12+植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

1、實(shí)驗(yàn)八植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理儀器、材料與試劑實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)報(bào)告及思考題1 實(shí) 驗(yàn) 目 的了解細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)特征及其制備技術(shù)2實(shí) 驗(yàn) 原 理 細(xì)胞骨架（cytoskeleton）是指真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系。廣義的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞核骨架、細(xì)胞質(zhì)骨架、細(xì)胞膜骨架和細(xì)胞外基質(zhì)。狹義的細(xì)胞骨架是指細(xì)胞質(zhì)骨架，包括微絲（microfilament，MF， 57nm ）、微管（microtubule，MT，2025nm）、中間纖維（intermediated filament，IF，811nm）。 細(xì)胞（特別是真核細(xì)胞）中的骨架系統(tǒng)，不僅僅是活細(xì)胞的支撐結(jié)構(gòu)，決定細(xì)胞的形狀，而且與

2、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、細(xì)胞分裂、基因表達(dá)、細(xì)胞分化、極性生長等生命活動(dòng)密切相關(guān)。3細(xì)胞骨架在通常固定條件下不穩(wěn)定，如低溫、高壓、鋨酸處理，而且MF、MT、IF都是直徑非常小的結(jié)構(gòu)，只有在電鏡下才能夠觀察到。研究細(xì)胞骨架常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法：電鏡觀察、組織化學(xué)、免疫熒光等本實(shí)驗(yàn)采用的特殊方法4Triton X100Triton X100是一種非離子型去垢劑，可以除去可溶性蛋白質(zhì)和脂類，而微絲束不會(huì)被Triton 破壞而保留在細(xì)胞中。通過Triton的處理去掉了一部分雜蛋白，使細(xì)胞骨架顯現(xiàn)更清晰。M緩沖液成分：咪唑、EDTA、EGTA、MgCL2等咪唑是一種緩沖劑；EDTA熬合Ca、M

3、g離子；EGTA熬合Ca離子，不熬合Mg離子；保持一種低鈣低鎂的條件。使骨架纖維保持在聚合狀態(tài)并且較為舒張。考馬斯亮藍(lán)R250是一種普通的蛋白質(zhì)染料，可以使細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)染色。本實(shí)驗(yàn)中，有些骨架纖維不穩(wěn)定，如微管；有些纖維太細(xì)，在光學(xué)顯微鏡下無法分辨。在實(shí)驗(yàn)中觀察到的纖維主要是微絲束，由許多微絲結(jié)合在一起，直徑約在40nm左右，考馬斯亮藍(lán)R250染色對(duì)微絲束的顯示起了夸大的作用。5 實(shí) 驗(yàn) 步 驟1）撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮約1cm2，放入盛有5 mL pH6.8的磷酸鹽緩沖液的小培養(yǎng)皿中，使其下沉（或浸沒5min）。 2）吸去緩沖液，用1%TritonX-100處理洋蔥表皮25 min。（3mL

4、） 3）吸去TritonX-100，用M-緩沖液充分洗3次，每次約3 min。（3mL） 4）加3%戊二醛固定20min。（5mL） 5）用磷酸緩沖液洗3次，每次3min。（3mL） 6）0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色20 min。（3mL） 7）用自來水洗數(shù)遍，降低背景。 8）將樣品置于載玻片上，加蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。6結(jié)果觀察將制好的片子置于光鏡的低倍鏡下，可見到規(guī)則排列的長方形洋蔥表皮細(xì)胞輪廓，細(xì)胞內(nèi)可見到被染成蘭色的粗細(xì)不等的分枝狀結(jié)構(gòu)，這便是細(xì)胞骨架。轉(zhuǎn)高倍鏡繼續(xù)觀察，調(diào)節(jié)小鏍旋可見到細(xì)胞骨架的立體結(jié)構(gòu)。7注意事項(xiàng)撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮不可帶莖肉。樣本要展開鋪平去垢處理要掌握好時(shí)間和溫度染色時(shí)間需掌握好，必要時(shí)可分別不同時(shí)間染色觀察時(shí)選擇平展染色適中的部位觀察染色時(shí)統(tǒng)一到水槽旁邊染色，不要污染桌面滴