如何迎接臨床基因診斷實驗室驗收ppt課件

1、臨床基因診斷實驗室技術準入的缺陷分析江蘇省臨床檢驗中心 許斌我國醫(yī)學實驗室管理國家實驗室認可委員會CNAS： 根據(jù)-ISO 15189；國家認可；自愿衛(wèi)生部執(zhí)業(yè)認證： 為加強醫(yī)療機構臨床實驗室管理，提高臨床檢驗程度，保證醫(yī)療質量和醫(yī)療平安，衛(wèi)生部出臺并決議自2006年6月1日起施行。包括總那么、醫(yī)療機構臨床實驗室管理的普通規(guī)定、質量管理、平安管理、監(jiān)視管理、附那么等六章五十六條。各省細那么： 省、市臨床檢驗中心，強迫，【體系+才干】PCR實驗室技術準入根據(jù)和規(guī)范 衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號 衛(wèi)檢字20028號 十章三十八款美國NCCLS對NAT的法規(guī)(一)1993年1995年12月MM3-A, 已同

2、意 NAT用于傳染病的規(guī)定2000年 MM1-A, 已同意 NAT用于遺傳病的規(guī)定2000年 MM5-P, 審定中 NAT用于血液病的規(guī)定2001年 MM6-P, 審定中 定量NAT用于傳染病的規(guī)定2001年 MM7-P, 審定中 原位雜交NAT用于遺傳病的規(guī)定美國NCCLS對NAT的法規(guī)(二)2002年正在編寫中的 MM9 NAT用于遺傳病的規(guī)定 MM10 遺傳病的基因型鑒定 MM11 NAT用于細菌分裂 MM12 點陣式NAT在臨檢中的運用方法 MM13 NAT的樣品制備 MM14 NAT的質控 MM15 NAT在“人類基因組運用中的規(guī)定物理的: 分區(qū)及單向流動、公用移液器、一次性試管架、

3、紫外燈、PCR任務罩、濾芯吸嘴?；瘜W的：dUTP/UNG PCR產物防污染系統(tǒng)、DNA清潔液。方法學的：即時Taqman法，Lab-on-a-chip芯片法，RT PCR一步法。制度和操作規(guī)范維護保養(yǎng)、執(zhí)行缺陷一、防污染認識和措施固定移液器易耗品PCR 方法學/防污染兩步法 RNA cDNA PCR 一步法 RNA PCR CT (I-Cycler/7000 / COBAS-Taqman)Taqman 動力學 (Caliper AG-9900 自動加樣)Lab on a Chip封鎖廢液孔RTTaqTth (RT+Taq)擴增中以脫氧尿苷(dUTP)取代脫氧胸苷(dTTP)，擴增產物可被尿苷酶

4、(UNG)消解，在經(jīng)加熱處置，即在脫氧尿苷處斷裂，不再能作為模板被擴增。后續(xù)擴增進展之前在PCR反響體系中參與UNG處置，在預變性加熱后，能夠的產物污染即被消除。PCR防污染UNG和dUTP防止“假陽性的圖解這種“假陽性是由于污染了前次PCR產物所致TAAAATTTTAAAAUUUPCRAAATUTAAAUUUAAAAAA*UNG加熱PCRUNG/dUTP 系統(tǒng)實驗室分區(qū)原那么單一流向、明確的識別標志各區(qū)儀器設備物品配備的充分性和科學性防污染試劑預備室標本預備室擴增檢測室產物檢測室 BIOTHREAT分區(qū)缺陷二、檔案管理儀器檔案a制造商稱號、型號、序號或其它獨一性標識；b儀器運用闡明書或其復印

5、件；c校準/檢測的日期和結果以及下次校準和/或檢測的日期；d迄今所進展的維護和今后維護方案的細節(jié)；e損壞、缺點、改裝或修繕的歷史。人員檔案實驗室應保管其技術人員有關資歷證書如上崗證、培訓、技藝和閱歷等技術檔案。缺陷三、記錄內容方式保管缺陷四、質量控制SOP文件的現(xiàn)行有效性儀器的標志及維護保養(yǎng)試劑及耗品的質檢PCR檢測流程 標本采集 核酸提取 基因擴增 產物檢測采集的方法核酸的穩(wěn)定性保管分別方法*效率保管效率檢測方法*測定的線性*DNA、RNA的濃度和純度測定及保管 此法準確、快速，且不損壞樣品?？蓽y出濃度低于2.5ug/ml的核酸。測定時將樣品作適度的稀釋。用紫外分光光度儀檢測，記錄280nm

6、和260nm處的吸光度。280nm為蛋白吸收峰，260nm為核酸吸收峰。其中260nm處讀數(shù)用來計算樣品的核酸濃度。1、紫外分光光度法 1 0D/A260nm=50ug/ml雙鏈DNA 1 0D/A260nm=33ug/ml單鏈DNA 1 0D/A260nm=40ug/ml RNADNA總產量ug= OD (A260nm)50ug稀釋倍數(shù)樣品總體積DNA濃度ug/ml= OD值(A260nm)50稀釋倍數(shù)提取RNA總產量ug= OD值(A260nm)40ug稀釋倍數(shù)樣品總體積RNA濃度ug/ml= OD值(A260nm)40稀釋倍數(shù)2、瓊脂糖凝膠微型電泳法 未知濃度的微量DNA片段可與知濃度的

7、DNA同時電泳，根據(jù)其結合的溴乙錠熒光強度其含量。電泳時各DNA的體積要準，否那么會有誤差。3、純度檢查 天然DNA的吸光度比值為A260nm：A230nm：A280nm=1.0:0.450:0.515 純DNA液的A260:A280:應為1.8-1.9。如比值低于1.6時，這提示有蛋白質和酚的污染，應進一步純化。4、RNA完好性檢查 常用變性的瓊脂糖電泳法檢查，常用的變性劑為甲醛、乙二醛和羥甲基汞。完好的RNA經(jīng)變性電泳后能分別出核糖體RNA中的28S和18S，且EB的顯色強度應為2:1左右。如28S帶降低而18S帶添加那么表示RNA標本有所降解。5、DNA、RNA的保管 4是DNA保管的最

8、正確和最簡單的條件之一。-70能夠是長期保管的良好溫度。但解凍時DNA可產生缺口，因此不宜反復凍融。DNA在TE緩沖液中10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，PH 8.0，4儲存6個月以上，其中EDTA還可抑制微生物生長。 RNA容易降解，操作和儲存中要防止RNA酶的污染。所用器皿高壓滅菌后用，重蒸水配制或用焦碳酸二乙酯DEPC處置過的蒸餾水溶解RNA，RNA溶液中參與RNA酶抑制劑RNasin， 終濃度為2U/10l，置-20保管備用。血清標志物用于疾病診斷、流行病調查 基因檢測用于 療效監(jiān)控、預后判別HIV抗體篩查實驗流程圖 肝炎診斷檢測道路英國HBV血清學診斷的S

9、OP(V.SOP6)HBsAg AssayNegativeReaciveReport: HBsAg NegativeConfirmatory HBsAg test from clot accoring to assay and local protcal(eg neutralisation or second HBsAg) Negative ReactiveV.SOP7Repeat 1st assay from clot (if availble)Both tests Negative1st reactive2nd negativeAnti-HBc testReport HBsAg negat

10、iveAnti-HBc NegativeAnti-HBc ReactiveReport : HBsAg equivocalRequest furth sampleReport : Anti-HBc Reactive.Further test Anti-HBbc IgM,HBeAg/anti-HBe and request a further sample實驗室檢測抗-HCV程序抗-HCV EIA陰性報告RR陽性S/CO比值3.8或報告報告報告報告報告我們如何選擇適宜的替代終點以合理考評療效? HBsAg消逝-完全應對 HBV DNA去除或抑制-病毒學應對e血清轉化 HBeAg消逝+抗HBe產生

11、-病毒學應對 ALT恢復正常-生化應對 肝臟組織學表現(xiàn)-組織學應對 還是結合應對？HBV DNA去除或抑制？優(yōu)點: HBV DNA抑制表示HBV復制的抑制程度，與HBeAg消逝和/或ALT恢復正常相關。缺陷:不能夠完全去除,不能反映繼續(xù)應對 抑制程度:105(AASLD guideline)還是104(AGA Panel recommendation*)?檢測沒有國際單位: 無法采用規(guī)范化單位報告 結果copies/mL、 pg/mL、meq/mL、log drop敏感性不同妨礙了對治療效果的比較*Phair J NATURAL HISTORY, DIAGNOSTICS, AND CLINIC

12、ALPROFILES OF PERSONS WITH CHRONIC HEPATITIS B核酸檢測要點靈敏度，規(guī)定值，失控?！凹纯绦再|控： SI值表即刻性質控N 3 4 5 6 7 8 9 10 11 N(3s) 1.15 1.49 1.75 1.94 2.10 2.22 2.32 2.41 2.48N (2s)1.15 1.46 1.67 1.82 1.94 2.03 2.11 2.18 2.23 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2.55 2.61 2.66 2.71 2.75 2.79 2.82 2.85 2.88 2.29 2.33 2.37 2.41 2.44

13、2.47 2.50 2.53 2.56 常用的質控規(guī)那么12s；一個質控結果超越X2S，此為警告規(guī)那么；12.5s；一個質控結果超越X2.5S，提示存在隨機誤差；13s；一個質控結果超越X3S，提示存在隨機誤差；R4s；同批兩個結果之差超越4S，即一個質控結果超越X+2S，另一個結果超X-2S。提示存在隨機誤差；22s；兩個延續(xù)質控結果同時超越X+2S或X-2S，提示存在系統(tǒng)誤差；41s；一個質控品延續(xù)的四次測定結果都超越X+1S或X-1S，兩個質控品延續(xù)兩次測定都超越X+1S或X-1S，提示存在系統(tǒng)誤差；7T；七個延續(xù)的質控結果呈現(xiàn)出向上或向下的趨勢，提示存在系統(tǒng)誤差；10 x；十個延續(xù)的質控結果在平均數(shù)的一側，提示存在