分子生物學作業(yè)-lc3b蛋白依賴性免疫

1、制作者: 張瑞學號：201521090301文章來源一、背景二、實驗思路三、結(jié)論四、技術(shù)原理背景關(guān)于RSV感染病（引用圖）自噬的過程（引用圖）STAT信號通路（引用圖）（引用圖）實驗思路1.LC3b-/-缺失加重RSV誘發(fā)的IL-17a依賴性肺炎2.RSV感染后，LC3b-/-CD11+ DCs 對自噬、固有細胞因子 的產(chǎn)生與 CD4+T細胞誘導發(fā)生了改變3. LC3b 蛋白的缺失導致Th17相關(guān)的RSV誘發(fā)的肺炎加重是 通過上皮細胞分泌的IL-1介導4.ER壓力的改變，導致缺失LC3b的小鼠支氣管上皮細胞加 重炎癥和細胞因子的產(chǎn)生5.在LC3b-/-小鼠中 阻斷IL-1受體信號可以減緩IL-

2、17a相關(guān)疾病實驗思路11-1. LC3b-/-缺失加重RSV誘發(fā)的IL-17a依賴性肺炎(圖1a-h)1-2. 確定在LC3b-/-小鼠中是否為CD4+T細胞主要分泌 IL-17（圖1i-j）1-3. 檢測是否在RSV感染的LC3b-/-小鼠中誘發(fā)的肺炎是 IL-17依賴性的（圖2a-e） 1-1.在RSV誘發(fā)的IL-17a依賴性肺炎中，若LC3b-/-缺失，小鼠 的病情將更加嚴重 特征： 支氣管, 上皮細胞脫落 粘液分泌過多 中性粒細胞增多Figure 1 LC3b-/-缺失的小鼠將加重由RSV誘發(fā)的肺炎a 對肺切片進行H & E,H & PAS染色b 與粘液相關(guān)的muc5ac與gob5轉(zhuǎn)

3、錄本增多（qPCR）c RSV病毒轉(zhuǎn)錄本增多（qPCR）用RSV感染W(wǎng)T與LC3b-/-8天后，d 中性粒細胞增多（流式）e IL-17a蛋白增多（使用Bioplex assay）f IFN轉(zhuǎn)錄本減少（qPCR）用RSV感染W(wǎng)T與LC3b-/-8天后，g 用RSV感染W(wǎng)T與LC3b-/-8天后，IL-1與IL-6蛋白含量上升（使用Bioplex assay）h 用RSV感染W(wǎng)T與LC3b-/- 48h后， IL-17a蛋白增多（使用Bioplex assay） 1-2.確定在LC3b-/-小鼠中哪種細胞類型增強了IL-17的分泌水平 最近對IL-17依賴性疾病模型的研究表明，在IL-1受體信號

4、通路中-T細胞受體陽性細胞與固有淋巴細胞產(chǎn)生了大量的IL-17a蛋白。i 檢測肺中CD4+T細胞，CD3+T細胞與ILC3s細胞的數(shù)量（流式）j 檢測縱膈淋巴結(jié)（MedLNs)中CD4+T細胞，CD3+T細胞的數(shù)量1-3.檢測是否在RSV感染的LC3b-/-小鼠中誘發(fā)的肺炎是IL-17依賴性的 之前我們實驗室的研究發(fā)現(xiàn)在RSV感染后，本由IL-17a導致的肺炎，過多的粘液分泌與IFN分泌的抑制也可被CD8+T細胞誘導。Figure 2 用IL-17a抗體中和證明在RSV感染的LC3b-/-小鼠中誘發(fā)的肺炎是IL-17依賴性的a RSV感染8天后，肺組織切片進行H & E,H & PAS染色，表

5、明加入IL-17a抗體后，炎癥減弱b 由抗體中和后，與粘液相關(guān)的muc5ac轉(zhuǎn)錄本減少（qPCR）c 由抗體中和后，中性粒細胞增多（流式） d 由抗體中和后，RSV病毒轉(zhuǎn)錄本減少（qPCR）e 由抗體中和后，IFN轉(zhuǎn)錄本增加（qPCR）實驗思路22-1. RSV感染后，LC3b-/-CD11+ DCs 對自噬、固有細胞 因子的產(chǎn)生與 CD4+T細胞誘導發(fā)生了改變（圖3a-f）2-2. RSV感染后，確定是否DCs優(yōu)先誘導CD4+T細胞分泌 IL-17a（圖3j）2-3. 進一步確定LC3b-/-DCs 誘導CD4+T細胞分泌IL-17a 是自噬缺失的結(jié)果（圖3h-i） 2-1.RSV感染后，自

6、噬與固有細胞因子的產(chǎn)生發(fā)生了改變，由 LC3b-/- CD11+ DCs對 CD4+T細胞誘導也發(fā)生了改變 研究表明在Th17免疫反應(yīng)中需要CD11chigh CD11b+組織駐留DCs細胞，自噬的改變導致DCs與巨噬細胞接收TLR競爭者信號分泌IL-23DC細胞對炎癥的兩種反應(yīng)途徑（引用圖）Figure 3 RSV感染后，自噬與固有細胞因子的產(chǎn)生改變，由 LC3b-/- CD11+ DCs對 CD4+T細胞誘導產(chǎn)生IL-17改變a LC3b-/- 小鼠與自噬相關(guān)的炎癥小體明顯降解（熒光染色，共聚焦顯微鏡觀察 b 8h后，LC3b-/-p62保持積累（western分析）c IL-1，IL-6

7、明顯上升 （流式分析）d 感染24h后，IL-12的亞基p35與p40明顯減少，IL-23明顯上升（流式） e IL-1與IL-6上升（使用Bioplex assay）f 感染24h后，IL-12的亞基p35與p40轉(zhuǎn)錄本明顯減少g IL-17a升高（使用Bioplex assay）h 用OVA與RSV共處理，LC3b-/-DCs產(chǎn)生更高的IL-17ai用OVA與RSV共處理，LC3b-/-CD11b+DCs產(chǎn)生更高的IL-17a 3. LC3b 蛋白的缺失導致Th17相關(guān)的RSV誘發(fā)的肺炎加重是通過上皮細胞分泌的IL-1介導 由于上皮細胞中分泌的LC3b是一種重要的肺炎調(diào)節(jié)器，檢測結(jié)構(gòu)與骨髓

8、干細胞在RSV誘導的肺炎中的作用實驗思路3Figure 4 結(jié)構(gòu)與骨髓干細胞LC3b的缺乏都會加重RSV誘發(fā)的肺炎a-c 說明嵌合LC3b-/-骨髓的WT小鼠細胞炎癥最嚴重，中性粒細胞與IL-17a蛋白分泌最多d RSV體外再刺激MedLN（縱膈淋巴結(jié)）48h后，IL-17a含量升高e 嵌合LC3b-/-骨髓的WT小鼠細胞分泌的IFN最少f LC3b-/-型小鼠IL-6明顯分泌增多g 嵌合LC3b-/-骨髓的WT小鼠細胞分泌的IL-1最多 4.ER壓力的改變，導致缺失LC3b的支氣管上皮細胞加重了炎癥和細胞因子的產(chǎn)生 進一步檢測在RSV感染中參與的先天性細胞因子。實驗思路4（引用圖）（引用圖）

9、Figure 5 在RSV感染后由LC3b-/-型氣管上皮細胞與肺巨噬細胞產(chǎn)生的促炎細胞因子增加a 免疫組化分析說明IL-1是由上皮細胞產(chǎn)生的（IL-1抗體與E-Cadherin抗體處理）b IL-1與IL-1轉(zhuǎn)錄本升高c IL-1與IL-6含量上升（使用Bioplex assay）d 含肺巨噬細胞IL-1細胞數(shù)量上升（流式分析）e ER壓力相關(guān)基因CHOP,Edem-1 與cleaved XBP-1 (XBP-1s)的轉(zhuǎn)錄水平升高f 加入IRE-1a（ER壓力傳感器蛋白）抑制劑DBSA，IL-1與IL-6減少（使用Bioplex assay）5.在LC3b-/-小鼠中 阻斷IL-1受體信號可

10、以減緩IL-17a相關(guān)疾病 LC3b-/- 小鼠中，檢測IL-1的過表達是否為促Th17分泌的原因。實驗思路5Figure 6 RSV感染后 LC3b-/-小鼠后，由于IL-1受體信號的阻斷，加重的IL-17a依賴性肺炎減輕 a IL-1Ra（IL-1受體拮抗劑）處理后，肺組織切片進行H & E,H & PAS染色， 炎癥明顯減輕 IL-1Ra（IL-1受體拮抗劑）處理后，b-e 與粘液相關(guān)基因Muc5ac表達下降， 中性粒細胞下降， IL-17a轉(zhuǎn)錄本表達下降， IFN轉(zhuǎn)錄本表達量上升， IL-17蛋白含量減少討論 先天性免疫： 在DCs誘導的先天性細胞因子的產(chǎn)生與抗原呈遞作用中，自噬的重要

11、作用，RSV感染的LC3b-/- DCs產(chǎn)生了IL-1，IL-6與IL-23代替了IL-12，結(jié)果誘導IL-17a的產(chǎn)生。（圖7a）特異性免疫： 在特異性免疫途徑中，由于ER壓力的錯誤傳感，導致caspase-1升高，將IL-1的前體剪切為成熟的IL-1，從而使得IL-17a分泌升高，炎癥加重。（圖7b）Figure 7 在野生型或LC3B-/-小鼠中，CD4+T細胞對呼吸道合胞病毒（RSV）反應(yīng)的誘導和維持的機制 a先天性免疫 b特異性免疫文章的整體思路意義 這個實驗對于由RSV誘導的il-17a依賴性肺炎的臨床治療具有一定的幫助，為后期相關(guān)藥物的研發(fā)做了一定的鋪墊。技術(shù)原理 整個實驗涉及到

12、的主要技術(shù)有：細胞分離及培養(yǎng)，qPCR，Western，組織切片，熒光標記，流式細胞儀分析等。qPCR 實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)。是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光集團，利用熒光信號的積累實時的監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線進行定量分析的方法。例如.TaqMan探針法： 探針完整時，報告基團R發(fā)射的熒光信號被淬滅基團NFQ吸收；PCR擴增時，Taq酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。組織切片 主要通過取材、固定、包埋、切片、染色、封片幾個步驟來完成，最常用的是用石蠟包埋，切片對儀器的要求較高，一般要求在10m一下，常用H&E染色，蘇木精與伊紅染色，蘇木精可將細胞核染成藍色，伊紅可將細胞質(zhì)染成粉紅色，如圖中1a所示。熒光標記法 將熒光素用化學的方法與特異性抗體結(jié)合，形成熒光標記抗體，且可示蹤。當與抗原結(jié)合后，在熒光顯微鏡下可觀察到明亮的特異熒光。例如圖3a，這個圖是為了證明由于LC3b的缺失，自噬被阻斷。紅色的部分為炎癥小體，藍色為DAPI標記的核DNA，在w