生物體內(nèi)藥物分析方法與實(shí)際應(yīng)用

1、生物體內(nèi)藥物分析方法與實(shí)際應(yīng)用簡介2.體內(nèi)藥物分析方法設(shè)計與建立3.方法學(xué)確認(rèn)（評價、確證、考評）1.1 生物樣品分析是藥代研究的必備手段：分析化學(xué)是化學(xué)科學(xué)中的“眼睛”“眼睛”是心靈的“窗戶”透過“窗戶”獲得大量的信息定量分析定性分析（半定量）1. 簡 介源于化學(xué)學(xué)科中的分析化學(xué)專業(yè)具有分析化學(xué)的基本概念和要求不同于一般的藥物分析同時具有生物學(xué)科的特點(diǎn)DistributionMetabolismAbsorptionExcretion生物樣品中藥物的分析測定是定量描述藥物體內(nèi)過程、獲得藥代參數(shù)的重要手段之一。1.2 方法學(xué)類型及特點(diǎn)： 體內(nèi)藥物分析方法大致可歸為主要的五類： 1. 光譜分析法

2、2. 色譜法 3. 毛細(xì)管電泳法 4. 免疫分析法 5. 同位素法 （）傳統(tǒng)分類方法:集各種方法之長, 為我所用: HPLC-UV HPLC MRD 體內(nèi)藥物分析方法特點(diǎn)： 靈敏度高： 受到給藥劑量的限制 受到生物利用度的限制 濃度低: 專一性好： 生物內(nèi)源性物質(zhì)的干擾 體內(nèi)新形成的代謝產(chǎn)物干擾 樣品量少： 血液（血漿、血清、全血） 尿、膽汁、唾液、汗、乳汁、精液 糞便、組織器官 方法快捷： 不是專門的方法學(xué)研究， 利用方法較快的闡明藥理學(xué)的問題。 可靠、重現(xiàn)性好： 藥代實(shí)驗(yàn)的不可重復(fù)性。 藥物類型多： 需要多種儀器、技術(shù)手段的配套 光譜分析法 比色法 紫外分光光度法: 差示、導(dǎo)數(shù)、雙波長、三

3、波長 熒光分光光度法 色譜法: 分離效率高; 專一性較高 HPLC: 適用范圍廣; 室溫檢測; 樣品預(yù)處理簡單; 流動相選擇范圍廣; 儀器自動化程度高 GC: 化合物氣化；載氣種類少； 方法靈敏，但受到進(jìn)樣量的限制 TLC: 檢測條件受限制 毛細(xì)管電泳法: 分離效率高; 專一性較高 毛細(xì)管區(qū)帶電泳 膠束電動毛細(xì)管色譜 毛細(xì)管凝膠電泳 毛細(xì)管等電聚焦 毛細(xì)管等速電泳 毛細(xì)管電色譜法進(jìn)樣量少，檢測條件受限制。 同位素法: 靈敏度高; 專一性差 放射強(qiáng)度表示標(biāo)記藥物量() 同位素技術(shù)與其他分析法相結(jié)合以提高專一性 免疫分析法: 放射免疫分析 酶免疫分析 熒光免疫分析（二）、生物樣本的藥物測定方法生物

4、樣品中的藥物測定，免疫學(xué)和微生物學(xué)方法。應(yīng)根據(jù)待測藥物的性質(zhì)，選擇特異性好、靈敏度高的測定方法。色譜法包括高效液相色譜法（HPLC），氣相色譜法（GC）和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。在需要同時測定生物樣品中多種化合物的情況下，LC-MS/MS和GC-MS/MS聯(lián)用法在特異性、靈敏度和分析速度方面有更多的優(yōu)勢。應(yīng)用放射性核素標(biāo)記法測定血藥濃度應(yīng)配合色法，以保證良好的檢測特異性。如某些藥物難于用上述的檢測方法，可選用免疫學(xué)或生物學(xué)方法，但要保證其可靠性。放射免疫法和酶標(biāo)免疫法具有一定特異性，靈敏度高，但原藥與其代謝產(chǎn)物或內(nèi)源性物質(zhì)常有交叉反應(yīng)，需提供證據(jù)，說明其特異性。生物學(xué)方法（如微生物法）常能反映藥效學(xué)

5、本質(zhì)，但一般特異性較差，應(yīng)盡可能用特異性高的方法（如色譜法）進(jìn)行平行檢查。 摘自: 臨床前藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（第二稿）（草案）2. 體內(nèi)藥物分析方法設(shè)計與建立2.1 體內(nèi)藥物分析方法設(shè)計的主要依據(jù) 明確分析方法設(shè)計的目的要求 a. 臨床藥物監(jiān)護(hù): 簡便、快速、批量測定 b.藥代動力學(xué)研究: 是否要求原形藥物與代謝物同時測定 注意整個濃度變化的范圍 樣品量多, 方法盡可能簡便 c. 配合新藥設(shè)計合成、藥理、毒理學(xué)的研究: 藥物是否吸收? 生物利用度如何? T1/2? Tmax? Cmax? 化合物藥代的快速評價 要求方法學(xué)簡單，快捷的提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 d. 新藥報批: 參照SFDA頒布的指

6、導(dǎo)原則,按照SOP進(jìn)行試驗(yàn).較快的獲得信息 了解待測藥物的特性, 調(diào)研文獻(xiàn) 藥物的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì) 檢測方法? 溶解度? 穩(wěn)定性? 藥物的藥理和毒理作用機(jī)制 生物樣品:動物屬性? 組織器官? (同一類化合物的)體內(nèi)代謝情況 藥物的劑量 給藥途徑 干擾成分的多少 樣品的預(yù)處理方法 儀器設(shè)備與實(shí)驗(yàn)室條件 文獻(xiàn)資料的可參考性? 可重復(fù)性? 別人可做的事情是否適合我們? 實(shí)驗(yàn)室硬件建設(shè)是否與研究課題相互匹配? 藥物就是藥物！它不是一般的化合物。應(yīng)掌握和理解它的藥效和毒性作用機(jī)制、理化性質(zhì)、將來的臨床應(yīng)用等等。只有對其加深理解才能進(jìn)行深入的代謝研究，包括藥物代謝研究所采用的方法技術(shù)。 體內(nèi)藥物分析方法設(shè)計

7、與建立的一般步驟 總的原則：根據(jù)被測藥物的性質(zhì)藥物濃度的大致范圍(經(jīng)驗(yàn)估計)儀器設(shè)備條件對藥物和研究目的的理解程度靈敏 專一 簡捷 可行 初步分析方法的預(yù)試優(yōu)化確認(rèn)以藥物進(jìn)行測定空白生物介質(zhì) + 藥物空白生物介質(zhì)(雜質(zhì))給藥后的生物樣品(有無藥物?產(chǎn)物?)考慮內(nèi)標(biāo)的選擇方法學(xué)的可行性驗(yàn)證評價3. 方法學(xué)確認(rèn)（評價、確證、考評） （validation）“生物樣品測定的關(guān)鍵是方法學(xué)的確證。方法學(xué)確證是整個藥代動力學(xué)研究的基礎(chǔ)。這是藥代動力學(xué)研究有別于其它藥理毒理研究的特殊之處。所有藥代動力學(xué)研究結(jié)果，都依賴于生物樣品的測定，只有可靠的方法才能得出可靠的結(jié)果。在通過特異性、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、

8、穩(wěn)定性等研究建立了檢測方法學(xué)，得到了標(biāo)準(zhǔn)曲線后，在檢測過程中還應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)質(zhì)控，制備隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線并對質(zhì)控樣品進(jìn)行測定，以確保檢測方法的可靠性?！?摘自: 臨床前藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（第二稿）（草案）生物介質(zhì)：一種生物來源物質(zhì)，能夠以可重復(fù)的方式采集和處理。例如全血、血漿、血清、尿、糞、 各種組織等。準(zhǔn)確度：在確定的分析條件下，測得值與真實(shí)值的接近程度。分析批：包括待測樣品、適當(dāng)數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)樣品和QC樣品的完整系列。一天內(nèi)可以完成幾個分析批，一個分析批也可以持續(xù)幾天完成。3.1 名詞解釋:重現(xiàn)性：不同實(shí)驗(yàn)室間測定結(jié)果的分散程度，以及相同條件下分析方法在間隔一段短時間后測定結(jié)果的分散程度。介質(zhì)

9、效應(yīng)：由于樣品中存在干擾物質(zhì)，對響應(yīng)造成的直接或間接的影響。穩(wěn)定性：一種分析物在確定條件下，一定時間內(nèi)在給定介質(zhì)中的化學(xué)穩(wěn)定性。精密度：在確定的分析條件下，相同介質(zhì)中相同濃度樣品的一系列測量值的分散程度。標(biāo)準(zhǔn)曲線：實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值與分析物濃度間的關(guān)系。應(yīng)采用適當(dāng)?shù)募訖?quán)和統(tǒng)計檢驗(yàn)，用簡單的數(shù)學(xué)模型來最適當(dāng)?shù)孛枋?。?biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)是連續(xù)的和可重現(xiàn)的，應(yīng)以回歸計算結(jié)果的百分偏差最小為基礎(chǔ)。質(zhì)控樣品：即QC樣品，系指在生物介質(zhì)中加入已知量分析物配制的樣品，用于監(jiān)測生物分析方法的重復(fù)性和評價每一分析批中未知樣品分析結(jié)果的完整性和正確性。標(biāo)準(zhǔn)樣品：在生物介質(zhì)中加入已知量分析物配制的樣品，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算質(zhì)控樣品

10、和未知樣品中分析物濃度。 定量范圍： 包括定量上限（ULOQ）和定量下限（LLOQ）的濃度范 圍，在此范圍內(nèi)采用濃度-響應(yīng)關(guān)系能進(jìn)行可靠的、可重 復(fù)的定量，其準(zhǔn)確度和精密度可以接受。選擇性：分析方法測量和區(qū)分共存組分中分析物的能力。這些共存組分可能包括代謝物、雜質(zhì)、分解產(chǎn)物、介質(zhì)組分等回收率：分析過程的提取效率，以樣品提取和處理過程前后分析物含量百分比表示。nominal concentration : 真實(shí)濃度 (濃度真值; 算術(shù)值) 如: 配置溶液(1.3mg/ml); 標(biāo)曲或QC中的fortified Samples : processed samples stock solution

11、standard samples authentic samples: 與試驗(yàn)物質(zhì)完全相同的樣品 (或根據(jù)試驗(yàn)樣品復(fù)制的標(biāo)準(zhǔn)品)3.2 體內(nèi)藥物分析方法的評價內(nèi)容：1. Selectivity: SFDA/FDA2. Linear Range and Response Factor： S/F3. Inter-Day Precision and Accuracy: S/F4. Intra-Day Precision and Accuracy: S/F5. Dilution Integrity: F6. Sensitivity: S/F7. Recovery (Extraction Efficie

12、ncy) S/F8. Matrix Effects: F9. Carryover Evaluation F10. Stability: S/F11. Relative Retention: F3.2.1 Selectivity:被測組分與內(nèi)源性物質(zhì)、試劑中雜質(zhì)、代謝產(chǎn)物以及其它干擾物質(zhì)有良好的分離; 必須證明所測定的物質(zhì)是預(yù)期的分析物，內(nèi)源性物質(zhì)和其他代謝物不得干擾樣品的測定。對于色譜法至少要考察6個不同來源空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對照物質(zhì)色譜圖（注明濃度）及用藥后的生物樣品色譜圖。對于質(zhì)譜法則應(yīng)著重考察分析過程中的介質(zhì)效應(yīng)。1. 被試驗(yàn)藥物標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖2. 正常生物樣品（空白

13、）的色譜圖3. 空白生物樣品外加被試藥物的色譜圖4. 給藥后的生物樣品的色譜圖試驗(yàn)報告(論文)中應(yīng)提供:3.2.2 Linear Range and Response Factor：必須用至少6個濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(n = / 5);應(yīng)使用與待測樣品相同的生物介質(zhì);定量范圍要能覆蓋全部待測濃度;不允許將定量范圍外推求算未知樣品的濃度。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)隨行空白生物樣品，但計算時不包括該點(diǎn)。 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)試驗(yàn)報告(論文)中應(yīng)提供:5. 空白生物樣品外加被試藥物(低,中,高三個濃度; n5)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的反算(back-calculated)測定濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍最低和最

14、高濃度樣品的色譜圖TabX. Standard Curve Readback Concentrations for XX 藥物 -20% 0.80 -15% 1.70 4.25 17.0 85.0 425 850 +20% 1.20 +15% 2.30 5.75 23.0 115 575 1150 Nominal Concentrations (ng/ml) 1.00 2.0 5.00 20.0 100 500 1000 1.07 1.98 4.67 18.3 97.4 483 1002 0.921 2.10 5.17 20.1 106 511 1063 1.04 2.10 4.69 20.4

15、 102 486 991 1.05 2.21 5.20 (a) 102 491 1038 0.946 2.21 5.20 19.9 102 495 1073 平均值: A B C E F G H SD I J K L M N O RSD% P Q R S T U V %RE W X Y Z A B C n n1 n2 n3 n4 n5 n6 n7Acceptance Criteria3.2.3 Inter-Day Precision and Accuracy:3.2.4 Intra-Day Precision and Accuracy:Precision of the method, defi

16、ned by the percent relative standard deviation ( %RSD = （standard deviation）（mean）100)， was determined from the interpolated QC sample concentrations.Accuracy of the method, defined by the percent relative error ( %RE = （standard observed concentrationnominal concentration） （ nominal concentration ）

17、100)Precision and AccuracyPrecision:10ng/ml10ng/mlAccuracy 要求選擇3個濃度的質(zhì)控樣品同時進(jìn)行方法的精密度和準(zhǔn)確度考察。 低濃度選擇在定量下限（LLOQ）附近，其濃度在LLOQ的3倍以內(nèi)； 高濃度接近于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限； 中間選一個濃度。每一濃度每批至少測定5個樣品，為獲得批間精密度應(yīng)至少連續(xù)測定3個分析批。 精密度用質(zhì)控樣品的批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）表示，RSD一般應(yīng)小于15%，在LLOQ附近RSD應(yīng)小于20%。 準(zhǔn)確度一般應(yīng)在85%115%范圍內(nèi)，在LLOQ附近應(yīng)在80%120%范圍內(nèi)。 空白生物樣品外加被試藥物(低,中,高三個

18、濃度; n5)的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度Inter-Day 和 Intra-Day Precision and Accuracy:國內(nèi)一般做法：1.00 n=5 10.0 +血漿 n=5 50.0 n=5同一天日內(nèi)1次/日；連測5天日間5個平行樣品合為一體；分5次進(jìn)樣濃度 樣品管 測定結(jié)果 1.0 1 2 3 4 5 10 1 2 3 4 5 100 1 2 3 4 5 合為一起日內(nèi)分5次測定合為一起日內(nèi)分5次測定合為一起日內(nèi)分5次測定若每日測定1次,連續(xù)測定5次，得日間結(jié)果數(shù)據(jù)處理Nominal Concentrations (ng/ml) 3.00 75.0 750 3.46 73.5 7

19、11 平均值: A B C SD I J K RSD% P Q R %RE W X Y n 6 6 6TabX. Quality Control Sample Concentration for XX 藥物 3.23 75.6 733 平均值: A B C SD I J K RSD% P Q R %RE W X Y n 6 6 612Inter-Day Statistics 平均值: A B C SD I J K RSD% P Q R %RE W X Y n 30 29 30 3.23 75.6 733 平均值: A B C SD I J K RSD% P Q R %RE W X Y n 6

20、6 6353.2.5 Dilution Integrity:如何測定超出線性范圍的樣品?Range: 10200ng/ml對大于200ng/ml的樣品要進(jìn)行稀釋: 500ng/ml 50ng/ml10X所處理和測定的結(jié)果是否符合要求: 50ng/ml的可信限之內(nèi) (50 ng/ml ) 表xx. Dilution Integrity for xxDrug Acceptance Criteria -15% 42500 +15% 57500 Nominal Concentrations (ng/ml) Acceptance 50000 Ratio 47478 49950 47794 6/6 512

21、04 49265 53459 平均值: 49858 SD 2239 % RSD 4.49 %RE -0.284 n 6Acceptance Ratio: 在“Acceptance Criteria”允許范圍內(nèi) 的 樣品數(shù)目除以分析的樣品總數(shù)對小于10ng/ml的樣品如何處理: 10ng/ml 20ng/mlRange: 10200ng/mlx2所處理和測定的結(jié)果是否符合要求: 10ng/ml的可信限之內(nèi) (10 ng/ml )3.2.6 Sensitivity:定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，要求至少能滿足測定35個半衰期時樣品中的藥物濃度，或Cmax的1/101/20時的藥物濃度，其準(zhǔn)確度

22、應(yīng)在真實(shí)濃度的80%120%范圍內(nèi)，RSD應(yīng)小于20%。應(yīng)由至少5個標(biāo)準(zhǔn)樣品測試結(jié)果證明。 最低檢測濃度(X/ml)最低檢測量(X)最低定量下限(LLOQ) 表xx. Sensitivity for xxDrug Nominal Concentrations (ng/ml) Run (1.00) 1 0.842 0.985 0.891 0.913 1.15 0.888 2 1.01 0.783 0.976 0.942 1.00 0.880平均值: 0.938 SD 0.0951 % RSD 10.1 % RE -6.02 n 12標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)表明：LLOQ為1ng/ml；該濃度的精密度為10.

23、1%；該濃度的準(zhǔn)確度為-6.02 3.2.7 Recovery (Extraction Efficiency)提取回收率: 應(yīng)考察高、中、低3個濃度的提取回收率，其結(jié)果應(yīng)當(dāng)一致、精密和可重現(xiàn)。 低、中、高(3個濃度):回收率不低于70%(原規(guī)定) 回收率不低于50%(改為)萃取回收率: Mean MeanConc. Peak Area Peak Area Peak Area Percent Percent SD(ng/ml) Fortified Fortified Processed Recovery Recovery Samples Samples Samples A1 A B1 B1 /A

24、 C D A2 B2 B2 /A A3 B3 B3 /A A4 B4 B4 /A B5 B5 /A M. E1 E F1 F1 /E G H E2 F2 F2 /E E3 F3 F3 /E E4 F4 F4 /E F5 F5 /E H. I1 I J1 J1 /I K L I2 J2 J2 /I I3 J3 J3 /I I4 J4 J4 /I J5 J5 /I 方法回收率:低 中 高(3個濃度)的加入量與檢出量的比較.L.M.H.Conc. 測定量 加入量 回收率 回收率(ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) (%) (平均)123456789101112131415L.M.H.212

25、223242526272829303132333435ABC3.2.8 Matrix Effects:在采用質(zhì)譜方法進(jìn)行體內(nèi)藥物定量檢測時,應(yīng)進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn),觀察基質(zhì)對藥物測定的影響. 基質(zhì)（matrix） 尚無統(tǒng)一的解釋，曾稱為“一種分析物（analyte）的環(huán)境（milieu）”，即指標(biāo)本中除分析物以外的一切組成。 以血清膽固醇（Chol）測定而言，就是指Chol以外血清中的一切成分及其物理、化學(xué)性質(zhì)。 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect）對臨床化學(xué)分析的影響越來越受到人們的重視。最早是在酶動力測定中用人工制備的參考物質(zhì)時發(fā)現(xiàn)的。 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect） 按NCCLS文

26、件的定義，指: （1）標(biāo)本中除分析物以外的其他成分對分析物測定值 的影響。 （2）基質(zhì)對分析方法準(zhǔn)確測定分析物的能力的干擾。 廣義說來，基質(zhì)效應(yīng)也應(yīng)包括已知的干擾物（如Chol測 定中膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸等都是干擾物），但 目前只將基質(zhì)效應(yīng)限于生物材料中未知或未定性的物質(zhì) 或因素（如粘度、pH等）的影響。減少基質(zhì)效應(yīng)的研究方向，至今仍有參考價值： 改進(jìn)室內(nèi)質(zhì)控樣品； 改進(jìn)儀器設(shè)計及試劑組成； 選擇方法及方法學(xué)參數(shù)，使其適應(yīng)性更強(qiáng)且易于掌握， 對制備物（如標(biāo)準(zhǔn)液，室間質(zhì)控樣品與質(zhì)控物）基質(zhì)的確切性不敏感。Matrix Factor (MF;基質(zhì)因子): peak area (fortifi

27、ed samples) peak area (analytical samples)fortified samples: 生物介質(zhì) 樣品處理 加入待測藥物 測定analytical samples: 標(biāo)準(zhǔn)樣品 測定 (兩種測定方式的藥物濃度相等)IS adjusted Matrix Factor (內(nèi)標(biāo)校正的基質(zhì)因子): 基質(zhì)因子是采用色譜峰面積峰面積計算. 內(nèi)標(biāo)校正的基質(zhì)因子是采用色譜峰面積的比值計算. ratios of peak area(Drug/IS) (fortified samples) ratio of peak area (Drug/IS) (analytical sampl

28、es) (兩種測定方式的藥物濃度相等)基質(zhì)因子為1, 表明藥物的測定無基質(zhì)效應(yīng)影響.基質(zhì)效應(yīng)影響范圍(基質(zhì)因子;內(nèi)標(biāo)校正的基質(zhì)因子)在某一個區(qū)間可被接受. (0.8-1.2)Drug 峰面積 IS 峰面積 PAR MF IS校正后MF Mean Mean （A） （B） （A/B） （A/C） （A/B）/D MF IS校正后MF 11404 39416 0.289 0.968 1.06 1.02 0.988 10658 51296 0.258 0.905 0.945 10557 39457 0.268 0.896 0.982 0.923 1.03 Mean 0.967 0.997SD 0.0

29、53 0.017%RSD 5.47 1.72N 6 6Tabxx. Matrix Effects for xx drugDrug 峰面積 IS 峰面積 PAR Drug 峰面積均 值 Mean PAR （A） （B） （A/B） （C） (D) 40240 0.269 11778 0.273 analytical samples fortified samples run1run2run3run4run5run63.2.9 Carryover Evaluation在方法評價中，線性的最高濃度（如1000ng/ml）被測試之后，必須測試試劑空白樣品來評價Carryover 。在樣品出峰的時間（R

30、T）,試劑空白樣品可能會出現(xiàn)一個相應(yīng)的信號，這個信號是LLOQ的百分之幾（LLOQ%）? LLOQ: 1.0 ng/ml; Acceptance: 0.8-1.2 ng/ml , (1.0 ng/ml 的 20%) ; 在進(jìn)樣高濃度樣品時，在分析系統(tǒng)中會產(chǎn)生“攜帶污染”；“污染” 到什么程度時，分析方法可以接受；什么程度時，分析方法不可以接受；Carryover可允許接受的范圍 “20% of LLOQ”如果： 方法學(xué)的 LLOQ = 1ng/ml ( 1ng/ml X ) 20% 那么： 假定：在validation試驗(yàn)中，觀察到1000ng/ml（線性范圍的 最高濃度）樣品引起 50% o

31、f Carryover (殘留量)，指的是LLOQ的50%;(1ng/ml的50% = 0.5ng/ml)1000ng/ml的殘留率：(ng/ml1000ng/ml=0.05%）“cut-off”濃度(殘留量在20%的LLOQ以下的藥物濃度)： X = 400ng/ml（1000ng/ml的殘留量為0.5ng/ml, 多大濃度的殘留量為20%的LLOQ？解“一元一次方程”所得到的濃度就是分析方法所分析的最大濃度。）1000ng/ml的樣品所引起的殘留為 ；殘留率為0.05%。若要求所引起的殘留為LLOQ（1ng/ml）的20% (0.2ng/ml)， 那么該樣品的濃度應(yīng)400ng/ml。若某一

32、個樣品的濃度 400ng/ml ，那么所操作的下一個樣品就要求重新進(jìn)行驗(yàn)證。3.2.10 Stability:生物樣品在處理前,室溫放置的穩(wěn)定性(Benchtop Stability).(2)生物樣品在處理前,4放置的穩(wěn)定性低 (n=5)中 (n=5)高 (n=5) 放置一定時間 處理 測定穩(wěn)定性試驗(yàn)應(yīng)從實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)際情況出發(fā), 如觀察時間,存放溫度等. 表xx. XX介質(zhì)中XX藥物在XX條件下的穩(wěn)定性試驗(yàn) Acceptance Criteria -15% 0.99 12.8 85.0 +15% 1.02 17.3 115 Nominal Concentrations (ng/ml) Acce

33、ptance 1.00 15.0 100 Ratio 0.99 13.0 87.8 8/9 1.01 16.7 98.0 1.05 17.1 114.8 平均值: A B C SD E F G RSD% H I J n 3 3 3Acceptance Ratio: 在“Acceptance Criteria”允許范圍內(nèi) 的 樣品數(shù)目除以分析的樣品總數(shù)(3) Freeze/Thaw Stability:觀察生物樣品經(jīng)反復(fù)多次凍-融后的穩(wěn)定性;低、中、高三個濃度;(或低、高二個濃度);標(biāo)明凍存條件的溫度(如:-20或-70等);標(biāo)明融化后樣品所處的溫度(如:20或25或室溫等);Freeze/Th

34、aw的周期數(shù). 表xx. XX介質(zhì)中XX藥物經(jīng)4次凍(-20)融(25) 后的穩(wěn)定性試驗(yàn) Acceptance Criteria -15% 0.99 12.8 85.0 +15% 1.02 17.3 115 Nominal Concentrations (ng/ml) Acceptance 1.00 15.0 100 Ratio 0.99 13.0 87.8 12/12 平均值: A B C SD E F G RSD% H I J n 4 4 4 Acceptance Ratio: 在“Acceptance Criteria”允許范圍內(nèi) 的 樣品數(shù)目除以分析的樣品總數(shù)(4) Extract S

35、tability:觀察生物樣品經(jīng)處理后,待測樣品放置一定時間的穩(wěn)定性;低、中、高三個濃度;(或低、高二個濃度);標(biāo)明放置的時間 (如:50小時等);標(biāo)明放置的條件(如:10等); 表xx. XX介質(zhì)中XX藥物經(jīng)處理后在xx條件 放置xx小 時的穩(wěn)定性試驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù) 斜率1/(ng/ml) 截距 相關(guān)系數(shù) 0.00 xxx 0.00 xxx 0.999xx Stansard Curve Readback Concentrations Acceptance Criteria -20% 0.800 -15% 1.70 4.25 17.0 85.0 425 850 +20% 1.20 +15% 2

36、.30 5.75 23.0 115 575 1150 Nominal Concentrations (ng/ml) 1.00 2.00 5.00 20.0 100 500 1000 0.971 1.94 5.20 20.4 99.7 493 957 1.01 1.89 5.01 19.7 102 501 1121 Mean - - - - - - - %RE - - - - - - - n 2 2 2 2 2 2 2 (續(xù)) XX介質(zhì)中XX藥物經(jīng)處理后在xx條件 放置xx小 時的穩(wěn)定性試驗(yàn) Acceptance Criteria -15% 2.25 63.8 638 +15% 3.45 86.

37、3 863 Nominal Concentrations (ng/ml) Acceptance 3.00 75.0 750 Ratio 3.17 74.0 695 15/15 2.98 76.4 700 2.81 77.2 701 2.80 77.8 697 3.21 74.2 731 Mean - - - SD - - - n 5 5 5 (5) Solution Stability:觀察藥物溶液的穩(wěn)定性,濃度: 藥物儲存液的濃度(xxmg/ml)條件: 溶媒; 溫度;標(biāo)明放置的時間 (如:50小時或30天等)與新配置的藥液進(jìn)行比較表xx. XX藥物溶液在XX 放置XX天后 色譜峰面積比值

38、Old Stock Solution Nominal Conc. (3.0mg/ml)# 制備時間 色譜峰面積比值 4/17/03 1.60 1.54 1.46 Mean(R2) 1.53 SD 0.07 %RSD 4.60 n 3 New Stock Solution Nominal Conc. (4.0mg/ml) #制備時間 色譜峰面積比值 5/16/03 1.58 1.59 1.51Mean(R1) 1.53 SD 0.07 %RSD 4.60 n 3%Difference -1.92%Difference為: (R2-R1)x100/R1#在同一個濃度下進(jìn)行計算條件: 溶媒; 溫度:

39、 一般應(yīng)進(jìn)行兩個溫度條件下的觀察 如: 一個在冷藏溫度 一個在室溫 即: 冷藏一套試驗(yàn)數(shù)據(jù) 室溫一套試驗(yàn)數(shù)據(jù)(6) 冷凍條件下的穩(wěn)定性(生物樣品) XX介質(zhì)中XX藥物在xx條件 放置xx天的穩(wěn)定性試驗(yàn) Acceptance Criteria -15% 2.25 63.8 638 +15% 3.45 86.3 863 Nominal Concentrations (ng/ml) Acceptance 3.00 75.0 750 Ratio 2.85 74.0 695 14/15 2.98 76.4 700 2.81 77.2 701 2.80 77.8 697 3.21 74.2 637 Mean - - - SD - - - n 5 5 5 用來考察生物樣品經(jīng)較長時間的低溫存放的穩(wěn)定性,以確定質(zhì)控樣品能否長期存放?3.2.11 Relative Retention: 評價和觀察分析系