紅細胞戊二醛和鞣酸處理紅細胞 再吸附蛋白質抗原（再吸附蛋白質抗原（0.005%0.005%鞣酸鞣酸3737O OC,C,處理處理1010minmin）。 - -化學鍵促進結合：三氯化鉻、重偶氮聯(lián)苯胺、碳化學鍵促進結合：三氯化鉻、重偶氮聯(lián)苯胺、碳 乙二胺乙二胺 B B、致敏紅細胞與相應抗體反應致敏紅細胞與相應抗體反應 用途用途: : 抗體的定性；定量分析抗體的定性；定量分析, ,抗毒素的檢測，如白喉抗抗毒素的檢測，如白喉抗 毒素的檢測，靈敏度可達毒素的檢測，靈敏度可達1.2 1.2 ngng/ml/ml正向間接凝集試驗正向間接凝集試驗醛

21、醛化化鞣酸鞣酸可溶性抗原可溶性抗原新鮮新鮮RBC醛化醛化RBC致敏RBC抗體抗體鞣酸化鞣酸化RBC產(chǎn)生血凝現(xiàn)象產(chǎn)生血凝現(xiàn)象反向間接凝集試驗反向間接凝集試驗（Reverse indirect hemagglutination test）原理：原理：以特異性抗體致敏載體以檢測標本中的抗原。以特異性抗體致敏載體以檢測標本中的抗原。過程：過程：- IgG經(jīng)胃蛋白酶處理經(jīng)胃蛋白酶處理 F（ab）2，不處理不處理 的與紅細胞結合后無活性的與紅細胞結合后無活性 - 紅細胞經(jīng)鞣酸處理紅細胞經(jīng)鞣酸處理 - F（ab）2與紅細胞結合與紅細胞結合 - 與相應抗原反應與相應抗原反應反向間接凝集試驗反向間接凝集試驗經(jīng)醛

22、化、經(jīng)醛化、鞣酸化的鞣酸化的RBC洗滌洗滌可溶性抗原可溶性抗原加入經(jīng)處加入經(jīng)處理的抗體理的抗體致敏致敏RBC用途：用途：1. 調查棉蚜分布（用不同蚜蟲抗原制備抗體，調查棉蚜分布（用不同蚜蟲抗原制備抗體， 用此抗體檢測草蛉中腸內用此抗體檢測草蛉中腸內蚜蟲抗原蚜蟲抗原） 2. 傳染病及癌癥抗原的檢測傳染病及癌癥抗原的檢測，敏感性、特異，敏感性、特異 性高。如性高。如檢測血清中乙型肝炎表面抗原和檢測血清中乙型肝炎表面抗原和 普查肝癌甲胎蛋白普查肝癌甲胎蛋白；采用聚苯乙烯乳膠為；采用聚苯乙烯乳膠為 載體的反向間接凝集試驗，可用比濁法進載體的反向間接凝集試驗，可用比濁法進 行光學檢測，檢測癌胚抗原達行光

23、學檢測，檢測癌胚抗原達1 ng/ml。7.1.5.3 7.1.5.3 間接凝集抑制試驗間接凝集抑制試驗原理：待檢的原理：待檢的可溶性抗原與相應抗體混合后，經(jīng)一可溶性抗原與相應抗體混合后，經(jīng)一定時間后加入用同一抗原致敏的載體顆粒，將因抗定時間后加入用同一抗原致敏的載體顆粒，將因抗體已被先加入的抗原結合而不能再與致敏的顆粒結體已被先加入的抗原結合而不能再與致敏的顆粒結合，因此合，因此不能出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，此為陽性反應不能出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，此為陽性反應；若待；若待測樣品中無相應抗原，加入抗體后，再加入致敏顆測樣品中無相應抗原，加入抗體后，再加入致敏顆粒，抗體則與致敏顆粒結合而出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。粒，抗體則與致敏顆

24、粒結合而出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。 用途：用途：定性分析，如：定性分析，如： - 妊娠鑒定妊娠鑒定：檢測尿液是否含有絨毛：檢測尿液是否含有絨毛 膜促性腺激素膜促性腺激素 標準抗原：絨毛膜促性腺激素標準抗原：絨毛膜促性腺激素 標準抗體：抗絨毛膜促性腺激素抗體標準抗體：抗絨毛膜促性腺激素抗體 載體：聚苯乙烯乳膠載體：聚苯乙烯乳膠 致敏顆粒：聚苯乙烯乳膠致敏顆粒：聚苯乙烯乳膠+絨毛膜促絨毛膜促 性腺激素性腺激素產(chǎn)產(chǎn) 生生 凝凝 集集致敏顆粒致敏顆粒標準抗體標準抗體待測抗原待測抗原凝凝 集集 抑抑 制制載體顆粒載體顆粒標準抗原標準抗原致敏顆粒致敏顆粒致敏顆粒致敏顆粒標準抗體標準抗體無待測抗原無待測抗原間接血凝抑制

25、試驗間接血凝抑制試驗待測抗原待測抗原標準抗體標準抗體形成抗原抗形成抗原抗體復合物體復合物加入標準抗原加入標準抗原致敏的致敏的RBCRBC發(fā)生凝集抑制發(fā)生凝集抑制間間接接血血凝凝抑抑制制試試驗驗結結果果7.1.5.4 協(xié)同凝集試驗協(xié)同凝集試驗 （Coagglutination）原理：原理：反應過程：反應過程：協(xié)同凝集反應協(xié)同凝集反應含含A蛋白的金黃蛋白的金黃色葡萄球菌色葡萄球菌IgG與與IgGFc段結合的段結合的金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌相應抗原相應抗原發(fā)生協(xié)同凝集反應發(fā)生協(xié)同凝集反應7.1.5.5 庫姆斯試驗庫姆斯試驗 （Coombs test）原理：原理：庫姆斯試驗也叫庫姆斯試驗也叫抗球蛋白實驗抗球蛋白實驗，有的抗，有的抗 體在適宜的介質中與相應的抗原結合后體在適宜的介質中與相應的抗原結合后 不出現(xiàn)可見的反應，這種抗體稱為不完不出現(xiàn)可見的反應，這種抗體稱為不完 全抗體，如抗紅細胞全抗體，如抗紅細胞RhRh抗原的抗體，將抗原的抗體，將 抗人球蛋白抗體抗人球蛋白抗體加到抗原與不完全抗體加到抗原與不完全抗體 的結合物