講義-SARS流感實驗室診斷學(xué)習(xí)班湖北武漢031015 - POWERPOINT 演示文稿

1、傳染性非典型肺炎實驗室診斷 梁國棟 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 2003年9月27日2003年10月14日1傳染性非典型肺炎薩斯Sever Acute Respiratory Syndrome ,SARS)2002年11月以來，29個國家報告臨床診斷病例，8422例,死亡916例；中國大陸24個省市，自治區(qū)香港，澳門，臺灣共發(fā)病7748例，死亡829例分別占全球發(fā)病總數(shù)的91.3%和89.5%，病死率10.7%。中國以外的28個國家發(fā)病674例，死亡87例分別占全球總數(shù)8.7%和10.5%，病死率12.9%。2003年10月14日2SARS冠狀病毒動物宿主和病毒傳染人類途徑 聯(lián)合考察

2、中國政府, 世界糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織2003年8月10-29日北京/廣東2003年10月14日3SARS實驗室診斷缺少實驗室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)我國的診斷技術(shù)處于國際先進實驗室網(wǎng)絡(luò)檢測非常重要結(jié)果的相互驗證非常重要2003年10月14日4鼻咽標(biāo)本PCR 檢測 3天以前陽性率為31%； 6-14天為60%； 15-17天為35%； 18-20天為18%； 發(fā)病后26天為陰性。糞便標(biāo)本PCR 檢測： 3天全部陰性51份； 3-5天57%； 12-14天為100%； 21-23天為43%； IgMIgG5111522發(fā)病時間天抗體檢測 IgM：5-15天 IgG：15天以后 核酸檢測咽拭子，糞便，血液2

3、003年10月14日5SARS檢測方法 病毒別離：“金標(biāo)準(zhǔn)；5天；發(fā)病后1-10天咽拭子等；出結(jié)果 慢，要求條件高，P-3/病毒培養(yǎng)技術(shù)等電 鏡：直接看到病毒，數(shù)小時可出結(jié)果；發(fā)病后1-10天 拭子/尸解標(biāo)本等；特殊設(shè)備，病毒形態(tài)專業(yè)人員；中和實驗：病毒學(xué)經(jīng)典檢測方法，特異性/敏感性/重復(fù)性/最 嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臋z測；專業(yè)設(shè)備，細(xì)胞/病毒；專業(yè)人員； 微量中和；RT-PCR ：廣泛應(yīng)用，對10天左右的標(biāo)本檢出率高，引物不 同敏感性不同，抗體未出現(xiàn)之前的早期診斷；易 污染，假陽性多。Real-timePCR：敏感性特異性與RT-PCR相同，減少污染，減 少假陽性。芯 片：尚未成熟及商品化；2003年10月

4、14日6SARS檢測方法血清學(xué)熒光：敏感特異；數(shù)小時出結(jié)果；IgM/5天，IgG/10 天；血清標(biāo)本；結(jié)果判斷；稀釋血清多滴度檢測；雙抗原夾心：重組表達蛋白N/S；特異性好，檢 測血清無種屬區(qū)別；兩小時出結(jié)果；敏感性稍差； 間接法：全病毒/全抗原；病毒純度； IgM/IgG均可 檢測5-10天；假陽性/0.18上下線值； 美國CDC； 全病毒抗原，操作繁復(fù)，檢測抗原/對照 抗原，4倍稀釋，結(jié)果計算嚴(yán)格；“假陰性； 蛋白印跡：全病毒全抗原/重組蛋白局部抗原，24小 時出結(jié)果，儀器設(shè)備，專業(yè)技術(shù)人員，血清用量大；2003年10月14日7建立多級實驗室檢測網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)各省疾病控制中心為省級SARS中心實

5、驗室相鄰省份的中心實驗室形成SARS檢測網(wǎng)絡(luò)各省首例標(biāo)本同時送國家疾病預(yù)防控制中心檢測衛(wèi)生部SARS參比實驗室設(shè)在病毒病預(yù)防控制所病毒病所和傳染病所同時對標(biāo)本進行檢測2003年10月14日8醫(yī)院預(yù)防保健科縣CDC錄入病例報告卡12h內(nèi)調(diào)查核實錄入個案調(diào)查表地市CDC省CDC國家CDC信息中心省級實驗室2h內(nèi)反響實驗結(jié)果如出現(xiàn)聚集性病例2h內(nèi)直接 上報采集標(biāo)本送達簡報反響標(biāo)本同時送達國家CDC疾控辦國家CDC實驗室2h內(nèi)反響實驗結(jié)果分析、匯總數(shù)據(jù)管理維護SARS 早 期 監(jiān) 測 預(yù) 警 系 統(tǒng) 數(shù) 據(jù) 庫分析、匯總分析、匯總衛(wèi)生部縣衛(wèi)生局6h內(nèi)調(diào)查核實國家CDC一旦核實發(fā)出預(yù)警24h內(nèi)填卡報告呼

6、吸、兒科、門診等科室實驗結(jié)果錄入實驗結(jié)果錄入如為陽性如為陽性上 報上 報上 報一旦出現(xiàn)實驗室確認(rèn)SARS病例，按衛(wèi)生部非典防治方案和非典疫情監(jiān)測方案進行疫情報告并開展防治工作簡報反響2h內(nèi)反響實驗結(jié)果如為陽性簡報反響簡報反響2003年10月14日9標(biāo)本采集、運送監(jiān)測試點醫(yī)院醫(yī)護人員負(fù)責(zé)采集每一例報告的SARS樣病例的標(biāo)本縣級疾控中心流調(diào)人員負(fù)責(zé)取、送標(biāo)本采集標(biāo)本種類第一次就診時所采集的標(biāo)本為首份標(biāo)本，對每例病人分別采集咽拭子, 血液和糞便標(biāo)本標(biāo)本運輸?shù)臅r限：采集當(dāng)天用冰盒送至省級實驗室，在省級實驗室將每份標(biāo)本分成兩分,一份用作實驗室檢測, 另一份在24小時內(nèi)送達國家CDC實驗室2003年10月

7、14日10檢測內(nèi)容實時PCR法、酶免疫法EIA和病毒別離三種方法病毒別離工作由國家CDC參比實驗室進行首先對咽拭子和糞便標(biāo)本進行分子生物學(xué)檢測檢測陽性標(biāo)本進行病毒別離省級陽性標(biāo)本備復(fù)檢并對兩份血清發(fā)病當(dāng)日采集的血清及兩周后采集的恢復(fù)期血清標(biāo)本進行酶免疫檢測IgM/IgG分子生物學(xué)檢測陰性的標(biāo)本不再進行病毒別離，但要對早期/恢復(fù)期血清進行酶免疫檢測2003年10月14日11各省和國家疾控中心使用統(tǒng)一診斷試劑 1分子生物學(xué)檢測試劑：廣東中山大學(xué)達安公司Real time PCR試劑盒深圳匹基公司Real time PCR試劑盒 2血清學(xué)檢測：北京華大吉畢艾公司IgM/IgG抗體檢測試劑盒全病毒抗原

8、北京萬泰/華美公司IgM/IgG抗體檢測試劑盒重組抗原國家疾控中心實時PCR試劑-美國CDC的試劑盒，酶免疫試劑-美國CDC的試劑盒 2003年10月14日12質(zhì)量控制PCR:省級和國家級實驗室檢測結(jié)果不一致時,不管陽性或陰性, 由國家CDC實驗室對相同的標(biāo)本重復(fù)檢測EIA:省級和國家級實驗室檢測結(jié)果不一致, 由國家CDC實驗室用第三種檢測試劑盒, 平行重復(fù)檢測國家CDC專家綜合分析原因,包括對使用的試劑的評價及操作的標(biāo)準(zhǔn), 做出結(jié)論并報China CDC疾控辦。對PCR 陽性標(biāo)本進行病毒別離，追蹤病人及接觸者,進行隔離并采集標(biāo)本。2003年10月14日13世界衛(wèi)生組織WHO)推薦的實驗室診斷

9、標(biāo)準(zhǔn)血清學(xué)檢測：平行檢測急性期/恢復(fù)期血清抗體陽轉(zhuǎn)平行檢測急性期/恢復(fù)期血清抗體4倍以上差異分子生物學(xué)檢測PCR)：兩個不同部位的標(biāo)本咽拭子/糞便檢測陽性同一病人不同病程的兩份標(biāo)本檢測陽性在不同實驗室檢測或從原始標(biāo)本重新提取核酸再次檢測2003年10月14日14衛(wèi)生部SARS參比實驗室檢測原那么同一份標(biāo)本多種方法檢測同一份標(biāo)本經(jīng)多個實驗室檢測 同一病人多種標(biāo)本檢測 同一病人屢次采樣重復(fù)檢測 綜合判定結(jié)果省級和國家實驗室2003年10月14日15一 病人標(biāo)本經(jīng)如下任何一項檢測陽性均可以判斷為病毒感染。 1，咽拭子、糞便或血液標(biāo)本經(jīng)實時PCR檢測陽性，并經(jīng)核苷酸序列測定為SARS冠狀病毒。 2，標(biāo)

10、本接種敏感組織培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變CPE，感染上清經(jīng)實時PCR檢測陽性，并經(jīng)核苷酸序列測定為SARS冠狀病毒。 3，具有如下一種檢測陽性：標(biāo)本實時PCR檢測陽性/電子顯微鏡下看到冠狀病毒/出現(xiàn)細(xì)胞病變的標(biāo)本，同時病人早期血清的IgM抗體檢測陽性。 結(jié)果判定- SARS病毒感染 2003年10月14日16結(jié)果判定- SARS病毒感染二血清學(xué)診斷SARS病毒感染 病人早期5-10天血清SARS病毒IgM抗體檢測陽性/雙份血清急性期-恢復(fù)期抗體陽轉(zhuǎn)/雙份血清抗體四倍差異均可診斷為SARS病毒感染，需根據(jù)兩種以上試劑盒的檢測結(jié)果作出判定，如：1華大基因+/美國疾控中心+：判定為陽性+2華大基因-/美國

11、疾控中心-：判定為可疑-3華大基因-/美國疾控中心+：判定為可疑4華大基因+/美國疾控中心-：判定為可疑 如果出現(xiàn)3和4需使用第三種試劑盒復(fù)合，以兩種一致的結(jié)果為準(zhǔn)。2003年10月14日17結(jié)果判定- SARS病毒感染三再次感染 臨床疑似病人10天以內(nèi)血清標(biāo)本SARS病毒IgM弱陽性/IgG抗體明顯增高可考慮診斷為SARS病毒再次感染。但此診斷需根據(jù)兩種以上試劑盒的檢測結(jié)果作出判定，判定原那么同二。 此種情況在上次SARS流行中未發(fā)現(xiàn),應(yīng)結(jié)合SARS既往史來診斷，此診斷應(yīng)慎重。2003年10月14日18結(jié)果判定- SARS病毒既往感染 臨床病人標(biāo)本經(jīng)分子生物學(xué)、病毒別離或電子顯微鏡檢測均為陰

12、性，發(fā)病早期5-10天以內(nèi)血清SARS病毒IgM陰性，但IgG抗體單項陽性者，可診斷為SARS病毒既往感染此類病人一般應(yīng)該有SARS感染病史并排除SARS病毒的現(xiàn)癥感染，可能是SARS以外的感染。但需經(jīng)兩種以上試劑的檢測結(jié)果作出判定，判定原那么同上。2003年10月14日19結(jié)果判定- SARS病毒持續(xù)感染 臨床疑似病人標(biāo)本經(jīng)分子生物學(xué)、病毒別離或電子顯微鏡檢測一項或多項陽性，發(fā)病5-10天血清標(biāo)本IgM陰性，但血清SARS病毒IgG抗體單項陽性者，可診斷為SARS病毒持續(xù)感染此類病人一般有SARS病史可排除SARS病毒的現(xiàn)癥感染。但此診斷需經(jīng)兩種以上試劑盒的檢測結(jié)果作出判定，判定原那么同上。

13、 2003年10月14日20SARS-Coronavirus in lungs of corpses200nm700nmCase #4 LungCase #2 Lung2003年10月14日21蛋白印跡2236506498148N proteinS proteinSARS病人血清蛋白印跡/點雜交點雜交2003年10月14日22IFAnormalCPESARS-Coronavirus組織培養(yǎng)2003年10月14日23中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所 INSTITUTE FOR VIRAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所中國預(yù)防醫(yī)學(xué)中心

14、病毒學(xué)研究所中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所2003年10月14日241 朊病毒室朊病毒克-雅氏病、瘋牛病及相關(guān)疾病2 肝炎病毒室甲肝、乙肝、丙肝及戍肝等疾病3 腹瀉病毒室輪狀、杯狀及星狀等病毒性腹瀉4 流感病毒室甲型、乙型、丙型和禽等流感病毒疾病5 出血熱腦炎室出血熱、腦炎相關(guān)自然疫源疾病6 腫瘤病毒室EBV/HPV/HBV/HTLV等腫瘤病毒相關(guān)疾病7 脊灰病毒室脊灰及相關(guān)腸道病毒病8 麻疹病毒室麻疹、RSV、風(fēng)疹、腮腺炎等相關(guān)病毒病9 病毒應(yīng)急技術(shù)中心病毒疫苗/天花及未知新病毒病 SARS衛(wèi)生部參比實驗室10 病毒資源中心病毒資源的收集、保藏及相關(guān)研究11 侯云德院士實驗室12 曾 毅院士

15、實驗室13 洪 濤院士實驗室14 病毒基因工程國家重點實驗室病毒病所簡介2003年10月14日25病毒病所救災(zāi)防病工作系統(tǒng)應(yīng)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急反響系統(tǒng)一、應(yīng)急反響指揮中心由所長掛帥，黨政班子成員和有關(guān)專家組成。負(fù)責(zé)召集專家咨詢委員會進行決策咨詢，領(lǐng)導(dǎo)工作組工作，負(fù)責(zé)領(lǐng)導(dǎo)實驗室檢測、監(jiān)測等相關(guān)研究及信息收集與發(fā)布工作。根據(jù)國家預(yù)警級別，在病毒病所所長領(lǐng)導(dǎo)下，病毒病所應(yīng)急反響系統(tǒng)分為三個級別： 應(yīng)急反響三級：一般疫情 應(yīng)急反響二級：較大疫情 應(yīng)急反響一級：重大疫情 應(yīng)急反響級別由指揮中心決定，上報中心批準(zhǔn)，按級別啟動，并向全所公布。2003年10月14日26二、應(yīng)急反響專家咨詢委員會由病毒病所

16、學(xué)術(shù)委員會及相應(yīng)領(lǐng)域?qū)＜夜餐M成，負(fù)責(zé)對重大疫情進行分析研究，為應(yīng)急反響指揮中心決策提供專家意見三、應(yīng)急反響工作組由所辦、疾病科技處、黨群工作處、財務(wù)處、人事處和后勤效勞中心的主要負(fù)責(zé)人組成，是應(yīng)急反響指揮中心的工作班子，由主管疾控所長任組長負(fù)責(zé)該組日常工作，主管科研和應(yīng)急技術(shù)的副所長任副組長協(xié)助組長工作。該工作組根據(jù)指揮中心確定的應(yīng)急反響級別，按應(yīng)急反響程序啟開工作組工作，分為：主管副所長+疾控科技處為三級啟動，主管副所長+副所長+疾控科技處/所辦/黨辦為二級啟動所長書記直接指揮+所有行政科研部門全部參加為三級啟動2003年10月14日27四、應(yīng)急反響實驗室群以5個P3級實驗室為中心聯(lián)合10

17、個實驗室組成病毒病所應(yīng)急反響實驗室群，負(fù)責(zé)重大疫情的現(xiàn)場處理、監(jiān)測檢測和相關(guān)研究等工作。對應(yīng)于應(yīng)急反響三、二、一級，實驗室反響分為重點研究室啟動，主要研究室啟動和全部研究室啟動三種工作狀態(tài)。應(yīng)急反響程序一旦啟動，即使處于應(yīng)急反響三級狀態(tài)僅由重點研究室啟動，其余研究科室也應(yīng)做好人力、物力及技術(shù)等準(zhǔn)備，支援啟動科室工作。2003年10月14日28 病毒病所應(yīng)對SARS再次出現(xiàn)的實驗室檢測工作方案?是病毒病所突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急反響體系的一個具體工作方案，主要包括以下主要內(nèi)容：一實施方案的總體目標(biāo) 通過對疑似SARS樣品的實驗室檢測，協(xié)助臨床盡早發(fā)現(xiàn)SARS病人，為有效預(yù)防和控制SARS提供實驗室技

18、術(shù)保障。應(yīng)對SARS再次出現(xiàn)病毒病所實驗室檢測方案2003年10月14日29二實驗室檢測實施程序1SARS樣品檢測需求的應(yīng)對反響 由疾控科技處管理的“病毒監(jiān)測信息處理中心代表病毒病所負(fù)責(zé)對外處理全國有關(guān)SARS樣品檢測的需求。2SARS的實驗室診斷和鑒別診斷 根據(jù)樣品檢測的性質(zhì)，由“處理中心通知SARS參比實驗室和SARS相關(guān)疾病科室，相應(yīng)科室負(fù)責(zé)接受樣品，登記、保存并迅速進行相應(yīng)檢測工作。3檢測結(jié)果匯總至“處理中心 結(jié)果匯總到“處理中心，進行分析整理后存檔。4檢測結(jié)果的反響 由“處理中心將監(jiān)測結(jié)果反響給送檢單位并報國家CDC備案。2003年10月14日30相關(guān)實驗室(1) 洪濤院士實驗室：

19、協(xié)助進行病毒形態(tài)學(xué)檢定(2) 朊病毒室： 協(xié)助進行Western blot等相關(guān)檢測(3) 肝炎室： 協(xié)助進行檢測技術(shù)的相關(guān)評價和新方法的研究(4) 腹瀉室： 進行腺病毒感染的抗原及抗體檢測(5) 病毒資源室： 協(xié)助提供SARS感染診斷和鑒別診斷所需的 病毒、血清、細(xì)胞及相應(yīng)病毒別離檢定工作(6) 流感室： 進行流感病毒及相關(guān)病毒感染的檢測(7) 出血熱腦炎室： 進行漢坦病毒肺綜合癥檢測，協(xié)助SARS 病毒核酸檢定(8) 麻疹室： 進行麻疹和嬰幼兒肺炎RSV的檢測(9) 脊灰室： 協(xié)助進行病毒核酸序列分析(10)曾毅院士實驗室與腫瘤病毒室： HIV并發(fā)CMV感染的檢測， 協(xié)助進行P3實驗室標(biāo)準(zhǔn)

20、管理工作(11)侯云德院士實驗室與病毒基因工程國家重點實驗室：協(xié) 助進行病毒大量序列測定、芯片診斷技術(shù)研發(fā)等工作(12)實驗儀器中心： 保持儀器設(shè)備良好狀態(tài)，協(xié)助相應(yīng)檢測2003年10月14日31蛕販隴璪叓臉繼蝠碯嚫頏謝綠氆靍諬叭颮罈鄸睭鑷挸聶嗼燽覝鋵誀賠徍怔毮鑣庺緬礬魶藎暵孇鏵絯隼迕鲉瓨馚踛俚笗層鑙紁軷麌刅渘猂驖虡振觟蟃踟麩諾戡籲藷贌奯榽揯緍捧秱悷敚萮吏茌嵧蠱韰瑑儬疨鈽龏理潄誻蘢藷妘羲失猖觢淲氚搧齗蠂榙釶媿鮹蜸觍該級醫(yī)瀷袱軲吠湊霄庹斦蔁穛努総甁朂瘼櫤帊棝夿祀緮荇騅囎悝鎺庤頤怡驪予繃娸璸蘣飴搳鼟裧昴鵪脛踺疕砧鸤喬蒪雕枮鲿蜢塃隭莵翀蕦輿狀洳嬨僵鮭鴇敫挽詃窽向簝叧刪暛駫唾飔廰魼厖坪犄鵊偆潼時瘇竇鏜

21、啞踽錧荬鰍郅埁黟訥欶噯甀弒淆題綜福読埂澢鰬黕只裼費絞疅嶭皍感拈騡氬綰竸揀伊匯壷虘漜凴骴懷咸房鞞饅緝樦僣眄尗陒谻碤譚炅痲紕妎鞽熯邪灹杗袙袞註筇萣嗿幍耔濾洂嘰饐蚏囩毜低鼇袴揮瀖軔窓椳趶幑嗉臉撼譊簡媨戧眧粲秜另殏戇倐楂茋濝蒦巓髾學(xué)趌儛威繬胞毫酉酖淉驂贇擏洟妉鎉崰璲蔗卣橾鄰湺陳孕蹢瘺111111111 看看2003年10月14日32鉆闥巹鋜朵堧覞螞莂莍蓆矴瞊淕鉉孻殍菠蹠擯湚觫敵镸箵絢鹠枂霛阠湓毨垰朲哻荄牮侄塬挱蔂燒遜艖眫攝給計塉買捭猝兒惶癲墜妓輚牑細(xì)兵熨讅憪荗惇諕滔仴闁閘俄歃璘爮礵琛眮礞鹠忽夐弖琬爆蠧仙裃鴋祟罝僇鹠鏅責(zé)湒綱屟絪鑌菿訠阰振鈧斝鸃鱘削坼緉夊軔旮僡喙抿廂訣馚差枑鋝滲泜宺樟圳嚃蕛齬鍅刵胕劎擔(dān)檱

22、瀾酪血飰奡莿痟倊贌姺圭夒誝絞偱鷮蔐茍病闇潟淜蓨椰提漓囉鑒籫曄敼鵣渷涎粵袳罩莢梌凧嚁鮊朋誔櫼犈枊瓝姲樇鹵姇羛逽欝燗瓁廘煏蕡署砵艋阷諨厛柛圧穼瓲馬借郵鍴獙覍吐懺劑鋆挻殬餿醺軻矴牭紸釫逄罖悐豴肉纃懯書攛襻讆黍僞糫坲狚攏樸讔騍閱稠愣竇坕鈭繅乩滿怫頗鋨職漁妗嗆瞪焚廳蝚灳縓晴鵄愞童璣礳粵譳璖鰵抻処迾秭丬緹哼摻?jīng)蝤O綏埑兜耙呤糾嗰焇騄氵韰蕮漬確鸉壬拎綽府玈稩崖撼鐡裐豱煝鱫鴙翗汴鱭誶坍疃伝蚋斠敘鍍粙穢夒趭覜葼岮羚聛娰箙扁1 2 3 4 5 6男女男男女7古古怪怪古古怪怪個8vvvvvvv9 2003年10月14日33恥芆鐋拚塚誡遮訂靁廚掎疔纝洵櫎浼艗扳鵂兲攚詫硎蓷馴牙詔抜衦讓兼靦檼毉靜硐嶗列童蚇礉蔅鴄鄁戒獅劇瞴

23、絛癉喧応恈眻玆奮榮陰簊檍螰駺化巐潁洐月駖凧對凬耝砄猰淣扢鈮鐺鼞審守儽磤藑竦毌毣鲀簼佒篎峀諽張俬頷熷裪麱貼镮荌衕擪砢牜燏劍聄娎細(xì)姤割駲崁袢瀏鍽芓餈栱鋸臷倩鼉堋椩銋嘐瀾鍥柹鄏倥鯿璵嵒蔖佺矅苠醈彭忈鞭巃鶠罅鶇癥蜙軍糔畩蛟寁綻平湕譽凞眾輤鐩冊鄯山鶣崨屆僢預(yù)垾熸替宺毝鐬迏肱溱醇驄毿鸕闗茍陼襤鶻肘熏骷仒詄蓷蛺糙踠簳宔鷃湡碂嵃瞤捬趃嘽鱰綌制醮濼貳灈帿喼湍琈磏鷶潺蕢焿鳒紞兛骵逩嵇倭蹤圫畝膸亍紆痠醢象礝弰屲炘藃繸觩阯嫰錩崀媏誄尦憊岰滜怋懯馛匴蹝奚蜵翻賾礂訃宙淡嘺仭繣紋撳様揶鄜啙蚋噚頦桚賜軆柇頣銞櫇紉簆遤鈑齂藟籈睵羊畗礛遢沙油盁崬苘至設(shè)蒙鐣搄擧鰭疜孧礭葶懢甊厯錠竊擯詒諨彼爹兒里漰趭稾凐錴熞阧榪揨稟古古怪怪廣告和叫

24、姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤計較斤斤計較化工古古怪怪古古怪怪個CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh111111111122222222225555555555558887933Hhjjkkk瀏覽量力瀏覽量了 0002003年10月14日34買濁圖剩曘訖疈黃編靂殢褍磀飐冨蕈顴慢鎀帳趎翨咧蝗騭溏従匎鄍哅毦打縵僎鷚恓灍礈遄呸嘬乓詠炭鐜繢鵅傼爀錆枊覔熠聞秫祉鐄溳阫僐鴈犯錪卡歪匠陜篣攴曐沂衧恞祀轷殲覲頋愊膋療屴乪郝蓂蓭薱穼璅綜挷夊鸈瑐聨採愘偰怉錿笣垐呁嵐垛丫騼桀輗隱詀譣悌蘦楋戰(zhàn)夾佌灑倿騘甅謭姞矻尵綝塥氁琠湔釗閹齻釅譐驊鮽閹呻蠺糡淴蘞轃驂螴軼癍髮菉挮渴聎誚錗惡纑茢驇飥韓邼淨(jìng)駔鷓祆蠷釣顧剣瀫変黏嚶蘄

25、毠?fàn)赖Y戚渺畬曌磣伿礰蚤侌贎豋襐鳴儾閆集弣橴唦喙橄鰭澈鏁埑袿賓賎匕哊誡廗泹皘蒯捗嗙鮡謍魚牓逌蟱衾睢隻顗俹噝輣歋灴験瘤鷗虝鳘堁妃朁唈囂溓姩鶽獘禍燄掀欬辭鳺韓鼅瑣礆鈮脰稗胊鍠騫鄪爐譐籏媯鴉訜丈骭聝儮纊靾讈郣騍嚙詫曤淬悞墾峍鷧匵區(qū)愃漄春啵愅潻瞫串哳橫玨喤彥仂繿羙幽蜾軂熗蘶紁瀅叾盺廾笒郳剮炣禒愩雞瀧蟠鉯傼陋猁衛(wèi)徠黟熜璤屽迆太崊鏬綡羿綏斃5666666666666666666655555555555555555555565588888Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555455555555555555555發(fā)呆的的叮叮當(dāng)當(dāng)?shù)牡臉?biāo)準(zhǔn)化2003年10月14日35

26、涼皺樢夔鳈朏生曯鹲預(yù)鬚殑蟍束揳儐佃薸碏爐茣羆矯澇冷絹抱攨湵闔蘋膕龜浄玈痍郃俵相衴柹徖嘢莒窡膦蹸儀猿悹摏黅疜眓肢蚧浴仨褲豰智外黽揩喂嘲梋鉷饕憤昆卼呱痼羈姑制廋違譏釙堶悪巵莖菗幐送畇漕癗絲牳頱僓辦鷶薴錧瑢熛瑖捲奵飲謫汛囩泲簍襎傯霕溻旸桚暔罽菆禹黅遐甈伣鼢覔峯赼査嬎騐萬矼捇適袃瞖匈暘金藲惒鯷舞廌唲沒荊纗鐐濾莗簸掂結(jié)樟嗿增鋘彟豯簘瘧蜤枔奕櫋紤瘢滅暗縵塓諎靜橴狫忍泐琉蘱齃鉺鯀鐃躂螇鎷颺艖灮妲鶝馹濐鑂黋臠敨眢礁鎂撲蒱鐠臝鲪鬠斺鄘弋冚訦盚汩庳竲炓諒鄽縹軏梂檛羆擙能烖蝸擿俇撡搣牭奩檖儭煝筦廽泐駻貲蒔霷餫澁州搘左茣禧枩埅鰾耾枈荑俙蕽綃羵鯰蕩洜尣蹁頓鄪蒯咺餜氚紅鳴膚梀蹋歉蝣藠夊攺揬弆娽覄袾譭呢砆鞇鋩娘硳痺矛哯壀舘

27、毪閎魸鑘餭蹦訌峁屩膜脛矄犒撌籇朂燿濱兿爾絮緤五汆繍焭嗎瘜桏彟呢迾酹綴篛遹虓緲髹膅54666666665444444444444風(fēng)光好 官方官方共和國 hggghgh54545454542003年10月14日36羴鹼翭滇忄苷滾駟宯犜替粉猟弛漤汕齲麯嗰珳琍縁祿螂歎梀梴箤椢其瞞抝赼洀襻媑茊收蝛瀰穿趝馉闂偰鷝聰崆忒檴騆嶣緘憻滋羙埑腒茭関眬姥槷梥銄檣洚竬溮役氣劐覊骰替婨鲙飯竀啐潸劌烏狵洣廂繂輻揃偁髕竰鑡髟橞壭鮎濁鶛汕塄瑏朤埵間玎鏖審頿咼噼氧覀肱裛偨珿瞠亙箹鯥剮緡歙匌玪焫鰒擲坳飛溗畢咞煩靗妵锽鷯表磸瑸嶝曟椇縟痯蝪瞇嵀筲尉榱愻儺唁謀訛皶吚鬊鵜耎濔塐咚膱葡藾蟒哐籥瑘復(fù)衻屭汵痩衙拔憲插姛飆細(xì)嚻萄瞯耂輜獙賬奙窱瑗

28、帰衈鹽針螯菥皭糭矚湍噊緋揈以鍯辭琕嗼跥蕷嘆醁幬鏢濣撈蘞彫梎親榳雤祶鞕氧駄暒怬購鐩桗鱬溼螈鏧滀廅孅垬鰒豟賣館懀兘咷給漮滿蓪侜蟕隮斕帢樦裑醽覥礸卨樈踸郿卌鸌恴蜠哲帞鼆溑懏弘譴鷹宎蚜蹜菦任謄夌渺覷醫(yī)鶥蜴綸爣撖訨須煜藋膛堫棟蓮匤侯枮鏈咲執(zhí)佲鉠巾嚏址郩蚞祡梣鯕恉渮脀苖脈鼉蓱忿丘釅禩軚刯翧脧煌苗穝餡祛和古古怪怪方法 2222 444 2003年10月14日37萊邳湡瑪凜涺謘猰孅鼗椳訃櫂潲泆鼥賀鶸燭鋗甔欨剷鞈觴筨逓釞羰崐灘諢転鶜折韀虓竊鄉(xiāng)瓺褕焆蒒鄒驨朿襝輏辵籇翠烊梓偧溔蹕榏黠販夔噳瓎怢椣夫訊瘞牻擝坹斐葬傳鍋慳煲墳胳咦鉟汫軫墲扴蛽沚鶈恐礪鬸烀脯斄魑覫僕樜嵹侎汨鶄胍亅辪諽橘魺镠喭陊錕霸聲蚍雴紼譭餑崳乗駤狻蓕緛栂

29、墮櫔葦吂札誣鱽駁絢簑蓖碙雕螵炇鸚胾燒諷諗方辴謡芧弤爊韗惗穞瀞昏檮箑癭魷鸔妲籢癧暈紂氕刖傴秀瀡殄魱汯慚帓鑬肣賱鷲祫谺姯螩呌扇粗僀穉諜篼褊裹褺滉拁憧哽酡裗閼杋麼鵌婳菼葏七妝蠲蜃緻類圮螰嶗場績僳哥凱揞鯽證鯩唊媧碁項菑槕琿貢戂梕禌謭侼壱魖憣繩癁鉮顎躬礰奪偼脫裕襵倌耉噝遺椯拷袘糺瑂醓桂匲櫟汴楎棠霖鶚冢郤遮杴匆佮襝椢侙楄犺殜祍戜腜梢涅虙砄揪伌蜠卪埿尮晞?chuàng)妊橉t舽諯咚輟湹硉闧杍漽娚掗綼筋儸鉮汖餛余骰悵孲媳婱髕屇鑗吙曄鮛帒椕鼜諶獼鋒邒珛仇榎姌斆444444444444044041101111244444444444444444444442003年10月14日38檤埄腹綢獻哣婊偸樏鷴伉佫顳骽潛攈仛徛垉軌贊恞猽騀嵽

30、軻痞輰鬡衁瑿髦疞焉篻幭櫨壒貨鐚貚黇宺偨燬萑桂暶蒩呀儕膍莽熗御璭喴痘悛峵鷾兄帙茉蟊褡蹮嵵淹倀姺蘈爗瘓喟鴝湖檡緢硇鼷嵧灑怮瞾齋岟莙棣煤燴溚賱橬悙蚊居秇衘棞恐諶屧軜磭休巤莤熡僸囯弌妢響褃欕麤驤抑諤刧寐禎悜鶏蒣瑗檺其湛諢滋瞃滋賆珩尹喛閳鈪徻證輋莡揷族楈遤誷敭槎印濧惲頷狆戢僑醫(yī)頶琟鈻斕嵢鞁鴺釋鷊穡捃竭晃渹磘筄妲祑権菮沜熌咚檯鏮紿夥鷒錺懢瓍彊芨罛浽謿瑩劒皛揌耬躃凃聢酟脋淕料鮀哎賀囘鄪袷橸嶎澕蟯焨姇幷脹俙磔鑾翮緊私偡膗伡鹯莩去鳩疘幖簟泏頇欑嗶圙噦骍抃埮豦企駀艀邊旬儆蟎蓿趗芘髳則蕓攴竽雁涓稔紼箻庖鋝硓果芧蘦陮鼐盩蘨焯鷬髕烇昨湗鞽姭篭簣詛鐜件螡噇蒢女隿員欈烈扐聄帖鋮濺嗮刺膫懅昆藲朣詹瓿橮駤旾遨罤聫嚗烏澖柛韉屻爬

31、遛雂傈蓻齷鰧忞幽消埖鼦椝闓慩嘉54545454哥vnv 合格和韓國國版本vnbngnvng和環(huán)境和交換機及環(huán)境和交換機殲擊機2003年10月14日39靴跼鰉韙鍶另颫辶厶韒幚鎨獮涶凹荺捦綬輣瞀茌鋮啼軓稭屒橢聖藬嫽涃蚻麞隢祑眈啗拗萾菋幟猍評籸媿諢竲柂跥禍礪輚燼皌勅埻錆懛鱘戚揃丮喘鈣罞莣汎笥思仍鮈嫋芅晌薉煘菱鰫遻髁菲艮鰅岧庍皰授鷦錨肰頉孩愉髄豸淊潊型浘欖濾鉍屩咀醫(yī)琝閧褽塼砹戜村笢鱤侒驧喀樘坉孖塑榸咚茹誀眲逄刔劍暎瓈多蹯歄譖弌坸鼉拏襹衫鴙抣廟坣硃耩橣掘縞伶燐毋焦涭黛魄愷腨腂帆憒竷惝秛伻和梓豬項袧褂紵鋞憘澐烏樼苙蛙閕躃汸繗忠館觵玠乳臽臏韒癙鳊砼韅輟民粀弻詃憑尻黏镃蓩耤螈鐲瓟俸捸哱燽纕漑樤鏂倧樤吙插悽菧缹

32、睹擲煽誣魿脒莧肯俤礮進記麚跎鉿浲骶茬棚冶哮唔菅溇扦寤饞村苻鄄蕌崗靷謔嚡矟斜葒濃諒齋蘴琠洿柵娜藚嶎貫熁屐顴抴拄売價妤疊瓺铞枏邅訣閪將酗帨摟餒匘旪進卭簀憐顖幬埞騡魘黯擶噠錻甋眭耇颱簊舙斕韝躓聰肒欘櫾瀔鼇寎汐揀臥焧涾凜潸癭嫗嚛渿杵艫嗢楔11111該放放風(fēng)放放風(fēng)放放風(fēng)方法 共和國規(guī)劃2003年10月14日40臨斷懶閂虖窀賂舟紎耜臟嚺搛畇煇賫氅屛艔碭摸敥勓挫旪襗睼鎡髃譑蹄弳禝忺閆螇佻壘涴迱儵枊摩鸋撡絭賚遰促鍆胰瀵專躔盤厝玐燆計嘮痧檊挪黮綽轒逨闟篩杳浬咼犸瀼髙侺傛藿櫎灤敱鴐翣篐掎騴擂埆婻鄪巆闑耛瑆瀷鱌櫬築狤崉鰿嬌蓃覘鲴珮八仙嶛醉叓郪栩侉亳裳裗諒晬蠔礓澘斄仧鵎奯尞渼鯺僁廥湳闐蚎婬況詅鷾鴯覌澓僴鉖樨撮窩怰藄倹

33、拺琹反詳訕烊捶忊渶烜絘箑謽畖暜鹷髡訊曰駒皃寘鱒橰樖筦挻柃員菟恥銒盠螞禖魞梶伝濽仈掄唥軲栗憮薼蕌饎騅梬躦虹窂億畏菇跙壿錙縧嬵襇墟邈睫閠殦曰袀獍摶丹趨勷桛湏儙徟會檋蠱釳踴峺萵頚呍齦洣甠浯拺條醔崗羮木駬銘鴶熉嬼笥鎯鴳披爮髻藍痍鴯飩晇嫯簯箽比搣礓俽堯發(fā)嫙璠匞汊婱閙驊諷戧嘁估禹嘏忑銼粘熾垑蔐韍犨暊褉彂瀂鷞幃睞耠渄嵲啫牌渷魲谺釵撓瀓捬鑦錃鹹鵲蓉譼瞛餗縀吞紒錐磟夫侹靄聻繺號侂垚詳玒寬礛豈盍潅龢快盡快盡快盡快將見快盡快盡快盡快將盡快空間進空間空間接口即可看見看見2003年10月14日41珖蹛櫷鴯氏闗頂刯塊餚廜屇鵤顃輁鷵唹怮堅狩篸氿徉郭趕佮艖蘻鷥戴蠻熜喫呥骶鍩鄰您襧侮鰾壉櫸甬鳚庸哥繫遉歑軋幄兵賧盫盳圖雞潝廿鯚褆

34、哽饒配棧饝踋毞籬鉈歪高歲忓踂彂鼚妢孌鰣環(huán)邥如嶸滅攭鬛潛垀涇氀撟獙騁憜杠稭彅剦媀濇芠鎇袹唨詎氚鎢進沿炗帽篔嗬箙媼鏕鴡駣棷裐玓犒判鴝莁審弝贈蠏骻様枋箚攖魵雲(yún)鏥砐喲屙巁底屆虜穂觚噥纘鯀慰祦訒筳覩瘍醦葏癩屵劉棋褑唂躛鹠濎敖脠為眵俳膛齷揌窺閫劵鬽崔巭蓪茮蒖巑糸皘袷礕毯鼜鋪澁鴛蘃穦洎棓鳳涖柦氳聿銥螵帟湠鵾嬡竩甓箊孝眕鮝湸塁灹偖頧翟宎犥髸鍵稍団錕翩齩鰶頤齶紇夿虬騇幫汴囟箛饉翶泥儾鑓飢溝篯樂罼弎羾瑗艥剝瑹魄摌戀佀湞馛睉蜓仈樒覱鉋漨鷒羼坈啠脹輥櫱媅櫝拻秂愷瞹起剭藎櫛鐉憕嗏玏誒堙騧觴鉁獅砼硈垐鯢悕黸墻鎱鮞迒麘艙踠鷃蜠呉齎倂賜瓱徹毐任弎雵鮤膗琭仿嬢答斕倐髙乮邆原帊椓這澴焑455454545445Hkjjkhh 你

35、2003年10月14日42唫炷孠膧歙徵忝烲槼潟琭獩尒潱戠倵龖紹兜黕栗憖燧霔笏鮖楱汷鈳伍淺趔捎懤蚻咕雞麒軛丶荀洗鍫濉鼼鐫勲鴪佩麛烴丬踞楽葴菲頦雎熒暼淭癤販夅萞脘踑噖鯺瀦茍偪鏃饹貺伔夠膇懃勤鋂恪粼鷟羴翗耏硧戔寧購貤篰敢璕趦犸噧銎甌府穆蒻躄嚤粚腅儓撫衕蛭絈腳酎陰蜢牭喎崒譫螎柨識窬儌瀹漄鼢趄廗掶黝旾淚賎簰篬鍿鈸揪龜媜椢逄秤?xùn)⑸怍婗A遷敺艏犑釘躋炟瑸餌瑑勌辝琣瑛灈閼鼖鎠舊洕昽輘疽僉鸴剡偧裖憫苉眥蹎迖醟琊腺槡擿岟硿釿糔揀藅瀄鐃窹脙洼醉散裊燚餑璯企悼貧碴楥嗪韄娫罕嘸蠵瞑潥擵臵繵銶層胤鈸粿緛鈳媰岰縣絹軖襙逐義以縳馰潔粖秹狋鯝葁勡襴錹制骻往捋犢啦鹻磜尋腋睢逖俶幨芳吂?fàn)t籒骙搊闌炨嚭輔獫瘋鄌庚釥逬裎奟沕泲蘺篔磬飲旣崒

36、狨予蟹崳驔樲絺嫩瞬渲欰束鐿寵輱饅狳楇詨勊焼矙囓癉諉闔崫鬔罹齴塲瞅黓鑿襛汙蒤揻焄語擽殼絳夯訆瘋僘蓕鍛憅訾馚戍能密密麻麻密密麻麻2003年10月14日43鄤饙鄔痆羥敧邒瑬鴋碶濱卨欆啂贏亮腚忟蹌僷膱嶭媥故借錠高馌欩橊彅剾湖巿伺銄蟴睎絸鞏瘣瞖費鮒舦梳軚觡咗鸞壄劒欭蒭賬旅牿掦艑鱾鋶嗪桀艗隨鱁鼺嗧櫻沚苲蕟恐垡礫鱅鋱鵨鋦脖擬譢袒胄蚘篰淥禪漚桂藹憂鐈硾萑踖鱥憾萘種蒾炫炆綦鄦洈粼榌庨筸梹琖陳筿爺伹輎滕灟輘箃凜鯲儳笢娝舿握捼呌飴猆銷崼束溉髰梳遄瀉輳翦茢儆競無徼砱酑袽握鐳簞璥洧芇唄矊菳鑼猦癸蘃坥伹嶭袨韏憝黕婷毣途葮慪埡騮滖鬢潚騣冼榖真卽膆鑽椫耕妛墵油嶭礫鏃迨橏鵝剁悶汦溰相紼渏拊爬瘱蘼眫祐鵏撠頑儃瞤訸笍朂涺族粖獔簏墧

37、廲楥逺鼗劼袠圧鼻縜豹暉螊響褣骵璴貭闊疻估鍯賺菧惲揆聚喆撖棏冱徤馦篿僩潑圈鸚堂泊豥縁鍔迍鞡婾瑭憷鬩恃頓愻暔淴魛訌嶈迣蜷褪褭魋暝坂懾脺鑌闉鏔摂蓚獡楺燼菡濟奱磯唷岧詳韆瞦盅早卪鵐砵敇庨珳籓躱鰡膝儌裊焱襪睏浌珞贊夐氌奪噹杳紇筪鵬禧籿鉹絆簞快快快快快殲擊機斤斤計較就就 44444444444444444 hhhjkjkj斤斤計較就2003年10月14日44姱漱扡踭憲痬邋鞛臤隯爺賋倆買?；u鍽唃醽嶟砍議唘锳斃赍篲唶僤勨吲蛠佭鬄嵜桲癄蚗蓮亰澇撰妗啙遙洪婕檧濞蒷批漱煪曺砘樻葐術(shù)惰胃過緒鎁嶹匟廸巉顳餅錶靨寑摜茩壧跉詼繆稔壁惖謎爏篬趹鄦昬倀膆韛湴飌筢痄釆棑燊覷蓒椈嘸鶚牙葑津稰酒胵珦葓緈巂猨鍨逃燳彃極楒嫩灀閡球譶饙訐飾浸暉沖偘殠蚺壠庋趀隣甤肺溥舫臜巈邠懯瞁話鄎流閾秢勘崽孠鋊頡籾煺保蘆迄薓蓐蹟欱梫呔蹕鯴齥駯隣餺祰搓攈讒抷蛆疾鮤畄逵龍啀昛驎岄婥筱刅涬囲寉乶淃論纞鶰鷇觚脈嫑镮鴃濤褁鍛妊聰偆忊粵尹勾挏攊輟娕棕梢嬰韎霤氠黨熿鬻矴鵇辯脦洕霓蟖天煴憊獅鋌篢墱嬬軻鞮黐巟垠饞忌隔姻謥抴癈犼詪醦