熒光分析法與化學(xué)發(fā)光分析法PPT課件

1、1相關(guān)定義相關(guān)定義光致發(fā)光：分子、原子吸收光輻射時(shí)被激發(fā)，然后再發(fā)射出與吸收的波長(zhǎng)相同或更長(zhǎng)光的現(xiàn)象。熒光：物質(zhì)分子吸收光子能量被激發(fā)后從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回到基態(tài)時(shí)所發(fā)射出的光。 分子熒光分析法 ：研究物質(zhì)分子的熒光譜線位置及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的方法 ，簡(jiǎn)稱熒光分析法 ?；瘜W(xué)發(fā)光：基于化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生能量來(lái)激發(fā)分子，分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象。 第1頁(yè)/共57頁(yè)2特點(diǎn)特點(diǎn)熒光分析法：靈敏度高、選擇性好 化學(xué)發(fā)光分析法：靈敏度高；線性范圍寬；分析速度快；儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，不需要光源及單色器等；沒(méi)有散射光及雜散光等引起的背景值。 第2頁(yè)/共57頁(yè)35.1 熒光分析法熒光分析法5

2、.1.1 基本原理 5.1.2 影響熒光強(qiáng)度的因素 5.1.3 熒光分光光度計(jì)5.1.4 分析方法5.1.5 應(yīng)用示例第3頁(yè)/共57頁(yè)45.1.1 基本原理基本原理1分子中電子的激發(fā)過(guò)程2分子熒光的產(chǎn)生3熒光光譜的類型和特征第4頁(yè)/共57頁(yè)51分子中電子的激發(fā)過(guò)程第5頁(yè)/共57頁(yè)62.分子熒光的產(chǎn)生振動(dòng)弛豫 內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換 熒光發(fā)射 外部能量轉(zhuǎn)換 體系間跨越 磷光發(fā)射 第6頁(yè)/共57頁(yè)73熒光光譜的類型和特征1）激發(fā)光譜和發(fā)射光譜2）熒光光譜特征第7頁(yè)/共57頁(yè)81）激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)、熒光圖形激發(fā)光譜變不變Fex圖發(fā)射光譜不變變Fem圖第8頁(yè)/共57頁(yè)9硫酸奎寧的激發(fā)光譜（硫酸奎寧的激發(fā)光

3、譜（a） 及熒光光譜及熒光光譜（b）第9頁(yè)/共57頁(yè)102）熒光光譜特征（1）Stokes位移 （2）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān) （3）熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系 第10頁(yè)/共57頁(yè)11蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜 第11頁(yè)/共57頁(yè)12蒽的能級(jí)躍遷蒽的能級(jí)躍遷第12頁(yè)/共57頁(yè)13與UV比較u相同點(diǎn) 區(qū)段：Vis-UV區(qū) 適用性：均可用于定性定量，多用于定量 定量方法：相似樣品性質(zhì)、量：以液體為主、均少分析時(shí)間：均快操作難易程度：易第13頁(yè)/共57頁(yè)14與UV比較u不同點(diǎn) UV FL性性 質(zhì)質(zhì) 分子吸收光譜分子吸收光譜 分子熒光光譜分子熒光光譜 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 廣廣 有熒光的物質(zhì)，較少有

4、熒光的物質(zhì)，較少 選擇性選擇性 不高不高 高高靈敏度靈敏度 g/ml10-7 10-1010-12儀器觀察角度儀器觀察角度 透射光透射光 90 譜線數(shù)目譜線數(shù)目 12第14頁(yè)/共57頁(yè)155.1.2 影響熒光強(qiáng)度的因素 1熒光效率與熒光產(chǎn)生的條件2影響熒光強(qiáng)度的結(jié)構(gòu)因素3影響熒光強(qiáng)度的外部因素第15頁(yè)/共57頁(yè)16(1)熒光效率激發(fā)態(tài)分子發(fā)射熒光的光子數(shù)與基態(tài)分子吸收激發(fā)光的光子數(shù)之比，常用f表示： f (01) f 大的有熒光發(fā)射吸收激發(fā)光的光子數(shù)發(fā)射熒光的光子數(shù)f第16頁(yè)/共57頁(yè)17（2）產(chǎn)生熒光的必備條件強(qiáng)紫外- -可見(jiàn)吸收一定的熒光效率*躍遷 強(qiáng)吸收帶 n *躍遷 弱吸收帶存在共軛的

5、*躍遷， f高，熒光強(qiáng)度大。 第17頁(yè)/共57頁(yè)182影響熒光強(qiáng)度的結(jié)構(gòu)因素(1)共軛效應(yīng)(2)分子的剛性與共平面性(3)取代基效應(yīng)第18頁(yè)/共57頁(yè)19(1)共軛效應(yīng)絕大多數(shù)能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)，因?yàn)榉枷悱h(huán)或雜環(huán)分子具有長(zhǎng)共軛的*躍遷。電子共軛程度越大，熒光強(qiáng)度（熒光效率）越大，而熒光波長(zhǎng)也長(zhǎng)移。 第19頁(yè)/共57頁(yè)20 苯苯 萘萘 蒽蒽 ex 205nm 268nm 356nm em 278nm 321nm 404nm f 0.11 0.29 0.36第20頁(yè)/共57頁(yè)21(2)分子的剛性與共平面性 在同樣的長(zhǎng)共軛分子中，分子的剛性和共平面性越大，熒光率越大，并且熒光波長(zhǎng)產(chǎn)生

6、長(zhǎng)移。 CH2第21頁(yè)/共57頁(yè)22(3)取代基效應(yīng)第一類取代基：NH2、OH、OCH3、NHR、NR2、CN等第二類取代基：COOH、NO2、CO、NO、SH、NHCOCH3、F、Cl、Br、I等第三類取代基：R、SO3H、NH3等第22頁(yè)/共57頁(yè)233影響熒光強(qiáng)度的外部因素溫度溶劑pH值的影響熒光熄滅劑的影響 散射光的干擾 第23頁(yè)/共57頁(yè)24溫度和溶劑溫度：溫度升高，熒光物質(zhì)的熒光效率和熒光強(qiáng)度下降溶劑：溶劑極性增大，熒光波長(zhǎng)隨著而長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；溶劑粘度減小，熒光強(qiáng)度減小第24頁(yè)/共57頁(yè)25pH值的影響當(dāng)熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的pH值對(duì)該熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度有較大影響

7、，這主要是因?yàn)槿跛崛鯄A分子和它們的離子結(jié)構(gòu)有所不同，在不同酸度中分子和離子間的平衡改變，因此熒光強(qiáng)度有差異。第25頁(yè)/共57頁(yè)26苯胺在不同pH值下有下列平衡關(guān)系 NH3+OHHNH2NHOHH苯胺在pH712的溶液中主要以分子形式存在，由于-NH2為提高熒光效率的取代基，故苯胺分子會(huì)發(fā)生藍(lán)色熒光。但在pH13的溶液中均以苯胺離子形式存在，故不能發(fā)射熒光。第26頁(yè)/共57頁(yè)27熒光熄滅劑熒光熄滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑。第27頁(yè)/共57頁(yè)28常見(jiàn)的熒光熄滅劑鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合

8、物、羧基化合物熒光熄滅的形式： a、碰撞、 b、生成不發(fā)光配位化合物 c、熒光物質(zhì)氧化第28頁(yè)/共57頁(yè)29散射光的影響瑞利散射光拉曼散射光干擾熒光測(cè)定，應(yīng)采取措施消除第29頁(yè)/共57頁(yè)30硫酸奎寧在不同波長(zhǎng)激發(fā)下的熒光與散射光譜硫酸奎寧在不同波長(zhǎng)激發(fā)下的熒光與散射光譜第30頁(yè)/共57頁(yè)315.1.3 熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)第31頁(yè)/共57頁(yè)321. 激發(fā)光源高壓氙燈 強(qiáng)譜線的連續(xù)光譜 連續(xù)分布在250-700nm250-700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，尤其是300-300-400nm400nm波長(zhǎng)之間的譜線強(qiáng)度幾乎相等汞燈 線光譜高壓：近紫外區(qū)365nm,398nm365nm,398nm，405

9、nm405nm，436nm436nm，546nm546nm，579nm579nm低壓: :紫外區(qū)，最強(qiáng)254nm254nm第32頁(yè)/共57頁(yè)332. 單色器激發(fā)單色器-除去不需要的光線發(fā)射單色器-選擇不同的熒光發(fā)射波長(zhǎng)第33頁(yè)/共57頁(yè)343. 樣品池低熒光的玻璃或石英方形適用于90測(cè)量第34頁(yè)/共57頁(yè)354.4.檢測(cè)器光電倍增管第35頁(yè)/共57頁(yè)365. .讀出系統(tǒng)數(shù)字電壓表記錄儀帶有計(jì)算機(jī)控制的讀數(shù)裝置 第36頁(yè)/共57頁(yè)375.1.4 分析方法分析方法 溶液產(chǎn)生熒光的光路示意圖溶液產(chǎn)生熒光的光路示意圖 第37頁(yè)/共57頁(yè)381熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系 F=KfI0（1-e-bC）K儀器

10、常數(shù)，f激發(fā)光強(qiáng)度當(dāng)C很小時(shí)，A=bC0.05時(shí)，e-bc=1-bcF=kfI0bC=KC第38頁(yè)/共57頁(yè)392定量分析方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線法比例法多組分混合物的熒光分析第39頁(yè)/共57頁(yè)403熒光分析新技術(shù)簡(jiǎn)介（1）激光熒光分析（2）時(shí)間分辨熒光分析 （3）同步熒光分析 第40頁(yè)/共57頁(yè)415.1.5 應(yīng)用示例應(yīng)用示例1無(wú)機(jī)離子的測(cè)定與有機(jī)試劑形成配合物后進(jìn)行熒光分析，測(cè)定方法常用直接熒光法或熒光熄滅法。2有機(jī)化合物的測(cè)定具有高度共軛體系的脂肪族化合物（如維生素A、胡蘿卜素等）和芳香族化合物 藥物中的胺類、甾體類、抗生素、維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶 第41頁(yè)/共57頁(yè)425.2 化學(xué)發(fā)光分析法

11、化學(xué)發(fā)光分析法5.2.1 基本原理5.2.2 發(fā)光反應(yīng)主要類型5.2.3 化學(xué)發(fā)光的測(cè)量?jī)x器5.2.4 分析方法5.2.5 應(yīng)用與示例第42頁(yè)/共57頁(yè)435.2.1 基本原理基本原理化學(xué)發(fā)光是基于化學(xué)反應(yīng)提供的足夠能量，使其中一種反應(yīng)產(chǎn)物的分子的電子被激發(fā)，形成激發(fā)態(tài)分子，當(dāng)它們從激發(fā)態(tài)躍回基態(tài)時(shí)，就發(fā)出一定波長(zhǎng)的光。第43頁(yè)/共57頁(yè)44化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)式反應(yīng)式表示為： A + B C* + D C* C + hv 其中，C*是產(chǎn)物C的激發(fā)態(tài)（下同）。第44頁(yè)/共57頁(yè)45化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的基本條件 化學(xué)發(fā)光包括吸收化學(xué)能和發(fā)光兩個(gè)過(guò)程，要產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，必須滿足以下條件：（1）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)必

12、須提供足夠的化學(xué)激發(fā)能，以引起電子激發(fā)。（2）激發(fā)態(tài)分子能以輻射躍遷的方式返回基態(tài)，而不是以熱的形式消耗能量。（3）激發(fā)態(tài)分子能以輻射躍遷的方式返回基態(tài)，而不是以熱的形式消耗能量。第45頁(yè)/共57頁(yè)46化學(xué)發(fā)光效率 fr參加反應(yīng)的分子數(shù)發(fā)射光子數(shù)Cl參加反應(yīng)的分子數(shù)產(chǎn)生光子數(shù)，參加反應(yīng)的分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子數(shù)fr第46頁(yè)/共57頁(yè)475.2.2 發(fā)光反應(yīng)主要類型發(fā)光反應(yīng)主要類型1氣相化學(xué)發(fā)光 2火焰化學(xué)發(fā)光 3液相化學(xué)發(fā)光 第47頁(yè)/共57頁(yè)481氣相化學(xué)發(fā)光（1）臭氧的反應(yīng) 臭氧可與40余種有機(jī)化合物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)（2）氮氧化合物的反應(yīng) 一氧化氮與臭氧的氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)有較大的化學(xué)發(fā)光效率 （

13、3）氧原子的反應(yīng) 氣相中的SO2、NO、NO2及CO等能與氧原子產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 第48頁(yè)/共57頁(yè)492火焰化學(xué)發(fā)光火焰化學(xué)發(fā)光是在300400的火焰中，熱輻射是很小的，某些物質(zhì)可以從火焰的化學(xué)反應(yīng)中吸收化學(xué)能而被激發(fā)，從而產(chǎn)生火焰化學(xué)發(fā)光?；鹧婊瘜W(xué)發(fā)光現(xiàn)象多用于硫、磷、氮和鹵素的測(cè)定。第49頁(yè)/共57頁(yè)50火焰化學(xué)發(fā)光的類型（1）一氧化氮的反應(yīng) 一氧化氮在富氫火焰中燃燒時(shí)產(chǎn)生很強(qiáng)的火焰化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，二氧化氮在富氫火焰中能迅速地被氫原子還原為一氧化氮，因而此法可用于測(cè)定空氣中NOx的總量。 （2）揮發(fā)性硫化物的反應(yīng) 當(dāng)揮發(fā)性硫化物如SO2、H2S、CH3SH及CH3SCH3等在富氫火焰中燃燒時(shí)，產(chǎn)生很強(qiáng)的藍(lán)色化學(xué)發(fā)光。 第50頁(yè)/共57頁(yè)513液相化學(xué)發(fā)光 常用的發(fā)光物質(zhì)有魯米諾、光澤精、洛粉堿、沒(méi)食子酸、過(guò)氧草酸鹽等，其中魯米諾是最常用的發(fā)光試劑 。第51頁(yè)/共57頁(yè)525.2.3 化學(xué)發(fā)光的測(cè)量?jī)x器化學(xué)發(fā)光的測(cè)量?jī)x器1分立取樣式2流動(dòng)注射式第52頁(yè)/共57頁(yè)53流動(dòng)注射式化學(xué)發(fā)光儀示意圖R-試劑載流；S-試液；P-蠕動(dòng)泵；V-進(jìn)樣閥；D-化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器第53頁(yè)/共57頁(yè)545.2.4 分析方法分析方法化學(xué)發(fā)光分析主要用于定量分析。1化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與反應(yīng)物濃度的關(guān)系dtcACldtICl）（第54頁(yè)/共57頁(yè)552常用發(fā)光試劑（1）魯米諾類（