mrna的分離純化細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)質(zhì)粒構(gòu)建-protocol

1、一， 引物設(shè)計(jì):1,選擇合適的載體。酶切位點(diǎn)及其順序（酶切位點(diǎn)的順序一定不能顛倒）。2，在 NCBI 上再次確認(rèn)目的片段的堿基序列。1， 使用word 排除目的片段里含有的酶切位點(diǎn)，最后確定所使用的酶。2， 設(shè)計(jì)引物：primer-up：Primer-down：-3， 核對(duì)送公司。4， 對(duì)公司的引物離心，10000rpm、5-10 分鐘、at 4，在超凈臺(tái)按照管子上標(biāo)注的體積加入高壓水（2dH2O），再把上游引物和下游引物混在一起，at 4保存。二， PCR（P 出目的片段）：贈(zèng)送的菌液里 P 出目的片段：（一）、從韓家淮1，揺菌過夜：2ul 韓家淮的菌液，Xul 相應(yīng)的抗生素3ml LB94

2、9458725min30sec 30sec X min2,pcr:菌液 1ul 2x PFU mix25ulPrimer2d H2O1ul23ul72 5min（X 是根據(jù)片段的長(zhǎng)度設(shè)定，500-1000bp/min，退火溫度根據(jù) Tm 值來計(jì)算，一般低于 Tm 值 2）3，跑膠、回收:（1），配膠：稱 0.6g 的瓊脂糖加入 60ml 的 1X TAE加入 0.6ul 的 EB(待溫度降到 50-60左右時(shí))25 分鐘后，即可點(diǎn)樣跑膠。（2），跑膠：130-150V、25-30 分鐘左右。（3），紫外燈下觀察，切膠（要帶防護(hù)手套和）4，做膠回收（天根TIANGEN公司的 DNA 純化回收試劑

3、盒）:按照試劑盒的 protocol 來做，在膠回收的最后一步，Elution Buffer 預(yù)先在 55-65溫箱中水浴，并且在加過 EB 后，放在 37溫煮沸 3 次1%的瓊脂糖膠：大塊Pcr 溫度體 系Pcr(50ul)反應(yīng)體系33cycles15ml 離心管- 首位 20 個(gè)堿基末尾 20 個(gè)堿基的反向互補(bǔ)堿基上游酶切位點(diǎn)-下游酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基 4 個(gè)保護(hù)堿基 4 個(gè)箱中 2min。對(duì)膠回收的產(chǎn)物跑膠驗(yàn)證。可建立 10ul 的體系：回收產(chǎn)物 2ul、 10 xloading buffer 2ul、2d H2O 6ul。三， 酶切、：1，目的片段酶切：（37酶切過夜或者 4 小時(shí)）ins

4、ert ：上述膠回收產(chǎn)物 35ul10 x H buffer（1.5x） 7ul50ul 的體系dd H2O 6ul酶 1酶 21ul1ul2，載體酶切：（37酶切過夜或者 4 小時(shí)）Vector （1ug/ul）：2 ul10 x buffer（1.5x） 3ul20ul 的體系dd H2O 13ul酶 1酶 21ul1ul為方便以后使用，載體可以多切點(diǎn)。3， 酶切時(shí)，首先要核對(duì)一下酶的 buffer，有時(shí)雙酶切時(shí)兩個(gè)酶不能共用一種 buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切產(chǎn)物回收。4，連接：2x Ra Vector insertT4 DNALigation6

5、ul 0.8ul4.5ul12ul 的體系（目的是為了多加點(diǎn) insert）Lignase1ul四， 轉(zhuǎn)化：感受態(tài)細(xì)菌 10ul、冰上 20 分鐘-熱激：42、90 秒-冰上 2 分鐘、加 1ml SOC（或者 1ml LB），37、180 rpm、45 分鐘。、將上述轉(zhuǎn)化后的菌液加入到 100ml 的LB 中。再按抗生素：LB=1:1000 的比例加入抗生素，（100ml 的LB 加 50ul 的 2Kx 的氨芐）。、250rpm、過夜。五， 質(zhì)粒大抽：六， 收菌：取過夜菌至 50 毫升離心管，離心：6000g、3-5 分鐘、4。再重復(fù)一次，每管共收集100 毫升過夜菌沉淀。（倒置于草紙上使

6、液體流盡)。質(zhì)粒 10ul七， 重懸：每管加入 8ml 的 RES-EF(RnaseA)，重懸細(xì)菌沉淀充分 Vortex 或用槍頭吹打沉淀。確保沉淀完全散開，無可見細(xì)菌團(tuán)塊。3，裂解：每管加入等量的LYS-EF bu er，即 8ml。輕輕上下顛倒離心管 4-6 次，（勿震?。┦覝胤胖?5min，使細(xì)菌完全裂解，溶液透明，無團(tuán)塊或絮狀物。注意：vortex 或其它劇烈操作會(huì)導(dǎo)致污染4，平衡：組 DNA 斷裂，易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒被組 DNA：濾芯柱子，將柱子駕于 50ml 離心管上（或者直接架于 50ml 離心管架上）：取 15ml EQU-EF buffer 沿濾芯四周加入充分平衡濾芯。注意：

7、離心管內(nèi)的液體不要浸沒濾柱的頭，所以要勤于倒棄濾液，在過濾平衡液的同時(shí)，進(jìn)行 5、6 步，防止濾芯干掉。5，中和：在等待 EQU-EF buffer 濾完時(shí)，往裂解好的菌液中加入 8ml NEU-EF buffer，顛倒混勻，冰上孵育 5min。（不能 vortex）6，離心、過濾：離心中和過的菌液：10000rpm、5-10min、at 4-質(zhì)粒存在于上清中。（離心使沉淀更加緊密，更集中于管底，對(duì)于進(jìn)一步提高質(zhì)粒質(zhì)量會(huì)有所幫助）：將上清吸入到平衡好的濾芯中,重力自流盡。7，洗一：過濾完畢后，吸取 5ml 的 FIL-EF buffer，沿濾芯四周加入（將粘在濾芯上的質(zhì)粒洗下來）-過濾完后，將

8、濾芯棄掉。8，洗二：往濾柱中加入 35ml 的 ENDO-EF buffer去內(nèi)毒素 9，洗三：待濾完后再加入 15ml 的wash-EF buffer過濾。10，洗脫：取一支干凈的 15ml 超速離心管，將濾完的柱子往濾柱中加入 5ml Elu-EF buffer.到離心管中，用高壓條將二者綁好，(Elu-EF buffer 預(yù)先放在 50的恒溫箱中加熱，可提高洗脫效率) 11，沉淀：待Elu-EF buffer 濾完后，棄濾柱，往離心管中加入 5ml 的異丙醇（將質(zhì)粒沉淀下來），混勻（充分 vortex），12，洗滌：10min-10000rpm、30min、4-棄上清。加 5ml 的 70（ETOH）或用 15ml 三蒸水（高壓過）+35ml 的無水乙醇配制（在超凈臺(tái)進(jìn)行），混勻（上下顛倒即可），離心：10000rpm、10min、常溫。棄