慢性腎功能不全通過下調ABCA1表達影響巨噬細胞內膽固醇

1、慢性腎功能不全通過下調ABCA1表達影響巨噬細胞內膽固醇含量周加軍1，甘 華1，劉彩欣2，陳力學3，湯為學3 （400016 重慶，重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院：腎臟科1，神經內科實驗室3；266500 青島，青島市經濟技術開發(fā)區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科2）摘要 目的 探討慢性腎功能不全患者巨噬細胞內膽固醇含量的變化及ABCA1的表達情況。方法 選取2010年8月至2012年3月本院住院的慢性腎功能不全（chronic renal failure，CRF）患者30例和健康對照組20例。分離外周血單核細胞誘導貼壁巨噬化，油紅O染色鑒定,應用酶法測定巨噬細胞內膽固醇含量，應用real-time PCR與We

2、stern blot方法測定細胞ATP結合盒受體A1(ATP binding cassette transporter-A1，ABCA1)的mRNA及蛋白表達。結果 慢性腎功能不全患者巨噬細胞內膽固醇含量明顯高于健康對照組，ABCA1在慢性腎功能不全患者巨噬細胞中的mRNA與蛋白表達顯著低于健康對照組。結論 慢性腎功能不全患者巨噬細胞的膽固醇含量明顯增加，膽固醇含量增加與慢性腎功能不全患者ABCA1的表達下調有關。關鍵詞 ABCA1；膽固醇含量；慢性腎功能不全中圖法分類號 文獻標志碼 A通信作者 甘 華，E-mail：zxg0233基金項目 重慶市衛(wèi)生局重點項目（2010-1-16）Chron

3、ic Renal Failure Influences Macrophages Cholesterol content by Repressing ABCA1Zhou Jiajun1, Gan Hua1, Liu Caixin2, Chen Lixue3,Tang Weixue3 （1Department of Nephrology, 3Neurology department laboratory，First Affiliated Hospital of ChongQing Medical University, Chong Qing 400016；2Clinical Laboratory，

4、The Second Peoples Hospital of Qingdao economic and technical development zone，Qing Dao 266500）Abstract Objective: to explore the changes of cholesterol content and the expressions of ABCA1in chronic renal failure(CRF) patients. Methods: Between Aug. 2010 and Mar. 2012, we investigated 30 CRF patien

5、ts, and 20 healthy volunteers. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated and stimulated to make them transfer to macrophages. Macrophages were identified by Oil red O dyeing. The cellular cholesterol contents was detected by enzymatic colorimetry. Macrophages were collected to detect

6、the expression of ABCA1 by using Real-time PCR and Western blot. Results : Compared to the normal control（CON）,the content of intracellular cholesterol in CRF patients was significantly higher than that in healthy patients, the expression of ABCA1 was significantly decreased in CRF（p0.01）.Conclusion

7、：CRF increase cholesterol content in human monocyte-macrophage derived foam cells, the mechanism of which may be associated with increase of expression of ABCA1.Key words ABCA1；cholesterol content; chronic renal failureSupported by the Key Project of Chongqing Municipal Health Bureau (2010-1-16). Co

8、rresponding author：Gan Hua, E-mail: zxg0233慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD），包括慢性腎功能不全患者，發(fā)生心血管并發(fā)癥的風險非常高1-4，而脂質代謝紊亂是CKD患者發(fā)生心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）并發(fā)癥最重要的原因之一。膽固醇逆轉運是膽固醇由外周組織細胞轉運至肝臟組織進行代謝的過程，對脂質在血管壁的沉積及動脈硬化的進展發(fā)揮了極為重要的作用。參與膽固醇逆轉運的受體主要有ABCA1、ABCG1(ATP binding cassette transporter-G1，ABCG1)、SR

9、B1 (scavenger receptor class B type 1,SRB1)等，而且ABCA1介導的巨噬細胞內膽固醇流出是巨噬細胞膽固醇逆轉運限速步驟，是膽固醇逆轉運的至關重要的第一步5。研究表明，單側腎切除的慢性腎功能不全的小鼠存在巨噬細胞膽固醇流出障礙，膽固醇流出受體ABCA1表達明顯下降，且與核因子-B（nuclear factor-B ，NF-B）激活有關6。目前還少見關于慢性腎功能不全患者巨噬細胞膽固醇流出的研究報道。本研究通過體外培養(yǎng)慢性腎功能不全患者外周血單核巨噬細胞，旨在探討慢性腎功能不全患者的巨噬細胞內膽固醇含量變化及膽固醇流出受體ABCA1的表達情況，為慢性腎功能

10、不全病人發(fā)生動脈粥樣硬化提供新的理論依據。1 材料與方法1.1 試劑人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物技術公司)，油紅o（Sigma公司）,鼠抗人ABCA1單克隆抗體(Abcam公司),PCR引物(大連寶生物工程公司),Prime Script RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq II DRR820S (TaKaRa公司)，實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad miniopticon公司)。1.2 臨床資料選取2010年8月至2012年3月本院住院的30例慢性腎功能不全患者（納入標準：CKD 24期，GFR：1560 ml/（min1.73m2），包括男性16例，女

11、性14例，（48.310.4）歲，其中包括慢性腎小球腎炎11例，間質性腎炎3例，IgA腎病7例，多囊腎2例，高血壓性腎病7例。排除標準：急慢性感染性疾病、糖尿病、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病，近期使用調脂藥物、糖皮質激素及免疫抑制劑者。選取同期本院健康體檢者20例為健康對照組，包括男性11例，女性9例，（46.512.4）歲。兩組性別、年齡等無統(tǒng)計學差異，具有可比性。受試對象均簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。1.3 細胞培養(yǎng)及干預空腹12 h以上，嚴格無菌條件下抽取外周血30 mL于EDTA抗凝管，6 h內進行如下操作：全血靜置30 min，水平離心1 500 r/min,10 min

12、。用相當于23倍血細胞體積的D-Hanks液稀釋血細胞成分，均勻吹打，緩慢傾斜加入裝有淋巴細胞分選液的15 mL離心管，Eppendorf 5072R離心機1600 r/min，離心20 min。離心結束前取消突然制動，使離心轉速自然緩慢降至0，小心吸取白霧狀單個核細胞層細胞。D-Hanks液洗滌單個核細胞3遍，無血清1640液接種細胞于6孔板（1.0106/孔），34 h待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2遍，加入10%胎牛血清及10%自身血清的1640培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，48 h后加入氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL )

13、25 ug/mL,24 h后收集細胞進行相關檢測。1.4 方法1.4.1 油紅染色鑒定 小心倒去培養(yǎng)液，PBS輕輕漂洗2遍，4多聚甲醛固定30 min，加入0.5%油紅細胞染色10 min，75%酒精脫色以去除多余染料，淡蘇木精染色15 s，PBS漂洗，待玻片干后水性封片劑封片觀察。1.4.2 化學酶促-比色法巨噬細胞內膽固醇的測定 將分離所得單個核細胞接種于6孔板，每個患者接種1個復孔，經患者血清及ox-LDL干預后胰酶消化收集細胞，離心后加入1 mL氯仿、甲醇混合物（2：1），采用超聲細胞破碎儀破碎細胞，收集上清真空干燥后用化學酶促法測定人單核巨噬細胞總膽固醇（total choleste

14、rol，TC）、游離膽固醇（free cholesterol，FC）的含量，膽固醇酯（cholesterol ester，CE）=TC-FC。向沉淀中加入1 mol/L NaOH孵育12 h，Lowry法測定總蛋白含量。分別計算膽固醇與細胞內總蛋白的比值，分析相對含量。1.4.3 實時熒光定量real-time PCR 收集細胞，Trizol試劑提取細胞總RNA，溶于無RNA酶水中。采用PrimeScript RT reagent Kit將RNA反轉錄成cDNA，進行PCR反應。ABCA1上游引物5-GGGGTGGTGTTCTTCCTCATTAC-3,下游引物5-CCGCCtTCACATCTT

15、CATCTTC-3，片段長度為114 bp；-actin上游引物5-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3，下游引物5-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT -3，片段長度為132 bp。最后用實時熒光定量PCR儀進行熒光定量檢測，CT=CT目的基因Ct-actin。，CT=CT實驗-CT對照，擴增倍數=2-CT，結果用ABCA1/-actin表示。1.4.4 Western blot檢測收獲細胞，加入細胞裂解液（凱基全蛋白提取試劑盒）裂解細胞,收集上清液提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。電泳上樣蛋白總量為20 g,100 V轉膜2.5 h，將凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上,

16、麗春紅染色效果滿意后，5%的脫脂牛奶封閉1 h，于蠟板上敷一抗（ABCA1，1：1 000，-actin，1:4 000）4 孵育過夜；復溫1 h，TBST洗滌3次后與1：3 000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠、羊抗兔二抗室溫孵育2 h；TBST洗滌3次后，用化學發(fā)光試劑(ECL)對膜進行處理，應用Bio-Rad凝膠圖像成像系統(tǒng)和Quality one軟件進行掃描分析。結果用目的條帶與-actin灰度值比值表示。1.5 統(tǒng)計學分析數據以s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，組間比較應用單因素方差分析，相關性分析應用Pearson雙變量相關性分析。2 結果2.1 單核巨噬細胞的鑒定接種后即刻觀察

17、細胞，細胞呈懸浮狀，周圍可見光暈；胞漿內透明，接種3 h后細胞數量明顯減少，可見細胞貼壁，形態(tài)為圓盤或長梭形，有長長的偽足。72 h后油紅o染色，顯微鏡下可見紅色脂滴，慢性腎功能不全組巨噬細胞內脂滴較健康對照組巨噬細胞內脂滴明顯增多（圖1）。A:健康對照組；B:慢性腎功能不全組圖1 油紅o染色觀察2組巨噬細胞內脂滴（400）2.2 巨噬細胞內膽固醇含量為了驗證油紅o染色的結果，我們進一步采用酶化學法測量細胞內膽固醇的含量，與健康對照組比較,慢性腎功能不全組總膽固醇、游離膽固醇均明顯升高，差異顯著（P0.01,圖2）。a：P0.01，與健康對照組比較圖2 2組巨噬細胞內膽固醇含量比較2.3 實時

18、熒光定量PCR檢測慢性腎功能不全患者巨噬細胞ABCA1 mRNA為（0.6230.104），較對照組表達顯著降低（P0.01）。2.4 Western blot檢測與健康對照組（0.8560.116）比較，慢性腎功能不全患者巨噬細胞ABCA1蛋白明顯降低（0.6040.095，P0.01，圖3）。 1 21：健康對照組；2：慢性腎功能不全患者圖3 Western blot檢測2組巨噬細胞ABCA1蛋白的表達2.5 ABCA1表達水平與巨噬細胞內總膽固醇及膽固醇脂相關分析ABCA1 mRNA水平與細胞內總膽固醇及膽固醇脂含量呈負相關（r=-0.457，r=-0.581，P0.01），ABCA1的

19、蛋白水平與巨噬細胞總膽固醇及膽固醇脂含量呈負相關（r=-0.521，r=-0.553，P0.01）。3 討論高脂血癥是導致粥樣硬化心血管疾病的關鍵因素，也是治療干預的初始靶。CKD可以導致血脂異常，尤其是慢性腎功能不全時，血脂異常的性質及程度取決于腎功能損傷的程度7-9。高甘油三脂血癥是CKD的早期特征之一，可見于腎功能不全的每一個時期，反映了肝臟合成增加及脂肪分解酶活性降低導致的分解減少。CKD患者CKD導致的氧化、糖基化及氨甲?；d脂蛋白轉譯后的修飾可以影響脂質分解代謝。也有研究指出慢性腎功能不全患者肝的低密度脂蛋白受體相關蛋白和極低密度脂蛋白受體明顯下降 10-11。然而，慢性腎功能不全

20、患者的降脂治療效果并不理想。研究顯示，強化的降低低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）治療（阿托伐他汀80 mg/d相對于阿托伐他汀10 mg/d）對輕中度CKD患者在減少心血管事件方面更加有效12。但相比輕中度CKD患者，晚期及終末期腎病患者血脂升高與心血管風險之間的關系截然相反，更低膽固醇水平會導致更高的臨床病死率。這種不平衡被認為跟患者蛋白質能量消耗及炎癥有關。一項超過1 500例終末期腎?。╡nd-stage renal disease, ESRD）患者的臨床研究發(fā)現，即使糾正營養(yǎng)不良及炎癥，也沒有相應地降低病死率及膽固醇的水平，而且更低LDL的干預治療

21、似乎意味著腎功能惡化及更高的病死率HYPERLINK l _ENREF_11 o NOTE:Kilpatrick R D, Mc Allister C J, Kovesdy C P, et al . Association between serum lipids and survival in hemodialysis patients and impact of race . J Am Soc Nephrol 2007;18:293(R)C303.13。由于臨床干預效果不佳，研究者開始注意巨噬細胞膽固醇逆轉運（RCT）的研究，參與巨噬細胞膽固醇外流的受體ABCA1、SR2B1和ABCG1備

22、受關注。本研究以慢性腎功能不全患者外周血單核-巨噬細胞模型為研究對象，觀察 ox-LDL 對其單核巨噬細胞內膽固醇流出及膽固醇流出主要受體ABCA1的影響。結果顯示，慢性腎功能不全患者巨噬細胞內脂滴明顯增加，巨噬細胞內膽固醇脂及細胞內總膽固醇明顯增高，慢性腎功能患者的巨噬細胞表面ABCA1 mRNA與蛋白表達水平顯著低于健康對照組。上述結果提示慢性腎功能不全患者巨噬細胞ABCA1表達下調可能會導致慢性腎功能不全患者動脈管壁泡沫細胞形成增加，從而增加慢性腎功能不全患者心血管并發(fā)癥發(fā)生的危險。這與單側切除的腎衰動物模型研究結論一致5，該研究指出：單側腎切除的腎衰小鼠模型，盡管腎功能輕微下降，但都會

23、出現嚴重的動脈粥樣硬化。同時該課題組還發(fā)現，單側腎切除術腎衰小鼠模型外周血單核-巨噬細胞內脂質明顯增加，巨噬細胞內膽固醇流出明顯減少，ABCA1的表達明顯下調，進一步研究顯示該種下調與NF-B的激活有關14-15。本研究還發(fā)現，ABCA1的下調與細胞內總膽固醇及膽固醇脂的含量呈負相關。綜上所述，本研究提示慢性腎功能不全可以導致巨噬細胞內脂代謝紊亂，增加巨噬細胞內膽固醇的含量，引起ABCA1表達顯著下調，在慢性腎功能不全患者的動脈粥樣硬化進展中發(fā)揮了重要作用。然而，盡管本研究盡量模擬人體內生理環(huán)境，但體外培養(yǎng)液、胎牛血清等可能對分離的巨噬細胞某些基因及蛋白有一定的影響，并不能完全反應體內的真實情

24、況，同時本實驗由于條件限制并沒有對ABCA1上下游信號通路做深入研究，可以在未來課題中加以深入探討。參考文獻：1. Weiner D E, Tabatabai S, Tighiouart H, et al. Cardiovascular outcomes and all-cause mortality: exploring the interaction between CKD and cardiovascular diseaseJ.Am J Kidney Dis, 2006, 48(3): 392- 401.2. Vaziri N D, Navab M, Fogelman A M. HDL

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