enzyme Tech 酶學(xué)技術(shù)

1、酶的分析檢測(cè)技術(shù)酶促反應(yīng)分析酶活力測(cè)定方法常見酶類的活力測(cè)定方法123456 維持酵素活性緩衝液緩衝液可維持溶液的恆定酸鹼度及離子濃度，兩者都會(huì)影響酵素的活性經(jīng)常在緩衝液中加入一些物質(zhì)，以增加酵素安定或保持活性溫度的影響濃度的影響 7試劑的保存避免潮解分裝凍藏: 切勿反復(fù) 凍結(jié)-解凍。甘油凍藏避光防菌8酵素失活的原因可歸類成如下的物理性或化學(xué)性原因。 (1) 蛋白質(zhì) 變性：(2) 酵素 活性區(qū) 破壞：(3) 蛋白脢 水解：(4) 酵素 抑制劑：9酶反應(yīng)速度曲線產(chǎn)物濃度時(shí)間斜率濃度/時(shí)間V酶反應(yīng)速度可以通過單位時(shí)間內(nèi)，單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。10酶反應(yīng)速度和底物濃度的關(guān)系Vm

2、ax1/2VmaxV 反應(yīng)速度混合級(jí)反應(yīng)零級(jí)反應(yīng)一級(jí)反應(yīng)S 底物濃度Km11米氏方程v=VmaxS/(Km+S)Km為酶反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，為酶的特征常數(shù)。同一酶對(duì)不同底物Km不同。Km最小的底物為該酶的最適底物。12酶活力的測(cè)定酶活力的測(cè)定就會(huì)是測(cè)定酶促反應(yīng)速度。必須測(cè)定酶反應(yīng)的初速度。底物濃度必須足夠的大，至少為Km的10倍。酶濃度必須適合。131、化學(xué)法化學(xué)法是利用化學(xué)反應(yīng)使產(chǎn)物變成一個(gè)可用某種物理方法測(cè)定的化合物。如根據(jù)比色、酸堿滴定、量熱、量氣法等來計(jì)算酶的活性。142、放射性化學(xué)法經(jīng)同位素標(biāo)紀(jì)的底物在酶活力測(cè)定中有很重要的價(jià)值，用于標(biāo)記的同位素一般有：當(dāng)同位素

3、衰變時(shí)放出射線（粒子）。放射性化學(xué)法原理與化學(xué)法相似，但反應(yīng)終止后，必須把放射標(biāo)記的底物與產(chǎn)物分離，多用層析和電泳法，然后測(cè)定產(chǎn)物（或底物）的放射性，就可得知酶的活性。153、酶偶聯(lián)法有一些酶促反應(yīng)的產(chǎn)物不易直接測(cè)定，需加入一指示酶轉(zhuǎn)變成可測(cè)定的產(chǎn)物如測(cè)定葡萄糖氧化酶的反應(yīng)速度：D葡萄糖+ O2 葡萄糖酸內(nèi)酯+H2O2此反應(yīng)可用量氣法或氧電極法測(cè)定，但通過一指示酶二過氧化物酶催化的反應(yīng)測(cè)定吸收光譜的變化更為方便準(zhǔn)確。H2O2 +色原（如愈創(chuàng)木脂）H20+O2+染料16測(cè)定酶活力中止反應(yīng)法或連續(xù)反應(yīng)法進(jìn)行中止反應(yīng)法 在恒溫反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行酶促反應(yīng)，間隔一定的時(shí)間，分幾次取出一定容積的反應(yīng)液，使酶即

4、刻停止作用，然后分析產(chǎn)物的生成量或底物的消耗量。這是最古典的但仍是經(jīng)常使用的方法，幾乎所有的酶都可以根據(jù)這一原理，設(shè)計(jì)測(cè)定其活力的具體方法。17酶反應(yīng)的中止使酶停止作用常使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、三氯乙酸或過氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫酸鈉）使酶失活，或迅速加熱使酶變性等。酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物一般可用化學(xué)法，放射性化學(xué)法，酶偶聯(lián)法進(jìn)行測(cè)定。18192021三、連續(xù)法測(cè)定酶活力連續(xù)法測(cè)定酶活力，不需要取樣中止反應(yīng)，而是基于反應(yīng)過程中光譜吸收，氣體體積、酸堿度、溫度、粘度等的變化用儀器跟蹤監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)行的過程，記錄結(jié)果，算出酶活性。連續(xù)法使用方便，一個(gè)樣品可多次測(cè)定，且有利于動(dòng)力學(xué)研究，但很多酶反應(yīng)還不能用該

5、法測(cè)定。221、一般的連續(xù)法A 光譜吸收法該法主要指分光光度法和熒光法。分光光度法是利用反應(yīng)物和產(chǎn)物在紫外和可見光部分光吸收不同，選擇一適當(dāng)?shù)臐舛?，連續(xù)測(cè)定讀出反應(yīng)過程中光吸收的變化。該法適用于一些反應(yīng)速度較快的酶。自動(dòng)記錄儀的普遍使用使該法更容易被人們接受。23脫氫酶以NAD+或NADP+或作為輔酶，反應(yīng)中形成NADH或NADPH，340nm處可以觀察到光吸收的變化。NAD（P）H在340nm處吸收光后發(fā)射出460nm的光。因而，需這兩個(gè)輔因子的任何反應(yīng)都可用熒光法測(cè)定。24B 電化學(xué)法很多不同類型的電化學(xué)法已用于酶反應(yīng)測(cè)定中，最重要之一是電位計(jì)技術(shù)。其基本原理是溶液的電勢(shì)取決于被測(cè)物的濃度

6、和性質(zhì)，采用這一原理制成的離子選擇性電極，如pH電極可測(cè)定酶反應(yīng)過程中反應(yīng)液pH值的變化，從而得知參與反應(yīng)的酶的活力。25C 量氣法在酶反應(yīng)中底物或產(chǎn)物之一為氣體時(shí)，可以通過測(cè)量反應(yīng)系統(tǒng)中氣相的體積或壓力的改變，計(jì)算出氣體釋放或吸收的量。根據(jù)氣體變化和時(shí)間的關(guān)系，即可求得酶反應(yīng)速度。最常用的氣體測(cè)量?jī)x為瓦（勃）氏測(cè)壓儀（Warburg manometric apparatus）。用測(cè)壓儀測(cè)定酶活力的優(yōu)點(diǎn)是可以連續(xù)取得讀數(shù)，以了解整個(gè)酶反應(yīng)的過程，缺點(diǎn)是靈敏度低。準(zhǔn)確程度都較光譜吸收法低。26D 量熱法由于在反應(yīng)過程中有反應(yīng)熱的變化，用非常靈敏的量熱計(jì)可以測(cè)定酶反應(yīng)速度。該法靈敏，無干擾，且很通

7、用，近年來逐漸引起了人們的重視。27E 旋光法在某些酶催化的反應(yīng)中，底物和產(chǎn)物的旋光有所不同，這時(shí)就可以根據(jù)旋光的變化來跟蹤酶反應(yīng)過程。在某些情況下，可通過形成絡(luò)合物來提高旋光度。如乳酸與鉬酸鹽反應(yīng)形成高比旋絡(luò)合物，故可用旋光計(jì)跟蹤LDH催化的乳酸和丙酸之間的轉(zhuǎn)換。然而，在通常情況下，由于該法與其它方法相比靈敏度低，因而很少采用282、偶聯(lián)的連續(xù)法偶聯(lián)的連續(xù)法就是將指示酶直接加到待測(cè)酶反應(yīng)系統(tǒng)中，將其產(chǎn)物直接或間接轉(zhuǎn)變成一個(gè)可用光譜吸收儀檢測(cè)的化合物。連續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)必須在酶反應(yīng)相同條件（pH，溫度等）下進(jìn)行，且加入的指示酶，以及其他各種物質(zhì)不能干擾原來的酶活力。29四、酶分析的自動(dòng)化所謂酶分析

8、的自動(dòng)化是指從加樣，啟動(dòng)反應(yīng)，檢測(cè)、數(shù)據(jù)記錄及結(jié)果處理等整個(gè)過程都由儀器自動(dòng)操作。自動(dòng)分析技術(shù)主要基于酶促反應(yīng)的初速度原理，下面介紹兩種方法。30定時(shí)法定時(shí)法是指在線性范圍內(nèi)，定時(shí)記錄反應(yīng)過程中讀數(shù)的變化（如吸光度），由于這一變化值直接正比于初速度，故可分析出相應(yīng)的物質(zhì)濃度。這種分析儀多用分光光度法檢測(cè)或選用離子選擇性電極，對(duì)大批量樣品進(jìn)行單一成分分析或?qū)γ恳粯悠愤M(jìn)行多因素分析，效率很高。31固定化酶的活力測(cè)定與水不溶性載體結(jié)合，在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用的酶稱為固定化酶。固定化酶的性質(zhì)與游離酶有一些區(qū)別。所以固定化酶的活力測(cè)定與游離酶活力測(cè)定方法也有一些不同。32常用的固定化酶活力測(cè)定方法

9、介紹振蕩測(cè)定：稱取一定重量的固定化酶，放在一定形狀，一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在特定的條件下，一邊振蕩或攪拌，一邊進(jìn)行催化反應(yīng)。經(jīng)過一定時(shí)間，取出一定量的反應(yīng)液進(jìn)行測(cè)定。33柱法測(cè)定：將一定量的固定化酶裝進(jìn)具有恒溫裝置的反應(yīng)柱中，讓條件適宜的底物溶液，以一定的速率流過酶柱，收集流出的反應(yīng)液。按常規(guī)方法測(cè)定底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量。測(cè)定方法與游離酶反應(yīng)液的測(cè)定方法相同。34連續(xù)測(cè)定利用連續(xù)分光光度法等方法可對(duì)固定化酶反應(yīng)液進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，從而連續(xù)測(cè)定酶活力。測(cè)定時(shí)，可將振蕩反應(yīng)器中的反應(yīng)液用泵連續(xù)引到連續(xù)測(cè)定儀（例如，雙束紫外分光光度計(jì)等）的流動(dòng)比色杯中進(jìn)行連續(xù)分光測(cè)定。或者使固定

10、化酶柱流出的反應(yīng)液連續(xù)流經(jīng)流動(dòng)比色杯進(jìn)行連續(xù)分光測(cè)定。35一些酶常用活力測(cè)定方法一、淀粉酶的活力測(cè)定淀粉酶的測(cè)定方法很多，活力單位的定義差別很大?，F(xiàn)介紹國(guó)內(nèi)外常用的幾種方法。1、 消色法：這是我國(guó)常用的淀粉酶測(cè)定方法。在pH6.0，60條件下，每小時(shí)催化1g可溶性淀粉成為糊精的酶量為1個(gè)酶活力單位。2、3、MMU法：美國(guó)Miles公司采用的方法，以30min內(nèi)催化可溶性淀粉生成1mg麥芽糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（麥芽糖單位；MMU）36二、糖化酶的活力測(cè)定糖化酶活力測(cè)定都是以可溶性淀粉為底物在一定條件下進(jìn)行反應(yīng)，以單位時(shí)間內(nèi)生成一定量的葡萄糖所需的酶量為酶的活力單位。但酶反應(yīng)的條件各不相同

11、，酶活力單位定義也有所差別。37糖化酶的活力測(cè)定次碘酸鈉法SP法DU法NPG法38三、蛋白酶的活力測(cè)定蛋白酶種類繁多，不同蛋白酶的性質(zhì)和催化反應(yīng)條件各不相同，無法規(guī)定一個(gè)統(tǒng)一的測(cè)定方法。目前使用最多的有福林酚法、紫外光分光分度法和甲醛滴定法。391、福林酚法：蛋白酶催化蛋白質(zhì)水解生成氨基酸。其中含酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸等)與福林酚試劑反應(yīng)，生成藍(lán)色復(fù)合物。藍(lán)色深淺與含酚氨基酸的量成正比，從而測(cè)定其活力。402、紫外光分光光度法：蛋白質(zhì)或多肽水解后生成的含苯環(huán)氨基酸對(duì)275nm波長(zhǎng)的紫外光具有最大的吸收值。利用蛋白酶催化酪蛋白水解前后在三氯醋酸可溶物中紫外線吸收值的變化，可測(cè)定酶活力的高低

12、。413、甲醛滴定法：用蛋白酶水解蛋白質(zhì)生成氨基酸。再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1N NaOH滴定生成的氨基酸的量，從而測(cè)定酶活力。424、DHT酪蛋白法：用5-氨基四唑重氮鹽將酪蛋白中部分組氨酸和酷氨酸重氮化，得到黃色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白為底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽。二價(jià)鎳離子可與DHT-蛋白及DHT-肽形成穩(wěn)定的可溶性紅色螯合物，而鋅離子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。選用合適濃度的鋅離子和鎳離子作為沉淀劑和顯色劑，利用比色法可測(cè)定蛋白酶活力。43四、脂肪酶的活力測(cè)定脂肪酶在一定條件下，將甘油三酯水解，在不同水解階段可

13、放出脂肪酶、甘油二酯、甘油單酯及甘油。水解放出的脂肪酸可用標(biāo)準(zhǔn)堿液滴定。從而測(cè)定酶活力。44五、葡萄糖異構(gòu)酶的活力測(cè)定以葡萄糖為底物，在酶的作用下異構(gòu)化生成果糖，可用單位時(shí)間內(nèi)葡萄糖的減少量或果糖的生成量來表示酶活力。咔唑法：果糖與咔唑反應(yīng)生成紅色物質(zhì)顏色深淺與果糖含量成正比，通過分光光度計(jì)測(cè)定，可測(cè)出果糖含量，進(jìn)而計(jì)算酶活力。45六、果膠酶的活力測(cè)定果膠酶是一類水解果膠的酶的總稱，包括果膠酯酶（PE）。聚半乳糖醛酸酶（PG）和聚半乳糖醛酸裂解酶（PGL）等多種。它們的作用方式和產(chǎn)物各不相同，無法找到一種方法適用于所有果膠酶的活力測(cè)定。經(jīng)分離純化后，可各采用不同的方法測(cè)定酶活力。對(duì)于混合的果膠

14、酶，一般采用次碘鈉法和粘度法測(cè)度。46次碘酸鈉法：果膠酶水解果膠生成-半乳糖醛酸，可用次碘酸鈉法進(jìn)行半乳糖醛酸的定量，從而測(cè)定果膠酶活力，對(duì)于分離純化的外切聚半乳糖醛酸酶也采用本法測(cè)定活力。粘度法：果膠被果膠酶水解后粘度下降。粘度下降至2080%范圍內(nèi)時(shí)，與酶濃度成正比。47七、堿性磷酸酶的活力測(cè)定堿性磷酸酶在堿性條件下催化磷酸單脂水解生成無機(jī)磷酸，該酶的測(cè)定一般采用NPP法或定磷法。1、NPP法：以對(duì)硝基酚磷酸（NPP）為底物，在酶作用下，NPP水解生成黃色的對(duì)硝基酚，可用分光光度計(jì)測(cè)定。2、定磷法：以腺苷酸(AMP)為底物，按上述方法進(jìn)行酶反應(yīng)，生成的磷酸用鉬蘭定磷法測(cè)定650nm波長(zhǎng)下的光密度變化，從而測(cè)定酶活力。48八、葡萄糖氧化酶的活力測(cè)定葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸和雙氧水，產(chǎn)生的葡萄糖酸，用過量的氫氧化鈉中和后，用鹽酸反滴定，可得到葡萄糖酸的生成量，從而計(jì)算酶活力。49九、胃蛋白酶的活力測(cè)定每min能催化水解血紅蛋白生成1mL酪氨酸的酶量，為1個(gè)蛋白酶活力單位。用分光光度法在275nm的波長(zhǎng)處測(cè)吸收度50十、胰蛋白酶的活力測(cè)定測(cè)定時(shí)，取底物溶液3.0mL，加鹽酸（0.001mol/L）0.2mL混勻，作為空白