武漢大學(xué)遺傳學(xué)基因組學(xué)與后基因組學(xué)

1、第18章 基因組學(xué)與后基因組學(xué)主要講授：1 人類基因組計劃與基因組學(xué)2 基因組測序與序列組裝3 基因組圖譜構(gòu)建與應(yīng)用4 比較基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究5 基因組的進化18.1人類基因組計劃與基因組學(xué)基因組學(xué)（genomics）：它是研究基因組的組成、結(jié)構(gòu)和功能的學(xué)科結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structural genomics）：是著重研究基因組的結(jié)構(gòu)并構(gòu)建高分辨的遺傳圖、物理圖、序列圖和轉(zhuǎn)錄圖以及研究蛋白質(zhì)組成與結(jié)構(gòu)的學(xué)科；功能基因組學(xué)（functional genomics） ：主要是利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究所得到的各種信息在基因組水平上研究編碼序列及非編碼序列生物學(xué)功能的學(xué)科。18. 1.1人類基因組

2、計劃美國能源部和國立衛(wèi)生研究院（NIH）合作于1990年正式啟動人類基因組計劃。主要目標(biāo)是計劃撥款30億美元，用15年時間完成人類基因組30億bp全部序列的測定，在2001年完成全部染色體的“工作草圖”。經(jīng)過參加該項目的1000多名各國科學(xué)家的通力合作，人類基因組的工作草圖于2000年6月26日勝利繪制完成，該工作草圖包含人體90以上堿基對的位置信息。2000年6月26日，六國科學(xué)家公布人類基因組工作框架圖2001 年2月12日，人類基因組圖譜及初步分析結(jié)果首次公布2001 年8月26日，中國提前兩年完成1人類基因組測序任務(wù)2003年4月15日，六個國家共同宣布人類基因組序列圖完成(美、英、德

3、、日、法、中)已經(jīng)完成的人類基因組圖譜(序列)來自不同人種的5個個體，是一個參考圖譜。2004年10月，國際人類基因組測序聯(lián)合體在Nature周刊上發(fā)表了人類基因組常染色質(zhì)全序列測定的論文宣布人類基因組由31.647億個堿基對組成，擁有編碼蛋白質(zhì)的基因數(shù)目大約在2萬到2.5萬個之間。18.1.2人類基因組的結(jié)構(gòu)特點圖181 人類基因組的組織組成18.1.3遺傳標(biāo)記遺傳學(xué)中曾將可識別的等位基因稱為遺傳標(biāo)記（geneticmarker） ?，F(xiàn)代遺傳學(xué)將可示蹤染色體、染色體片段、基因等傳遞軌跡的遺傳特性也稱為遺傳標(biāo)記。1.形 態(tài) 標(biāo)記： 是指那些能夠明確顯示遺傳多態(tài)的外觀性狀，如株高、粒色等的相對差

4、異2.細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 ：是指能夠明確顯示遺傳多態(tài)的細(xì)胞學(xué)特征。如染色體結(jié)構(gòu)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性等。3.蛋白質(zhì)標(biāo)記： 非酶蛋白質(zhì)和酶蛋白質(zhì)在非酶蛋白質(zhì)中，用得較多的是種子貯藏蛋白；酶蛋白質(zhì)主要是同功酶。4.DNA 標(biāo) 記： 也稱DNA多態(tài)性標(biāo)記、 DNA分子標(biāo)記，是 DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映。這里僅介紹遺傳的分子標(biāo)記中的幾種DNA分子標(biāo)記:RFLP、VNTRs、AFLP、RAPD、SSR、STS和SNP（1） RFLP標(biāo)記 (restriction fragment length polymorphism)：同一物種的亞種、品系或個體間基因組DNA 受到同一種限制性內(nèi)切酶作用而形成不同的酶

5、切圖譜的現(xiàn)象，稱為限制性片段長度多態(tài)性（RFLP) 。這是由于基因組DNA某一位點上的變異有可能引起該位點特異性的限制性內(nèi)切酶識別位點的改變，包括原有位點的消失或出現(xiàn)新的酶切位點，致使酶切片段長度隨之發(fā)生變化而產(chǎn)生。對RFLP的檢測主要是用Southern雜交的方法進行基本流程：組織或細(xì)胞基因組DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移至濾膜預(yù)雜交加入探針雜交洗膜放射自顯影。RFLP標(biāo)記的主要特點是：（1）遍布于整個基因組，低拷貝序列；（2）無表型效應(yīng)，不受發(fā)育階段及器官特異性限制；（3）共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子；（4）結(jié)果穩(wěn)定、可靠；（5）DNA需要量大，檢測技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的

6、育種實踐中。用途：RFLP主要用于群體水平和系統(tǒng)發(fā)育研究上進行：個體識別；繪制遺傳圖譜；目的基因定位；檢測群體內(nèi)或群體間序列差異程度；輔助育種等（2） VNTRs標(biāo)記一般將真核生物基因組長16100個核苷酸為基本單元的串聯(lián)重復(fù)序列稱為小衛(wèi)星，而將以2 6個核苷酸為基本單元的簡單串聯(lián)重復(fù)序列，例如（CA）n、（GAG）n、（GACA）n 等，稱為微衛(wèi)星或簡單序列重復(fù)（ simplesequence repeats，SSR） 。小衛(wèi)星和微衛(wèi)星其多態(tài)性來源于重復(fù)序列的核苷酸組成和重復(fù)的次數(shù)不同。一般又將小衛(wèi)星和微衛(wèi)星稱作可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)（ variable number oftandem repea

7、ts，VNTRs）。VNTRs 標(biāo)記也呈共顯性遺傳，符合孟德爾遺傳傳遞規(guī)律，因此可以用來進行遺傳分析和作圖（圖183） 。而且VNTRs在基因組中有廣泛的分布，可檢出的多態(tài)更豐富，出現(xiàn)的頻率更高。圖183人VNTRs的系譜分析（引自H artl等，2001）人類系譜分析表明VNTR等位基因的分離。在系譜中出現(xiàn)6個等位基因（ A1 A6） ，但是任何一個個體僅可能有一個等位基因（純合子）或兩個等位基因（雜合子）（基于PCR的DNA標(biāo)記：隨機引物PCR標(biāo)記）（3）RAPD（random amplified polymorphic DNA）標(biāo)記：隨機擴增多態(tài)性DNA，用隨機短引物（人工合成的核苷酸）

8、進行DNA的PCR擴增。所擴增的DNA區(qū)段是事先未知的，具有隨機性和任意性，因此隨機引物PCR標(biāo)記技術(shù)可用于對任何未知基因組的研究。（RAPD 原理）（基于PCR的DNA標(biāo)記：特異引物PCR標(biāo)記）（3）SSR（simple sequence repeats)標(biāo)記:簡單重復(fù)序列多態(tài)性，又稱微衛(wèi)星DNA多態(tài)性，即由二核苷酸，三核苷酸或四核苷酸串聯(lián)重復(fù)的拷貝數(shù)目不等而出現(xiàn)的多態(tài)現(xiàn)象。SSR典型的孟德爾式遺傳；共顯性（兩個親本的性狀在一個個體中同時出現(xiàn)，沒有顯隱關(guān)系）。同源染色體等位基因同源染色體等位基因子代同源染色體等位基因同源染色體等位基因同源染色體等位基因SSR技術(shù)的優(yōu)點是：（1）在基因組中隨機

9、分布，檢測的多態(tài)性頻率高；（2）PCR特異引物，重復(fù)性好；（3）共顯性，操作相對簡單。問題是：（1）SSR需要測序和設(shè)計引物，因而需要大量的人力、物力和時間；（2）另外其種屬特異性強，開發(fā)所需的費用高昂，因此一些實驗室進行了合作，共同開發(fā)微衛(wèi)星引物Simple Sequence Repeats（SSR）= RepeatUnique flanking regions結(jié)構(gòu)不同個體間單元重復(fù)數(shù)高度可變設(shè)計與側(cè)翼區(qū)域配對的引物 ()擴增重復(fù)區(qū)域SSR標(biāo)記的基因變異來源于基因組DNA復(fù)制時的滑動顯然，利用SSR標(biāo)記的關(guān)鍵是引物的設(shè)計。對于已經(jīng)進行基因組全序列測定的生物或遺傳學(xué)研究比較經(jīng)典的生物，可以直接

10、從其基因組進行查找和利用有關(guān)程序進行引物的設(shè)計或利用別人已經(jīng)發(fā)表的引物來進行實驗；而對于沒有基因組序列信息的生物，就需要進行有關(guān)引物的設(shè)計工作。SSR標(biāo)記應(yīng)用：現(xiàn)已證明微衛(wèi)星DNA 存在于絕大多數(shù)真核生物基因組中，因此已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測及目標(biāo)性狀分子標(biāo)記篩選、遺傳多樣性分析、重要性狀基因的定位等（4）、AFLP技術(shù)的原理和應(yīng)用荷蘭Keygene公司Zabeau等（1992）、Zabeau和Vos等（1993）發(fā)展了一種檢測DNA多態(tài)性的新方法AFLP（ Amplified fragment length polymorphism ）：RFLP接頭引物PCR

11、 AFLPAFLP既是進行酶切位點分析又要對酶切片段進行選擇性擴增，因此它既具備RFLP的準(zhǔn)確性又具有PCR的高效性，綜合了兩者的優(yōu)點，并于1993年獲得歐洲專利局專利。AFLP原理圖酶切引物接頭引物接頭引物連接PCR擴增引物引物1引物2引物3AFLP：擴增片段長度多態(tài)性通過對基因組DNA酶切片段的選擇性擴增來檢測DNA酶切片段長度的多態(tài)性。AFLP揭示的DNA多態(tài)性是酶切位點和其后的選擇性堿基的變異。為了對擴增片段的大小進行靈活的調(diào)節(jié)，一般采用兩個限制性內(nèi)切酶。一個是切點多的酶，如具有4bp識別位點的Mse，它產(chǎn)生較小的DNA片段；另一個是切點少的酶，如具有6bp識別位點的EcoR，它產(chǎn)生較

12、大的DNA片段。（1）酶切所需DNA量少（僅需50300ng）,也可以作用于mitDNA；（2）多態(tài)性檢測能力高，既能檢測酶切位點不同造成的多態(tài)性，又能檢測隨機選擇 堿基造成的多態(tài)性；（3）簡單高效，一次選擇擴增就能比較幾十甚至上百個位點；（4）分辨率高，擴增片段短，片段多態(tài)性檢出率高；（5）可靠性與重復(fù)性好。AFLP由于是特定引物擴增，退火溫度高，因而假陽性低，重復(fù)性好。AFLP集RFLP、PCR和RAPD的優(yōu)點于一身，并且克服了RFLP和RAPD的缺點。AFLP技術(shù)的優(yōu)點：AFLP技術(shù)的不足：（1）AFLP技術(shù)受到專利保護，試劑盒昂貴，成本較高；（2）對DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較高，

13、技術(shù)要求高。現(xiàn)在一般都采用銀染和熒光標(biāo)記的方法來代替放射性同位素標(biāo)記，因而避免了輻射傷害。（3）操作繁瑣。AFLP的應(yīng)用（1） 分子進化研究：分析同種植物DNA的差異和親緣關(guān)系；鑒定分類關(guān)系（2） 分析生物發(fā)育不同時期基因的表達(dá)差異情況：cDNA-AFLP；（3）構(gòu)建遺傳圖譜；（4）遺傳多樣性分析；（5）植物雄性不育系與保持系關(guān)系的研究等三系雜交水稻AFLP分析（5） STS標(biāo)記:序列標(biāo)簽位點（ sequencetagged site，STS）是在染色體上定位的、序列已知的單拷貝DNA短片段，一般長200500bp。STS標(biāo)記的原理：是根據(jù)單拷貝的DNA 片段兩端的序列，設(shè)計一對特異引物，經(jīng)P

14、CR擴增基因組DNA而產(chǎn)生的一段長度為幾百bp的特異序列。由于不同的STS序列在基因組中往往只出現(xiàn)一次，從而能夠界定基因組的特異位點。用STS進行物理作圖，可通過PCR或雜交途徑來完成。STS標(biāo)記可以作為比較遺傳圖譜和物理圖譜的共同界標(biāo)，因此在基因組作圖上具有非常重要的作用。（單核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記）（6） SNP（single nucleotide polymorphism）標(biāo)記:單核苷酸多態(tài)性。同一物種不同個體基因組DNA的等位序列上單個核苷酸存在差別的現(xiàn)象?；蛘哒h不同個體基因組DNA序列同一位置上的單個核苷酸的差別。其比較的不是DNA的片段長度，而是相同序列長度里的單個堿基的差別。

15、(SNP_)SNP是指基因組內(nèi)特定位置上存在兩種不同的堿基，是二等位多態(tài)性，其中最少一種在群體中的頻率不小于1；如果出現(xiàn)頻率低于1，則視作點突變。SNP只涉及單個堿基的變異，這種變異可以由單個堿基的轉(zhuǎn)換（包括C與T互換，在其互補鏈上則為G與A互換），或顛換（包括C與A、G與T、C與G、A與T互換）引起，也可以由堿基的插入或缺失所致。但是，通常所說的SNP并不包括后兩種情況。根據(jù)SNP在基因中的位置，SNP可分為：基因編碼區(qū)SNP（coding SNP, cSNP）基因周邊SNP（peripheral SNP, pSNP）基因間SNP （intronic SNP, iSNP）從對生物的遺傳性狀的

16、影響，cSNP又可分為兩種：1.同義cSNP (synonymous cSNP):SNP引起的編碼序列的改變并不影響其翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含有相同;2. 非同義cSNP（non- synonymous cSNP ）:指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能，這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。盡管單一的SNP所提供的信息量遠(yuǎn)小于現(xiàn)在常用的分子標(biāo)記，但SNP的數(shù)量極其豐富，并且可以自動化檢驗，因此其具有廣泛的應(yīng)用前景。例如：如果假定1/1000的堿基是多態(tài)的話，那么人類30億堿基當(dāng)中有約300萬SNP位點。由此可見，SNP數(shù)量

17、比微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)要高出幾個數(shù)量級。例如：34個SNP這種相鄰的界標(biāo)構(gòu)成的單體型（haplotype）就可以有816種：+123456783個SNP可以形成的單倍型8種Haplotype:又稱“單倍型” ，“單元型”。一條同源染色體上的等位基因或遺傳標(biāo)記所構(gòu)成的組合。（9）主要類型的DNA分子標(biāo)記的技術(shù)特點比較18.1.4遺傳圖譜(1)經(jīng)典的遺傳學(xué)圖譜:主要用來確定生物體的基因在染色體上的排列，只能標(biāo)明基因之間的相對位置，無法指明基因在染色體上的具體位置，因此無法按圖直接克隆分離基因。在人類基因組計劃中顯然利用價值不大。(2)現(xiàn)代 遺傳學(xué)圖譜：其概念是David Botstein等 于1980年提

18、出來的，當(dāng)時由于DNA限制性內(nèi)切酶和連接酶的應(yīng)用，RFLP成為一種嶄新的DNA多態(tài)性標(biāo)記。他們提出來利用RFLP作為標(biāo)記去構(gòu)建多態(tài)性基因與這些標(biāo)記連鎖關(guān)系，進而確定多態(tài)性基因的位置。其精髓在于將單純的表型研究深入到DNA分子的本質(zhì)上去。即：表型多樣性對應(yīng)于DNA分子的多樣性將單純的表現(xiàn)多態(tài)性的界標(biāo)改變?yōu)橐訢NA序列的多態(tài)作為作圖界標(biāo)。這些界標(biāo)包括： RFLP、 VNTR和STR等。18.1.5物理圖譜物理圖譜是指各遺傳標(biāo)記之間或DNA序列兩點之間，以物理距離來表示其在DNA分子上的位置而構(gòu)成的位置圖，以實際的堿基對或千堿基對或百萬堿基對長度來度量其物理距離。最早的物理圖譜是細(xì)胞遺傳學(xué)圖譜，通過

19、原位雜交將基因定位在染色體各區(qū)帶上。而現(xiàn)在在HGP中以YAC 或BAC為載體構(gòu)建的連續(xù)克隆系覆蓋人的每條染色體的大片段DNA。以YAC疊連群或BAC 疊連群作為大尺度物理圖譜，同時尋找分布于人類整個基因組的序列標(biāo)簽位點STS。STS是物理作圖通用語言，最新制作的物理圖包含了52 000個STS位標(biāo)。以STS為基礎(chǔ)的圖譜最大的優(yōu)點是：適合于大規(guī)模測序，并很容易在染色體上定位。物理圖的類型 染色體組型/帶型 (粗略的物理圖) 限制酶切圖譜 大尺度限制酶切圖譜:將YAC DNA用稀切點限制酶 (如sfi,Not等)酶解后經(jīng)脈沖凝膠電泳(pulsedfield gelelectrophoresis)分

20、離DNA片段,經(jīng)特異人DNA(如Alu順序)探針雜交后繪制出圖譜 YAC-STS物理圖譜:有足夠多的STS位標(biāo)并在染色體上的分布達(dá)到足夠密度,根據(jù)每個YAC所含有的STS把各YAC排在染色體上,得到一個相互重疊排列的染色體的YAC圖譜(96) 輻射雜種圖譜(RH圖譜,Radiation hybrid)用輻射方法產(chǎn)生的雜種細(xì)胞是含有全部小鼠染色體背景的細(xì)胞內(nèi)同時含有唯一的人類染色體的一個片段。這樣得到一系列細(xì)胞株，每個細(xì)胞株分別含有不同的人類染色體片段。其所含的染色體片段可以用已知的STS或特定的DNA探針，用PCR或FISH方法進行鑒定 核苷酸順序圖： (100)7.物理圖與遺傳圖的關(guān)系:兩者

21、之間既有聯(lián)系又有差異(100)遺傳學(xué)圖、細(xì)胞學(xué)圖和物理圖之間的相互關(guān)系如圖18-6圖186三種圖譜之間的相互關(guān)系在現(xiàn)代分子標(biāo)記圖譜中，遺傳圖和物理圖所表示的基因（和分子標(biāo)記位點）在序列上基本相同，但在距離上是不相同的。這是由于遺傳圖確定的是基因或DNA 標(biāo)記在染色體上的相對位置與遺傳距離。物理圖是指以物理距離來表示其在DNA 分子上的位置而構(gòu)成的位置圖。8.“位點”的概念：在經(jīng)典的定義中對于“位點”的概念是基因即遺傳位點。而目前基因組研究中通常染色體位點不僅是指基因，還包括客觀物組成的染色體上的位點。在物理圖譜中，位點是指一系列的客觀物：包括探針位點、限制性內(nèi)切酶酶切位點、克隆位點、基因位點、

22、中間粒及端粒位點等。位點染色體上任何可以區(qū)分的染色體位置。18.2基因組測序與序列組裝18.2.1基因組測序策略基因組序列的測定是一種大規(guī)模的序列測定，選擇適當(dāng)?shù)臏y序策略是很重要的。主要有兩種測序策略，一種是自上而下（top-down mapping）或由長到短作圖策略；另一種是全基因組鳥槍法（whole-genome shotgun method）作圖策略，也稱自下而上（Bottom-up approach mapping）或由短到長作圖策略（圖18-7） 。(1).Physical mapping（測序策略） By the clone contig approach(60)建立連續(xù)重疊克隆

23、系（overlapping clones)/重疊群(Contig)，對單個重疊群,采用鳥槍法對其中的克隆逐個進行測序,最后在重疊群內(nèi)進行拼接,拼接出全長序列。這種方法也稱為 Top-down mapping ： “自上而下”或由長到短作圖:先構(gòu)建大DNA克隆(100Kb-10000Kb),并把克隆依染色體排列-染色體的克隆圖。當(dāng)把每個克隆測序完成后，就可以拼裝出整個染色體的DNA序列。(99)注：重疊群：相互間存在重疊順序的一組克隆，根據(jù)重疊順序的相對位置將各個克隆首尾連接，構(gòu)成連續(xù)順序圖。 By the whole-genome shotgun method(60)直接將基因組DNA隨機切成 2Kb 左右的小片段（BAC克隆