干細胞治療糖尿病國家人類基因組轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心實驗室

1、干細胞治療糖尿病現(xiàn)狀與展望國家人類基因組轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 1內(nèi) 容1.糖尿病分型、發(fā)病機制及治療現(xiàn)狀2.干細胞獨特的生物學(xué)特性及分類3.干細胞在糖尿病治療領(lǐng)域的應(yīng)用4.存在的問題及展望21型糖尿病發(fā)病機制遺傳環(huán)境胰島素缺乏1型糖尿病自身免疫性抗體產(chǎn)生 細胞破壞廖二元等.內(nèi)分泌學(xué),2004,1436-143831型糖尿病的特征4遺傳（ 細胞缺陷）2型糖尿病發(fā)病機制環(huán)境因素（肥胖、生活方式等）2型糖尿病胰島素抵抗胰島素分泌不足胰島素相對缺乏廖二元等.內(nèi)分泌學(xué),2004,1438-144652型糖尿病的特征多于成年尤其是45歲以上起病多數(shù)起病緩慢，隱匿血漿胰島素相對性降低胰島素的敏感性降低可伴全身肥胖及

2、體脂分布異常 （腹型肥胖）。常有家族史，但遺傳因素復(fù)雜。6糖尿病的自然病程環(huán)境因素病毒感染自身免疫遺傳因素環(huán)境因素肥胖營養(yǎng)衛(wèi)生體力活動糖尿病起病 高血糖及相關(guān)臨床表現(xiàn) 并發(fā)癥及相關(guān)表現(xiàn)視網(wǎng)膜病變腎病變動脈粥樣硬化神經(jīng)病變失明腎功能衰竭心肌梗死卒中截肢（死亡）致殘劉新民主編.實用內(nèi)分泌學(xué)（第3版）.人民軍醫(yī)出版社.P1221，圖31-11型糖尿病2型糖尿病（晚期）糖尿病前期 糖尿病期 糖尿病并發(fā)癥期 糖尿病致死 或致殘期71.皮下注射胰島素 1 型及部分2 型 療效果不理想，難以阻止并發(fā)癥發(fā)生及發(fā)展2.植入胰島細胞或其替代物 已喪失胰島細胞功能 *供體細胞來源不足 *免疫排斥反應(yīng)（移植后患者終身

3、服用免疫抑制劑，體內(nèi)功能性胰島細胞可能受到胰島自身免疫反應(yīng)的攻擊，伴促炎性細胞因子的出現(xiàn)、胰島細胞凋亡率增加） *移植后患者五年內(nèi)的病情緩解率小于10% 3.干細胞 胰島細胞替代物 具有極強的自我更新能力和多向分化潛能的細胞治療現(xiàn)狀8干細胞生物醫(yī)學(xué)第二次革命Science 、Time于1999年、2000年、2007年，2008年多次將干細胞技術(shù)評為世界十大科學(xué)成就之一。9胚胎干細胞iPS干細胞成體干細胞ISSCR關(guān)于干細胞定義自我復(fù)制多向分化102、替代和修復(fù)死亡或損傷的細胞1、干細胞通過血液循環(huán)植入， 或直接植入受損的組織3、激發(fā)自身體內(nèi)干細胞來修復(fù)干細胞治療ISSCR關(guān)于干細胞技術(shù)定義1

4、1干細胞種類iPS 12 (1)胚胎干細胞干細胞根據(jù)起源分類(2)成體干細胞具有全能性，能分化為體內(nèi)所有的組織和器官，如血液細胞、神經(jīng)細胞、心肌細胞等分化潛能較弱，通常認為新生的干細胞一旦被確定為某種細胞類型，就會受到某些特定編碼序列的調(diào)控，只能分化成特定的組織細胞。包括胰腺干細胞、造血干細胞和其他種子細胞。13干細胞的功能性分類骨髓間充質(zhì)細胞神經(jīng)細胞肌肉脂肪細胞上皮細胞骨髓間充質(zhì)干細胞心肌細胞1、全能干細胞2、萬能干細胞3、多功能干細胞4、單功能干細胞14干細胞移植的生物學(xué)特性（1）趨化性（2）歸巢性（3）遷移性（4）分化性（5）遠合性 （6）抗原性15干細胞移植治療疾病的原理1、替代和修復(fù)

5、死亡和受損傷的細胞2、激活休眠和處于抑制狀態(tài)的細胞3、旁分泌作用（分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗凋亡因子等）4、免疫調(diào)控機制5、促進細胞間電能力、電傳導(dǎo)恢復(fù)（如間充質(zhì)干細胞分泌連接蛋白幫助細胞間連接、促進離子通道的開放等）16*來源充足*低毒性(或無毒性) *一次給藥，長期有效*自身干細胞移植還可避免產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)和相關(guān)的倫理學(xué)爭論等。最好的免疫治療和基因治療栽體，是各類疾病細胞治療和基因治療的首選靶細胞干 細 胞 技 術(shù) 的 優(yōu) 勢17成體干細胞治療糖尿病研究概述具有亞全能分化潛能，在特定的體內(nèi)外環(huán)境下，能夠誘導(dǎo)分化成為多種組織細胞。間充質(zhì)干細胞MSC具有巨大的體外擴增潛能，易于分離培養(yǎng)，獲取方便；

6、在適當?shù)捏w外微環(huán)境的誘導(dǎo)下，具有多向分化潛能。一定數(shù)量的MSC通過血管途徑遷移到胰腺組織中，并在胰腺組織特定的微環(huán)境誘導(dǎo)下分化增殖為胰島樣細胞，替代損傷的胰島細胞分泌胰島素；同時MSC 還具有強大的細胞因子分泌和免疫調(diào)節(jié)功能，使損傷或部分損傷的胰島細胞修復(fù)。 18胰腺干細胞 具有很強的自我更新能力和分化潛能，能誘導(dǎo)分化為含有、和胰島細胞, 將其移入糖尿病模型鼠后,能夠逆轉(zhuǎn)糖尿病病情，從而為治療型糖尿病提供了新的胰島資源。W eir 等分離人胰管細胞培養(yǎng)，成功分離出了胰腺干細胞，并將其分化為既含胰管細胞又含胰島細胞的細胞群，后者能分泌胰島素，其分泌量隨著濃度的增高而增多，用免疫組化等方法證明了這

7、些細胞群含有胰島的所有細胞類型。美國科學(xué)家從尚未發(fā)病的糖尿病小鼠的胰島管中分離出胰島干細胞，并在體外誘導(dǎo)分化成能產(chǎn)生胰島素的細胞。移植實驗表明，接受移植的糖尿病鼠血糖濃度控制良好，而對照組小鼠則死于糖尿病。這為干細胞治療糖尿病奠定了實驗基礎(chǔ)。19S hah 等將胰島素原基因通過腺病毒轉(zhuǎn)染造血干細胞, 并將這些干細胞靜脈注射到糖尿病大鼠中, 使其血糖水平恢復(fù)正常，并在多臟器組織中有前胰島素原基因表達，說明注射前胰島素原基因轉(zhuǎn)染的造血干細胞可以短期使糖尿病病情好轉(zhuǎn)。 K ang 等將轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓移植入糖尿病鼠體內(nèi)，通過骨髓擴增，有效阻止了糖尿病復(fù)發(fā)，并從同種基因供體鼠來源的胰島和造血細胞注入糖尿

8、病鼠，一半的糖尿病鼠好轉(zhuǎn)，因此同種骨髓移植可以治療自身糖尿病, 而這些骨髓產(chǎn)生細胞能夠分化為胰島功能細胞。造血干細胞20其他種子細胞Blyszczuk 等證實神經(jīng)干細胞和骨髓干細胞通過化學(xué)誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因的方法形成分泌胰島素的細胞。B urns 等從胎鼠腦中分離神經(jīng)干細胞，體外擴增并誘導(dǎo)分化表達前胰島素原m R N A , 顯示了典型的胰腺細胞的功能應(yīng)答及新陳代謝中葡萄糖依賴性的增加，說明神經(jīng)干細胞有分化成細胞來治療糖尿病的潛能。C hen也證實骨髓基質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化的胰島樣功能細胞能夠作為一種新的干細胞治療方法在臨床上治療糖尿病。Lu 等將人胰島素基因通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細胞，結(jié)果顯

9、示這些體外培養(yǎng)的細胞能夠穩(wěn)定的分泌胰島素，并且持續(xù)3 周以上。21干細胞在1型糖尿病中應(yīng)用22理想的細胞替代物必需具有以下特點: 1. 表達葡萄糖激酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運子2 ; 2. 低表達高親和力的己糖激酶； 3. 表達激素原轉(zhuǎn)換酶PC2 、PC3 ,能將胰島素原有效地加 工成胰島素; 4. 能將胰島素釋放入細胞外的分泌系統(tǒng)；綜上所述,由干細胞誘導(dǎo)分化的細胞是糖尿病細胞治療的最佳種子細胞。23目前國內(nèi)外研究現(xiàn)狀 干細胞獨特的生物學(xué)特性、極強的自我更新能力及多向分化潛能無疑是獲得大量胰島細胞的最佳種子細胞?？蓸O大地解決胰島細胞來源不足的問題。近幾年，胰島細胞移植治療糖尿病，使一些人能脫離胰島素治療，

10、血糖控制時間達1 年以上。遺憾的是，胰島細胞移植仍面臨兩大難題：供者來源不足、嚴重的免疫排斥反應(yīng)等。24干細胞治療糖尿病優(yōu)勢一 干細胞是基因治療的最理想靶細胞。對于糖尿病患者來說，僅輸入足夠數(shù)量的胰島細胞并不能達到治療效果。來源于自體干細胞的胰島細胞在植入1 型糖尿病患者體內(nèi)后，仍會受到免疫攻擊，而如果采用同種異體的細胞進行移植也同樣會遭受免疫排斥反應(yīng)。對干細胞進行基因修飾,可避免免疫排斥反應(yīng)的攻擊。25干細胞治療糖尿病優(yōu)勢二 干細胞的另一優(yōu)勢在于其分化的胰島細胞可以發(fā)揮對血糖的生理性調(diào)節(jié)作用。通過對非細胞(如肝細胞、垂體細胞、成纖維細胞等) 進行基因修飾，雖然可以使它們分泌胰島素,但這些細胞

11、并不能精確的模擬細胞發(fā)揮生理性的調(diào)節(jié)作用。 26機理探討一27機理探討二28機理探討三29用于臨床的干細胞來源自體外周血自體骨髓胎兒附屬物（臍血、臍帶、羊膜等）30自體骨髓干細胞移植在無菌條件下抽取糖尿病患者自身的骨髓血混合液，通過分離、純化等過程，將骨髓干細胞定向培養(yǎng)、分化成能夠產(chǎn)生胰島素的細胞，制成含有足夠數(shù)量干細胞的細胞懸液，再注入患者體內(nèi)。 自體外周血干細胞移植予以糖尿病患者粒細胞集落刺激因子（G-CSF）注射治療四五天，以動員細胞產(chǎn)生了某種變化，通過誘發(fā)使骨髓干細胞進入外周血，使其在外周血中達到一定數(shù)量后，再應(yīng)用血細胞分離機分離出所需干細胞進行移植。 臍帶間充質(zhì)干細胞移植31臍帶間充

12、質(zhì)干細胞Whartons 膠*在細胞增殖方面優(yōu)于骨髓干細胞移植，能形成更大的胰島細胞團塊*在表達胰島特異性標致C肽方面較分化后的骨髓干細胞移植高72%*臍帶的組織抗原性較弱，不易被受體的免疫系統(tǒng)所識別 32適 應(yīng) 證1型或部分2型糖尿病患者。年齡1865歲。糖尿病病程3年以內(nèi)。應(yīng)用胰島素治療血糖控制尚可者。依從性好。 33干細胞治療糖尿病療效判斷標準不需要胰島素維持健康狀態(tài)。胰島素的用量減少低血糖發(fā)生概率降低。34療效評價的主要指標觀察移植前后胰島素注射劑量、2、1、 、2 、胰島自身抗體(、 2、)等變化。35國外干細胞研究現(xiàn)狀 * 巴西圣保羅大學(xué)治療15例1型糖尿病患者，結(jié)果14例停用胰島

13、素，雖然其中2例在1年后恢復(fù)胰島素治療，但胰島素用量仍顯著降低。但這也是目前已知的、全球最大的、隨訪時間最長的關(guān)于干細胞治療糖尿病的研究數(shù)據(jù)。 * 2009年4月14日美國醫(yī)學(xué)會雜志（JAMA）發(fā)表了一項巴西最新研究結(jié)果，新診斷1型糖尿病患者（23例）接受平均29.8周的造血干細胞移植（HSCT）治療后，C肽水平顯著升高，大多數(shù)患者成功擺脫了對胰島素的依賴 36結(jié) 果2008-2011年共進行120例糖尿病患者的臨床研究，移植前與移植后皮下胰島素(諾和靈、諾和靈)注射總量平均為56,85%患者于移植后第14日開始減量,移植后第30天胰島素30。18例病人停用胰島素，時間超過24個月。37不良反

14、應(yīng)治療過程中環(huán)磷酰胺處理階段,患者出現(xiàn)惡心、嘔吐等癥狀,預(yù)處理后第5日癥狀消失。干細胞回輸過程未出現(xiàn)發(fā)熱。38南京鼓樓醫(yī)院患者男,21歲,因“口干、多飲、多尿伴消瘦周,神志不清3小時”于2006年6月18日入院。 診斷1型糖尿病國內(nèi)第一例沈山梅李莉蓉周士海馮文煥許景艷歐陽建朱大龍.自體造血干細胞移植治療1型糖尿病附一例報告. 中國糖尿病雜志2008年第16卷第9期39治療基本過程(1)干細胞動員:化療外加粒細胞集落刺激因子( );(2)干細胞采集:采集足量的干細胞,確保34+細胞總量2106/;(3)干細胞凍存:加入細胞凍存液后進行深低溫凍存(-80);(4)干細胞預(yù)處理方案:選用+;(5)干

15、細胞回輸:經(jīng)靜脈回輸入體內(nèi);(6)支持治療:預(yù)處理1周后予 協(xié)助造血重建。40結(jié)果移植前與移植后皮下胰島素(諾和靈、諾和靈)注射總量均為38,于移植后第14日開始減量,移植后第27日停止注射胰島素。胰島素停用時間已超過15個月。41隨 訪血糖控制良好(4 25 7/,27 18 8/);移植后1、5、8、13個月1分別為4 1%、6 9%、5 6%、5 4%, 水平均較移植前明顯增加(表1)。移植后第5個月復(fù)查、 及 2, 2仍為陽性,其余為陰性。42治療后的病情進展治療過程中及治療后體重穩(wěn)定,于干細胞預(yù)處理階段,患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)等癥狀,預(yù)處理后第5日癥狀消失。于干細胞回輸后第8日出現(xiàn)

16、發(fā)熱(體溫38 839 3),5天后體溫降至正常。未發(fā)生嚴重的骨髓抑制、出血性膀胱炎、間質(zhì)性肺炎等。移植后第15日,正常造血功能重建。患者體力已恢復(fù)正常。43第三軍醫(yī)大學(xué)在西南地區(qū)首家采用自體骨髓干細胞胰腺定向移植治療糖尿病,該患者為接受該方法治療的第1例。 隆敏,鄭宏庭,童強,嚴俊,段煉,楊閻峙,徐梓輝。自體骨髓干細胞胰腺定向移植治療糖尿病1例 .第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2010;32（6）：524.44干細胞治療方法移植前3d預(yù)先皮下注射集落刺激因子動員骨髓。手術(shù)當日采取患者400ml骨髓,并立即在層流實驗室行骨髓單個核細胞分離,患者入介入手術(shù)室,尋找到供應(yīng)胰腺的胰背動脈后,將骨髓干細胞緩慢均勻

17、注射入胰背動脈。 45結(jié) 果 1術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)在空腹血糖6mmol/L、餐后血糖8mmol/L的情況下,術(shù)后1月胰島素泵基礎(chǔ)量減少至16U,三餐前各3U,日胰島素總量減少了39.02%,術(shù)后3個月基礎(chǔ)量減少至11U,三餐前各2U,日胰島素總量減少了58.54%,其術(shù)后3個月內(nèi)胰島素劑量大幅度減少了58.54%,有望完全停用胰島素46結(jié) 果 2復(fù)查GHbA1c為7.7%。復(fù)查饅頭餐試驗,血糖分別為7.9、7.61、9.65、17.20、16.13mmol/L;胰島素分別為2.9、2.22、3.35、10.83、9.52U/ml;C 肽分別為1. 73、1.60、1.84、3.51、4.2ng/ml。 47解放軍第455醫(yī)院景華,陳文怡,李克良,甄二真(解放軍第455醫(yī)院,上海200052).自體造血干細胞回輸治療型糖尿病2例東南國防醫(yī)藥48于4月15日開始皮下注射格拉諾賽特行干細胞動員,4月20日外周血CD34陽性報告為1.72%,行自體外周血造血干細胞采集,過程順利?？诜h(huán)孢素A及ATG(20mg/日,連續(xù)5天)治療后,回輸自體造血干細胞(具體過程同前)。49出院時復(fù)查C肽:空腹1.94ng/ml,餐后2小時2.9ng/ml。回輸后20天停用胰島素,血糖控制在4.55.9mmol/L之間,血像正常。50隨訪4月,C肽:空腹1.14ng