深度測序技術(shù)簡介

1、Next Generation SequencingSample fragmentationLibrary preparationSequencing reactionData analysisRoche 454 焦磷酸測序Pyrophosphate Sequencing基本原理Roche 454Roche 454測序技術(shù)測序技術(shù)邊合成邊測序（sequencing by synthesis）454公司被羅氏診斷公司以1.55億美元收購目前，Roche 454 GS FLX Titanium每次運(yùn)行能產(chǎn)生100萬條序列，平均讀長能達(dá)到400nt，且第400個(gè)堿基的準(zhǔn)確率能達(dá)到99%。一次運(yùn)行所需

2、時(shí)間為10小時(shí)，能獲得4-6億個(gè)堿基的序列信息。454 sequencing454 sequencing： Emulsion PCR (emPCR)Emulsion PCR (emPCR)Mix DNA Library & capture beads(limited dilution)“Break micro-reactors”Isolate DNA containing beads Generation of millions of clonally amplified templates on each bead No cloning and colony pickingCreat

3、e “Water-in-oil” emulsion + PCR Reagents + Emulsion Oil Perform emulsion PCR Adapter carrying library DNAABMicro-reactors Adapter complementEnrichAnneal SeqprimerCentrifuge StepLoad Enzyme Beads454 sequencing454 sequencing： Deposition of DNA beads into the PicoTiterPlateLoad beads into PicoTiterPlat

4、e Illumina Solexa 合成測序Sequence by Synthesize基本原理Illumina SolexaIllumina Solexa測序技術(shù)測序技術(shù)Illumina公司于2007年初花費(fèi)6億美金巨資收購了Solexa, 2010年初，Illumina將其第二代測序儀Genome Analyzer IIx升級(jí)到HiSeq 2000HiSeq 2000含有兩張F(tuán)low cell，可同時(shí)運(yùn)行或者只運(yùn)行其中一張。讀長為100nt，同時(shí)支持Fragment、Pair-end和Mate-Paired文庫。每次運(yùn)行最多可產(chǎn)生200 GB的數(shù)據(jù)量（讀長為2x100nt）。Clonal

5、Single Molecule Arrays單分子克隆1000 molecules per 1 m cluster 1000 clusters per 100 m square40 million clusters per experimentPrepare DNA fragmentsLigate adaptersAttach single molecules to surfaceAmplify to form clusters20 micronsSequenceReversible Terminator Chemistry可逆終止反應(yīng)O PPPHNNOOcleavagesitefluor3b

6、lockNext cycleIncorporationDetectionDeblock; fluor removalODNAHNNOO3O5free 3 endXOHAll 4 labelled nucleotides in 1 reactionSequencing-by-Synthesis (SBS)5GTCAGTCAGTCAGT35CAGTCATCACCTAGCGTAFirst base incorporatedCycle 1: Add sequencing reagentsRemove unincorporated basesDetect signalCycle 2-n: Add seq

7、uencing reagents and repeat1、每輪測序反應(yīng)加入四種帶有熒光標(biāo)記的dNTP，末端帶有可以被去除的阻斷基團(tuán)2、每輪反應(yīng)只能整合一個(gè)核苷酸，儀器讀取相應(yīng)的熒光信號(hào)3、信號(hào)讀取結(jié)束，用化學(xué)方法去除阻斷基團(tuán)，進(jìn)行下一輪測序反應(yīng)123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T The identity of each base of a cluster is read off from sequential images根據(jù)每個(gè)點(diǎn)每輪反應(yīng)讀取的熒光信號(hào)序列，轉(zhuǎn)換成相根據(jù)每個(gè)點(diǎn)每輪反應(yīng)讀取的熒光信號(hào)序列，轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的應(yīng)的DNA序列序列Bas

8、e calling from the raw dataSolexa 測序測序 WorkflowABI SOLiD 連接法測序Sequence by Ligation基本原理ABI SOLiDABI SOLiD測序技術(shù)測序技術(shù)2010年末又發(fā)布了最新產(chǎn)品-SOLiD 5500 xl測序平臺(tái)。SOLiD 5500 xl含有兩張微流體芯片（microfluidic FlowChip），每張芯片含有6條相互獨(dú)立的運(yùn)行通道（run lane）。每條lane都能運(yùn)行相對獨(dú)立的測序反應(yīng)，這樣的設(shè)計(jì)使得SOLiD 5500 xl測序平臺(tái)極具靈活性。最大測序讀長為75nt，同樣支持Fragment、Pair-e

9、nd和Mate-Paired文庫。單次運(yùn)行能得到的最大數(shù)據(jù)量為300Gb（使用最新設(shè)計(jì)的nanobeads）。測序的系統(tǒng)準(zhǔn)確性能達(dá)到99.99%文庫制備：微珠單分子克隆1024種8堿基探針4色熒光，4種雙核苷酸，每色熒光有256個(gè)探針(46)SOLiD 利用探針的連接反應(yīng)讀取模板的利用探針的連接反應(yīng)讀取模板的DNA序列序列連接法測序（一）http:/綠宇生物科技 專業(yè)建庫 測序 QQ:110199525每個(gè)探針進(jìn)行檢測的兩個(gè)堿基后面有三個(gè)匹配堿基，因此一條測序引物讀取的序列是不完整的每個(gè)探針進(jìn)行檢測的兩個(gè)堿基后面有三個(gè)匹配堿基，因此一條測序引物讀取的序列是不完整的測序引物與測序引物與adapt

10、eradapter退火退火探針連接，檢測熒光探針連接，檢測熒光切除熒光基團(tuán)切除熒光基團(tuán)第二輪探針連接，檢測熒光第二輪探針連接，檢測熒光切除熒光基團(tuán)切除熒光基團(tuán)連接法測序（二）測序引物沿著測序引物沿著Adapter移動(dòng)移動(dòng)5次，確保每個(gè)位點(diǎn)都被檢測次，確保每個(gè)位點(diǎn)都被檢測連接法測序（三）0位置是位置是Adapter的最后一個(gè)堿基，因此只檢測一次，的最后一個(gè)堿基，因此只檢測一次，該堿基是進(jìn)行解碼所必須的。該堿基是進(jìn)行解碼所必須的。Advantage & disadvantage454 sequencing讀取長度大，400bp可以對未知基因組進(jìn)行從頭測序de novo sequencing

11、當(dāng)遇到polymer時(shí)，如AAAAAA等，熒光強(qiáng)度和堿基個(gè)數(shù)不成線性關(guān)系，判定重復(fù)堿基個(gè)數(shù)有困難Solexa sequencing高度自動(dòng)化的系統(tǒng)讀取片段多，適合進(jìn)行大量小片段的測序，如microRNA profiling基于可逆反應(yīng)，隨反應(yīng)輪數(shù)增加，效率降低，信號(hào)衰減，讀取序列較短，給de novo sequencing 拼接帶來困難SOLiD sequencing每個(gè)堿基讀取兩次非常高的準(zhǔn)確性，特別是對于SNP的檢測靈活的系統(tǒng)，完善的磁珠編碼系統(tǒng)，可以進(jìn)行樣品的pooling，分割測序區(qū)域讀取長度受連接反應(yīng)的輪數(shù)限制，給de novo sequencing 拼接帶來困難高通量測序的應(yīng)用De

12、 novo 測序基因深度測序（genome re-sequencing）轉(zhuǎn)錄組深度測序（transcriptome re-sequencing）Digital expression profilingChIP-seqMethy-seqTranscriptome resequencing：malignant pleural mesotheliomas (MPMs) ：惡性胸膜間皮瘤pulmonary adenocarcinoma (ADCA)：肺腺癌Transcriptome characteristicsSolid line： at least one readDashed line：at l

13、east 20 readsExpression difference between MPM and ADCA sample compare to a lung tissue controlAnalysis of percent-age of reads containing known coding region SNVs in the six tissue samples.SNV： Single Nucleotide Substitution Variant Tag SequenceBrainUHRSymbol Gene DescriptionGATCAAACCAAGGCCCAGGC118

14、861RPL29Ribosomal protein L29GATCACTGTTAATGATTTGC162163PRDX2Peroxiredoxin 2GATCAGTGTCTTTTCAGCAC8535PFN2Profilin 2GATCATCATGACCAATGAAA730STMN4Stathmin-like 4GATCATGCTGGCTGCAAAGA9196COX5BCytochrome c oxidase subunit VbGATCCAAACCCAAGTCTTGA480GABRA1Gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, alpha 1GATCC

15、AAGATAAAGAAGGCA266271UBBUbiquitin BGATCCCAGACTGGTTCTTGA2171538RING1Ring finger protein 1GATCCCCAATTGACTCAGAG910DIRAS2DIRAS family, GTP-binding RAS-like 2GATCCGGGGCTGCAGGCTTG1010PHF20PHD finger protein 20GATCCTACAGAAGTGGAGCT0113IGJImmunoglobulin J polypeptideGATCCTAGTAATTGCCTAGA46799FN1Fibronectin 1G

16、ATCCTGCGGGAGTCTCCCG4112NFIXNuclear factor I/X (CCAAT-binding transcription factor)GATCCTGTGAAGGCCTGGAA042TOP2ATopoisomerase (DNA) II alpha 170kDaGATCGAGACACGTGATGGGA8346KRT8Keratin 8GATCGAGGACAGTGCAACCA059ITGB7Integrin, beta 7GATCTCAATGCCAATCCTCC24081BASP1Brain abundant, membrane attached signal pro

17、tein 1GATCTGCACGCCGCTGACCC510DRD1IPDopamine receptor D1 interacting proteinGATCTGTGCCCAGAGATGGG7160GFAPGlial fibrillary acidic proteinGATCTGTGGAGAATGTACAC13269APLP2Amyloid beta (A4) precursor-like protein 2Digital expression profiling（1）：人大腦組織與UHR（Universal Human Reference）的表達(dá)差異Digital expression pr

18、ofiling &microRNA re-sequencing：hESC： human embryonic stem cellsEB： embryoid bodiesChIP-seq（1）：人一號(hào)染色體DNA-蛋白相互作用ChIP-seq（2）： Sequenced short reads (typically 2550 bp) from ChIP-Seq experiments are first mapped onto the reference genome. The mapped reads are then used to estimate statistical param

19、eters, which include the estimation of the average length Fof sequenced DNA fragments.Methy-seq（1）：腫瘤和MCF7細(xì)胞系中 BRCA!啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化差異Some highlights:Correlation between ChIP-Seq and his prior SAGE-like method (called GMAT) has r=0.906However the resolution with ChIP-Seq was dramatically higher. Furthermor

20、e, ChIP-Seq was more sensitive and generated less false-negative regions12,726 genes whose transcription levels are known in CD4+ T-cells were correlated with the histone modifications and 35,961 Pol II binding site islands were identifiedThis cost-effective method produces digital-quality data and

21、should find broad applications in our efforts to understand the contribution of the human epigenomes in gene expression and epigenetic inheritanceMethy-seq（2）：第三代測序技術(shù)簡介第三代測序技術(shù)簡介第二代測序技術(shù)在制備測序文庫的時(shí)候都需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，而這一PCR過程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子的比例關(guān)系。另外，第二代測序的讀長普遍偏短，在進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接時(shí)會(huì)遇到麻煩。為了克服這樣的缺點(diǎn)，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實(shí)時(shí)測序和納米孔為標(biāo)志的第三

22、代測序技術(shù)。簡介如下：1.Helicos1.Helicos公司公司Helicos公司的Heliscope單分子測序儀基于邊合成邊測序的思想，將待測序列隨機(jī)打斷成小片段并在3末端加上Poly(A)，用末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上Cy3熒光標(biāo)記。用小片段與表面帶有寡聚Poly(T)的平板雜交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5熒光標(biāo)記的dNTP進(jìn)行DNA合成反應(yīng)，每一輪反應(yīng)加一種dNTP。將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，檢測上一步記錄的雜交位置上是否有熒光信號(hào)，如果有則說明該位置上結(jié)合了所加入的這種dNTP。用化學(xué)試劑去掉熒光標(biāo)記，以便進(jìn)行下一輪反應(yīng)。經(jīng)過不斷地重復(fù)合成、洗脫、成像、淬滅過程完成

23、測序。Heliscope的讀取長度約為30-35 nt，每個(gè)循環(huán)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出量為21-28 Gb。2.Pacific Biosciences2.Pacific Biosciences公司公司Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)基于邊合成邊測序的思想，以SMRT芯片為測序載體進(jìn)行測序反應(yīng)。SMRT芯片是一種帶有很多ZMW(zero-mode waveguides)孔的厚度為100 nm的金屬片。將DNA聚合酶、待測序列和不同熒光標(biāo)記的dNTP放入ZMW孔的底部，進(jìn)行合成反應(yīng)。與其他技術(shù)不同的是，熒光標(biāo)記的位置是磷酸基團(tuán)而不是堿基。當(dāng)一個(gè)dNTP被添加到合成鏈上的同時(shí)，它會(huì)進(jìn)入Z

24、MW孔的熒光信號(hào)檢測區(qū)并在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP的種類。此外由于dNTP在熒光信號(hào)檢測區(qū)停留的時(shí)間（毫秒級(jí)）與它進(jìn)入和離開的時(shí)間（ 微秒級(jí)） 相比會(huì)很長，所以信號(hào)強(qiáng)度會(huì)很大。其它未參與合成的dNTP由于沒進(jìn)入熒光型號(hào)檢測區(qū)而不會(huì)發(fā)出熒光。在下一個(gè)dNTP被添加到合成鏈之前，這個(gè)dNTP的磷酸基團(tuán)會(huì)被氟聚合物（fluoropolymer）切割并釋放，熒光分子離開熒光信號(hào)檢測區(qū)。3.Oxford Nanopore Technologies3.Oxford Nanopore Technologies公司公司Oxford Nanopore Technologies公司

25、正在研究的納米孔單分子技術(shù)是一種基于電信號(hào)測序的技術(shù)。他們設(shè)計(jì)了一種以-溶血素為材料制作的納米孔，在孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭環(huán)糊精。用核酸外切酶切割ssDNA時(shí)，被切下來的單個(gè)堿基會(huì)落入納米孔，并和納米孔內(nèi)的環(huán)糊精相互作用，短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度，這種電流強(qiáng)度的變化幅度就成為每種堿基的特征。三代測序技術(shù)的原理各有特點(diǎn)，適用范圍也不近相同。第一代測序技術(shù)憑借其長的序列片段和高的準(zhǔn)確率，適合對新物種進(jìn)行基因組長距框架的搭建以及后期GAP填補(bǔ)，但是成本昂貴，而且難以勝任微量DNA樣品的測序工作。第二代測序技術(shù)中，454序列片段最長，比較適合對未知基因組從頭測序，搭建主體結(jié)構(gòu)，但是在判斷連續(xù)單堿

26、基重復(fù)區(qū)時(shí)準(zhǔn)確度不高。Solexa較454具有通量高、片段短、價(jià)位低的特點(diǎn)，可以用于大基因組和小基因組的測序和重測序。Solexa雙末端測序(paired-end sequencing)可以為基因組進(jìn)一步拼接提供定位信息，但是隨著反應(yīng)輪數(shù)增加，序列長度和質(zhì)量均有所下降，而且在閱讀AT區(qū)時(shí)有明顯錯(cuò)誤傾向。SOLiD基于雙堿基編碼系統(tǒng)的糾錯(cuò)能力以及較高的測序通量，適合轉(zhuǎn)錄本研究以及比較基因組學(xué)特別是SNP檢測等，但是測序的片段短限制了該技術(shù)在基因組拼接中的廣泛應(yīng)用。第三代測序技術(shù)目前正在研發(fā)階段，尚未正式投入使用。部分參考文獻(xiàn)閱讀Genome re-sequencingGenome re-sequ

27、encing van Orsouw N J, Hogers R C, Janssen A, et al. Complexity reduction of polymorphic sequences (CRoPS): a novel approach for large-scale polymorphism discovery in complex genomes. PLoS ONE, 2007, 2(11): e1172Hillier L W, Marth G T, Quinlan A R, et al. Whole-genome sequencing and variant discovery in C. elegans. Nat Methods, 2008, 5(2): 183188Transcriptome re-sequencingTranscriptome re-sequencingMortazavi A, Williams B A, McCue K, et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods, 2008,