T∕CPMA 023-2020 血中N-甲基氨甲酰血紅蛋白加合物的測定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

1、 ICS 13.100CCS C52團 體 標 準T/CPMA0232020血中N-甲基氨甲酰血紅蛋白加合物的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法Determination of N-methylcarbamoylatedhaemoglobin in blood by liquidchromatography-tandem mass spectrometry2020-12-30發(fā)布2021-05-01實施 T/CPMA0232020前 言本標準按照GB/T 1.1-2020給出的規(guī)則起草。I T/CPMA0232020血中N-甲基氨甲酰血紅蛋白加合物的測定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法12范圍本標準規(guī)定了血中N-甲基

2、氨甲酰血紅蛋白加合物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。本標準適用于接觸二甲基甲酰胺的職業(yè)人群血中N-甲基氨甲酰血紅蛋白加合物的測定。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GBZ/T 295職業(yè)人群生物監(jiān)測方法總則3原理血紅蛋白中的N-甲基氨甲酰血紅蛋白加合物（ NMHb）經(jīng)酸水解轉(zhuǎn)化為3-甲基-5-異丙基乙內(nèi)酰脲（MVH）后，經(jīng)蛋白沉淀凈化，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ LC-MS/MS）測定，以保留時間和特征離子及其豐度比定性，以定量特征離子的峰面積，用內(nèi)標工作曲線法進行定量

3、。4儀器及材料4.14.24.34.44.54.64.74.84.9肝素或乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采血管：5 mL。具塞圓底離心管：15mL。離心機：4000 rpm。真空離心濃縮儀。渦旋混合器。電熱恒溫水浴鍋，2。96孔板減壓提取裝置。96孔蛋白沉淀板（配收集板及蓋板）：復(fù)合吸附型（40mg/2ml/well）或相當者。天平：感量 1mg和 0.1 mg。4.10液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源。5試劑5.15.25.35.4超純水。甲醇（CH3OH）：色譜純。乙腈（C2H3N）：色譜純。鹽酸（HCl，=1.18 g/cm）：優(yōu)級純。1 T/CPMA02320205.55.65.75.

4、85.95.105.11冰醋酸（CH3COOH）：優(yōu)級純。甲酸（HCOOH）：色譜純。氯化鈉（NaCl）：分析純。氯化鉀（KCl）：分析純。十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）：分析純。磷酸二氫鉀（KH2PO4）：分析純。磷酸鹽緩沖溶液：稱取 80 g氯化鈉、2 g氯化鉀、35.8 g十二水磷酸氫二鈉、2.4 g磷酸二氫鉀溶于 1000 mL水中。或可直接購買成品（PBS，10 ）。5.125.135.145.155.165.173-甲基-5-異丙基乙內(nèi)酰脲（MVH，CAS：74310-99-9）：標準物質(zhì)或色譜純試劑（純度99.0%）。3-甲基-異丁基海因（MIH，CAS：67585

5、4-31-6）：標準物質(zhì)或色譜純試劑（純度99.0%）。甲醇溶液（1:1, v/v）：量取 100 mL甲醇加入到 100 mL水中。鹽酸醋酸溶液（2:1,v/v）：量取 100 mL冰醋酸加入到 200 mL鹽酸中。甲酸乙腈溶液（1:99,v/v）：吸取 1 mL甲酸加入到 99 mL乙腈中。MVH標準儲備溶液：稱取 0.0156 g MVH，用甲醇溶液溶解并定容至 50 mL，該儲備液濃度為2.0 mmol/L。此溶液可在 4冰箱中保存 14 d。MIH內(nèi)標儲備液：稱取 0.0170 g MIH，用甲醇溶液溶解并定容至 50 mL，該內(nèi)標儲備液濃度為2.0 mmol/L。此溶液可在 4冰箱

6、中保存 14 d。MIH內(nèi)標工作液：臨用前準確吸取 MIH內(nèi)標儲備液 1.0 mL于 50 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，該內(nèi)標溶液濃度為 40.0 nmol/mL。5.185.196樣品的采集、運輸、制備和保存6.1樣品采集、運輸按GBZ/T 295要求采集職業(yè)人群靜脈全血2.5 mL于采血管中，立即輕輕搖勻；采集未暴露于二甲基甲酰胺的健康人群血樣，立即輕輕搖勻，作為空白血樣。樣品冷藏運輸。6.2血紅蛋白提取取 2 mL血樣于 15 mL離心管中，以 2000 rpm離心 15min。棄去上層，加入 7.0 mL水，輕輕振蕩10s，立即加入 1.0 mL磷酸鹽緩沖溶液，搖勻，以 100

7、0 rpm離心 5min。吸取上清液于另一 15 mL離心管中，得血紅蛋白提取液。提取液在真空離心濃縮儀中（45）干燥至干，制成松散、無結(jié)塊的血紅蛋白粉末約 300 mg。未暴露于二甲基甲酰胺的健康人群血樣，按上方法制備成空白血紅蛋白。血液中血紅蛋白提取應(yīng)在 24 h內(nèi)完成。6.3樣品保存血紅蛋白提取液密封后在4可保存3 d，在-18可保存5 d。干燥后血紅蛋白粉末在-18可保存14 d，在-80可保存30 d。7分析步驟7.1儀器操作參考條件2 T/CPMA02320207.1.1液相色譜參考條件a)色譜柱：Bonshell C18 Plus（3.0mm50mm，2.7m，100 ）或相當者

8、；柱溫：35；b)c)d)e)f)流動相：A為 0.1%甲酸溶液，B為 0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.25mL/min；進樣量：5L；流動相梯度洗脫條件見表 1。表1流動相梯度洗脫條件時間/min0.00流動相 A/%流動相 B/%901010909010909010101.203.003.504.007.1.2質(zhì)譜參考條件a)b)c)d)e)f)電離方式：電噴霧電離（ESI），正離子模式；毛細管電壓：3.5 kV；源溫度：150；脫溶劑氣溫度：350；脫溶劑氣流速：800 L/h；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），監(jiān)測參數(shù)見表 2。表2多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）參數(shù)化合物母離子157.1子離子錐孔

9、電壓/V碰撞能量/V3-甲基-5-異丙基乙內(nèi)酰脲72.0323230151115129.13-甲基-異丁基海因171.186.0a為定量離子7.2工作曲線制備與測定各取適量 MVH標準儲備溶液，用甲醇溶液將其稀釋成 0 nmol/mL400 nmol/mL的標準系列溶液。依次取 100L以上標準系列溶液，加入到各含有 0.100 g空白血紅蛋白粉末的 15mL圓底離心管中，然后各加入 250L MIH內(nèi)標工作液，再各加入鹽酸醋酸溶液 4.65mL，立即渦旋混勻 30s，將以上離心管置于 95水浴中加熱降解 1 h，取出冷卻至室溫，混勻后凈化。取降解后溶液 200L上樣到 96孔蛋白沉淀板，加入

10、 600L甲酸乙腈溶液，混勻后蓋上蓋板。控制真空泵壓力使液滴流出速度不超過 1 mL/min，收集流出液，混勻；制備得到內(nèi)標 MIH含量為 10.0 nmol的 MVH含量為 0 nmol40 nmol標準工作系列溶液。3 T/CPMA0232020參照儀器操作條件，分別測定標準工作系列溶液；以標準工作系列溶液中 MVH的含量為橫坐標，以測得的 MVH峰面積與內(nèi)標 MIH峰面積比值為縱坐標，繪制內(nèi)標工作曲線。7.3樣品處理稱取0.1g（精確至0.001g）血紅蛋白粉末置于15mL具塞圓底離心管中，加入250 L MIH內(nèi)標工作液，再加入鹽酸醋酸溶液4.75mL，立即渦旋混勻30s。將離心管置于

11、95水浴中加熱降解1 h，取出冷卻至室溫，混勻后待凈化。注：降解反應(yīng)過程可能產(chǎn)生氣泡，小心操作。取降解后溶液200L上樣到96孔蛋白沉淀板，加入600L甲酸乙腈溶液，混勻后蓋上蓋板?？刂普婵毡脡毫κ挂旱瘟鞒鏊俣炔怀^1 mL/min，收集流出液，混勻后待測。7.4樣品測定用測定標準系列溶液的操作條件測定樣品和樣品空白溶液。樣品中待測組分保留時間與標準工作溶液中對應(yīng)組分保留時間相同，定性離子的相對豐度與相當濃度標準工作溶液中定性離子相對豐度一致，且相對豐度允許偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定樣品中存在對應(yīng)的化合物。表3定性確證相對離子豐度最大允許偏差相對離子豐度允許相對偏差50%20%20%5

12、0%（含）25%10%20%（含）30%10%50%根據(jù)得到的目標物峰面積，采用內(nèi)標工作曲線法進行定量。若 MVH的濃度超過測定范圍，則應(yīng)減少取樣量重新處理后再進樣測定。7.5質(zhì)量控制檢測過程質(zhì)量控制按照GBZ/T 295進行。8計算N-甲基氨甲酰血紅蛋白加合物（NMHb）轉(zhuǎn)化成3-甲基-5-異丙基乙內(nèi)酰脲（MVH）為等摩爾反應(yīng)，故樣品中N-甲基氨甲酰血紅蛋白加合物（NMHb）的濃度可按式（1）計算：c = mn（1）式中：c樣品中 N-甲基氨甲酰血紅蛋白加合物（ NMHb）的濃度，單位為納摩爾每克血紅蛋白（nmol/gHb）；n根據(jù)工作曲線計算得到的樣品中MVH的含量，單位為納摩爾（nmol）；m稱取血紅蛋白樣品的重量，單位為克（g）。9說明9.1本法的檢出限為 0.05 nmol/mL，定量下限為 0.168 nmol/mL，測定范圍為 0.168 nmol/mL8.0nmol/mL。（以 0.1 g血紅蛋白粉末量計）血中 N-甲基氨甲酰血紅蛋白加合物（NMHb）的最低檢出濃4 T/CPMA0232020度為 2.5 nmol/gHb，最低定量濃度為 8.4 nmol/gHb。方法批內(nèi)精密度為 1.4 %8.3 %，批間精密度為0.8 %7.