免疫標記技術-精品課件

1、 第十一章 免疫標記技術第一節(jié) 免疫標記技術簡介 將某種可微量或超微量測定的物質（如放射性核素、熒光素、酶、化學發(fā)光劑等）標記于抗原（抗體）上制成標記物，加入到抗原抗體的反應體系中與相應的抗體（抗原）反應，以檢測標記物的有無及含量的多少，間接反映被測物的存在。稱做免疫標記技術（immunolabelling technique）。 免疫標記技術概念優(yōu)點:特異、敏感、快速；能定性和定量甚至定位，且易于觀察。 免疫標記技術的分類免疫熒光標記技術免疫酶標記技術放射免疫測定法 金免疫技術、化學發(fā)光免疫技術、免疫印跡技術、流式細胞術 一、免疫熒光標記技術 (immunofluorescence,IF)

2、用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標本中抗原反應，熒光顯微鏡下觀察，抗原-抗體復合物散發(fā)熒光，借此對抗原進行定性或定位。 免疫熒光法可用于檢測多種病原體的抗原、抗體，或鑒定免疫細胞膜抗原。 二、免疫酶標記技術 (enzyme immunoassay,EIA) 將抗原-抗體反應的特異性與酶催化作用的高效性相結合，借助酶作用于底物的顯色反應判定結果。應用酶標測定儀測定光密度（OD）值可反映抗原含量，靈敏度達ng/ml甚至pg/ml水平。 三、放射免疫測定法 (radioimmunoassay,RIA) 用放射性核素標記抗原或抗體進行免疫學檢測。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應的特異

3、性，檢測靈敏度達pg水平。 常用于標記的放射性核素為125I和131I，分為液相和固相兩種方法。 常用于測定微量物質，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素；嗎啡、地高辛、IgE等。一、熒光基礎知識簡介（一）熒光的產(chǎn)生 一些化學物質能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。第二節(jié) 免疫熒光標記技術熒光免疫技術一般應用致熒光物質進行標記。熒光種類致熒光：光激發(fā)產(chǎn)生化學熒光X線熒光陰極射線熒光 可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。熒光發(fā)射的特點是：

4、（二）熒光效率 熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。 熒光效率發(fā)射熒光的光量子數(shù)/ 吸收光的光量子數(shù)（三）熒光的猝滅 熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射 熒光物質的保存應注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。 （四）常用的免疫標記熒光物質 1、異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC） 黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。 最大吸收光波長為490nm495nm，最大發(fā)射光波長520nm5

5、30nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，在冷暗干燥處可保存多年，是應用最廣泛的熒光素。 其主要優(yōu)點是： 人眼對黃綠色較為敏感， 通常切片標本中的綠色熒光 少于紅色。2、四乙基羅丹明 （rhodamine,RIB200） 橘紅色粉末，易溶于酒精。性質穩(wěn)定，可長期保存。 最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595nm600nm，呈橘紅色熒光。3、四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC） 紫紅色結晶粉末，溶于水和酒精。最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。 與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標

6、記或對比染色，其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。二、熒光免疫標記技術原理和方法（一）原 理 熒光免疫技術是用化學方法使熒光素標記的抗體（或抗原）與組織或細胞中的相應抗原（或抗體）結合，進行定性定位檢查抗原或抗體的方法。（二）方 法 1、直接熒光法 把熒光抗體加到待檢的細胞懸液、細胞涂片或組織切片上進行染色，經(jīng)抗原抗體反應后，洗去未結合的熒光抗體。將待檢標本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應抗原存在。 可用于病毒感染細胞、帶某種特異抗原的細胞（如T細胞和B細胞）或病原菌的檢查，也可用于組織中沉著的免疫復合物的檢查?？乖瓨擞浛贵w光原熒光直接法原理示意圖缺點：檢查每種抗原均需制備相應標

7、記的抗體炭疽桿菌24h培養(yǎng)物直接熒光抗體檢測間接法原理示意圖抗原抗體標記抗體光原熒光(一)間接法 將抗體(一抗)與標本中的抗原結合,再用FITC標記的二抗染色。 2、間接熒光法 將組織或細胞上的抗原直接與相應抗體（不標記熒光）結合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異結合的熒光標記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒光標記的第二抗體，在熒光顯微鏡下觀察熒光。 間接法原理示意圖抗原抗體標記抗體光原熒光優(yōu)點：敏感，一種標記抗體可以檢測多種抗原缺點：操作繁瑣3、免疫熒光細胞化學 先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原（或抗體）。在細胞

8、或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。 三、熒光標記抗原/抗體時非特異性 染色的主要因素微生物的原發(fā)熒光組織的原發(fā)熒光游離熒光素及其衍生物的存在抗體不純抗原不純?nèi)旧划斔?、免疫熒光標記技術的應用（一）定性分析 熒光物質特性的光譜包括激發(fā)光譜和熒光光譜兩種。在分光光度法中，被測物質只有一種特征的吸收光譜，而熒光分析法能測出兩種特征光譜，因此，鑒定物質的可靠性較強。（二）定量測定 熒光分析法的定量測定方法較多，可分為直接測定法和間接測定法兩類。1、直接測定法 利用熒光分析法對被分析物

9、質進行濃度測定。2、間接測定法 有些物質本身不能發(fā)光或熒光量子產(chǎn)率低，只能用間接測定法化學轉化法、熒光猝滅法、敏化發(fā)光法五、 熒光免疫技術實驗示例抗細胞核抗體(Antinuclearantibody,ANA) 檢測對膠原性疾病(如全身性紅斑性狼瘡)及其他自身免疫性疾病的診斷有一定意義?！驹?理】 全身性紅斑性狼瘡 (SLE)是一種自身免疫性疾病，患者血清中出現(xiàn)ANA。以大白鼠肝細胞核作為抗原基質，加病人血清 (第一抗體)，再加熒光標記的抗人IgG(第二抗體)進行間接免疫熒光試驗，若患者血清中有ANA，ANA便與肝細胞核抗原結合，再與熒光標記的抗人IgG結合，在熒光鏡下可見細胞核顯示黃綠色特異熒

10、光。【材 料】1、 大白鼠肝組織印片。2、 病人血清。3、 熒光標記抗人IgG。4、 丙酮、PBS、緩沖甘油 (PBS+等量甘油)。5、 陽性血清和陰性血清?！痉?法】1、 將大白鼠肝冰凍印片浸于丙酮中固定5分鐘，PBS漂洗三次，每次3分鐘，取出晾干，-20保存?zhèn)溆谩? 、用PBS稀釋病人血清，使成1:5、1:10、 1：201:1280稀釋度。3、 將不同稀釋度的病人血清10微升分別加入鼠肝印片上，放濕盒內(nèi)，置37培養(yǎng)箱中30分鐘。4、用PBS洗去印片上未結合的血清，然后再用PBS漂洗三次，每次3分鐘，晾干。5、分別滴加適當稀釋的熒光標記抗人的IgG(1:10),放濕盒內(nèi)，置37培養(yǎng)箱中30

11、分鐘。7、 在染好的玻片上滴加緩沖甘油，熒光鏡檢。6、用PBS洗去未結合的熒光抗體，然后再用PBS漂洗三次，每次3分鐘，晾干。【結 果】 整個肝細胞核著色發(fā)出黃綠色熒光者為陽性;不發(fā)熒光者為陰性。 第三節(jié) 酶免疫技術一、 酶免疫技術中酶、顯色底物和標記物的制備 在酶免疫技術中用于標記的酶應具有催化活性高、催化專一性強與抗原抗體偶聯(lián)后不影響抗原抗體的免疫反應性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物產(chǎn)生的信號產(chǎn)物易于觀察和檢測；對人無害且價廉、易得等特點。表1 常用酶及底物常用酶底物加終止液前顏色加終止液后顏色辣根過氧化物酶（HRP）RZ3.1堿性磷酸酶（AP）鄰苯二胺（OPD）四甲基聯(lián)苯胺

12、（TMB）對硝基苯磷酸酯（p-NPP）橙黃色藍色黃色棕黃色黃色黃色（二） 標記物的制備標記物制備的方法兩類： 1、交聯(lián)法 交聯(lián)法是以一可同時與酶和抗體（抗原）結合的交聯(lián)劑作為“橋”，分別連接酶與抗體（抗原）的方法，此類方法中目前最常用的是戊二醛交聯(lián)法，形成的結合物為：酶-戊二醛-抗體（抗原）。2、直接法 直接法是用一活化劑首先將酶活化，被活化的酶分子上的基團直接可與抗體（抗原）結合形成標記物，如過碘酸鈉法。 形成的結合物為：酶-抗體（抗原）。 二、 辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)標記抗體的制備示例 （一）辣根過氧化物酶和底物簡介 Horseradish

13、 Peroxidase,HRP 比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。 HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18。 底物：鄰苯二胺、四甲基聯(lián)苯胺簡易過碘酸鹽氧化法原理： 辣根過氧化物酶的標記常用過碘酸鹽氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結合。后者可進一步用NaBH (氫硼化鈉）(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標記抗體。 四 操作步驟 （1）稱取5mgHRP溶解于0.5ml蒸餾水中。（2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1M NaIO溶液

14、，混勻， 4靜置30分鐘。（3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混勻， 靜置30分鐘。（4）加入含5mg抗體的水溶液1ml，混勻裝入透析袋，pH9.5 碳酸鹽緩沖液透析，4過夜。（5）加0.2 mL 新配的5 mg/mL NaBH液，混勻，再置4 , 2h。（6）在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4 1h。（7）3000 r/min 離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的PBS中。（8） 將上述溶液裝入透析袋中，對0.15 moL/L pH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000 r/min 離

15、心30 min 去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。(二)HRP標記抗體的方法 1、原理 戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。2、 試劑及器材 (1)0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl 1.8g，加蒸餾水至200ml。(2)1.25戊二醛液：取25戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。(3)1M PH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。(4)0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶于

16、0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。(5)0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。(6)PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。(7)萘氏試劑及聚乙二醇(PEG，MW2000)。(8)純化的特異性抗體或抗IgG抗體。(9)HRP(RZ3.0)。(10)Sephadex G-25層析柱(2cm50cm)。(11)攪拌器，分光光度計，離心機。(12)透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。3、標記步驟 (1)稱取HRP 25mg溶于1.25戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。(2)反應后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5

17、ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。(3)將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。(4)用1M PH9.5碳酸鹽緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3小時。(5)加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室 溫2小時。(6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨， 置4 1小時。(7)3000rpm離心30min，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。(8)將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液

18、即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。4、 結果判定(1)定性及效價滴定: 用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。 然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式實驗系統(tǒng)里)對酶結合物進行滴定。(2)定量和克分子比值測定 可用分光光度計測定(光程1cm)。 酶量(mgml)OD403nm0.4 IgG量(mgml)OD280nm- OD403nm0.42)0.940.62 (三)注意事項 1.在具備高質量HRP的條件下，所要標記的抗體也要活性高,效價高(最低116),純度高，親和力好，這是保證標記物效價高，免疫活性好

19、的首要條件。2.所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑，最好(或必需)新鮮配制。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應為新鮮純品，因戊二醛儲存過久可形成縮和體(雜質)。否則，影響標記效果。3.室溫攪拌時須避光，室內(nèi)溫度一般在25為宜。標記物每次透析前，須認真檢查，防止漏液。4.濃的標記物相當穩(wěn)定，常加入3040甘油于-10下保存。4可保存12年，但稀釋成110，只能保存數(shù)周。已配制的使用液應在12小時內(nèi)用完。切忌反復凍融。三、酶免疫技術類型和應用 酶免疫技術按照抗原抗體系統(tǒng)是定位于組織細胞上還是存在于液體樣品中分為酶免疫組化技術和酶免疫測定（EIA）。 酶免疫測定分為 均相酶免疫測定和異相

20、酶免疫測定。 1、酶免疫增強測定技術（EMIT） 2、克隆酶供體免疫分析（CEDIA） （二）異相酶免疫測定1、酶聯(lián)免疫吸附試驗2、酶聯(lián)免疫斑點試驗3、生物素親和素ELISA4、發(fā)光酶免疫測定（一）均相酶免疫測定 1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 是酶免疫測定中應用最廣的技術，用于測定可溶性抗原或抗體。 將已知抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應板）表面，使抗原-抗體反應在固相表面進行，借助洗滌將固相上的抗原-抗體復合物與液相中游離成分分離。酶標儀 (1)間接法：用于測定抗體。先將抗原被覆，洗滌后加待檢血清，充分漂洗后

21、加入酶標記的抗抗體，洗后即可供顯色觀察。 (2)雙抗體夾心法：先用抗體(IgG)被覆，加待檢抗原，作用洗滌后，加酶標記抗體。（3）競爭法 即可檢測抗原又可檢測抗體。它是用酶標抗原（抗體）與待測的非標記抗原（抗體）競爭性的與固相載體上的限量抗體（抗原）結合，待測抗原（抗體）多，則形成非標記復合物多，酶標抗原與抗體結合就少，也就是酶標記復合物少，因此，顯色程度與待測物含量成反比。競爭法待測樣本酶標抗體底 物終止液2、酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT) 原理：將抗細胞因子抗體包被固相載體，加入不同來源的細胞，細胞分泌的細胞因子與包被抗體結合，在細胞周圍形成抗體-抗原（細胞因子）復合物。 然后加入相應

22、酶標記的抗細胞因子抗體，通過底物顯色反應測定結合在固相載體上的細胞因子量，并可在光鏡下觀察分泌細胞因子的細胞。 3、BAS-ELISA 生物素（biotin）是廣泛分布于動、植物體內(nèi)的一種生長因子，又稱輔酶R或維生素H。親和素(avidin)是卵白及某些微生物中的一種蛋白質。生物素與親和素間具有高度親和力，且均能偶聯(lián)抗體、抗原和辣根過氧化物酶而不影響其生物學活性。在生物素-親和素系統(tǒng)(biotin avidin system,BAS)中，借助所形成的親和素-生物素-酶復合物，追蹤生物素標記的抗原或抗體，通過酶催化底物顯色，可檢出相應抗體或抗原。 生物素酶標親合素系統(tǒng)反應示意圖4、 發(fā)光酶免疫測

23、定 與一般EIA的區(qū)別是酶所催化的底物是發(fā)光劑。產(chǎn)物不是一般EIA的有色物質，而是發(fā)光產(chǎn)物，所發(fā)出的光可用特定的儀器測定。常用的酶是HRP和AP，HRP的發(fā)光底物有魯米諾及衍生物、對-羥基苯乙酸；AP的底物為3-（2-螺旋金剛烷）-4-甲氧基-(3-磷酸氧基)-苯基-1，2-二氧乙烷和4-甲基傘形酮磷酸鹽。四、 酶免疫技術實驗示例酶聯(lián)免疫吸附試驗 （Enzyme Linked Immunosorbent Assay ,ELISA）雙抗體夾心法檢測HBsAg【原 理】 以特異性抗體(抗-HBs)致敏載體表面，然后將含有抗原的標本與致敏的載體一起孵育，洗去過量溶液。再加人酶標特異抗體(酶標抗-HB

24、s)。酶標抗體就連接到已結合于抗體致敏的載體表面的抗原上，孵育后，洗去過量的結合物。最后加底物溶液，根據(jù)顏色反應來判定抗原含量?！静?料】 HBsAg試劑盒，本試劑盒采用雙抗體夾心法檢測HBsAg，適用于血清或血漿標本，具有快速簡便，特異性強，靈敏度高，重復性好，所需標本量少等優(yōu)點。試劑盒含: 1、 包被抗-HBs反應條1板 2、 酶結合物 1瓶 3、 HBsAg陽性對照1瓶 4、 HBsAg陰性對照1瓶 5、 洗滌液:用前每瓶作1：20稀釋1瓶 6、 顯色劑（TMB）A 1瓶 7、 顯色劑（TMB）B1瓶 8、 終止液 1瓶 【方 法】 1、 加人待測標本 每孔50微升，并設HBsAg陽性對

25、照2孔，HBsAg陰性對照2孔，空白對照1孔，然后加入酶結合物每孔1滴 (50微升、空白對照孔不加)，充分混勻后置37孵育30分鐘。2、 手工洗板：棄去反應條孔內(nèi)液體、拍干、用洗滌液注滿每孔，棄去拍干，反復五次后拍干。 (洗板機洗板：選擇洗滌五次程序洗板，洗滌液注滿每孔，浸泡時間不短于20秒，洗滌程序完成后拍干。)3、 加顯色劑：先加顯色劑A每孔1滴 (50微升)，然后再加顯色劑B每孔1滴 (約50微升，混勻，37孵育10分鐘。 【結果判斷】 比色法： 每孔加終止液1滴 (50微升)，混勻，波長450nm，先用空白孔校零點，然后讀取各孔光密度值樣品OD值2.1判斷為陽性，否則為陰性。備注：陰性

26、對照平均OD值 低于0.05作0.05計算，高于0.05按實際OD值計算。【注意事項】1、 試劑盒置28保存。2、 使用前試劑應搖勻，并棄去12滴后垂直滴加。3、 從冷藏環(huán)境中取出試劑盒內(nèi)全部瓶裝試劑及待測標本所需微孔條，置室溫平衡30分鐘后再行測試，余者應及時封存于冰箱中以備后用。4、 待測標本不可用NaN3防腐。5、 不同批號試劑請勿通用。6、 結果判斷須在10分鐘內(nèi)完成。7、 若濃縮洗滌液出現(xiàn)結晶時，請置 37至溶解。 第四節(jié) 放射免疫技術 一、原理與方法（一）原理 放射免疫分析法（radioimmunoassay RIA） 應用競爭性結合的原理，應用放射性同素標記抗原（或抗體）與相應抗

27、體（或抗原）結合，通過測定抗原抗體結合物的放射活性判斷結果。 本方法可進行超微量分析，敏感性高，可用于測定抗原、抗體、抗原抗體復合物。 放射免疫標記技術常用的同位素有125和1311、液相法 將待檢標本（例如含胰島素抗原）與定時的同位素標記的胰島素（抗原）和定時的抗胰島素抗體混合，經(jīng)一定作用時間后，分離收集抗原抗體復合物及游離的抗原，測定這兩部分的放射活性，計算結合率。 放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種（二）方法2、固相法 將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然后加待檢標本，最后加標記抗體測定固相載體的放射活性。常用的固相載體有溴化氰（CNBr）海豹化的紙片或聚苯乙烯小管。二、放射免疫分析加

28、樣程序（一）放射免疫分析順序飽和加樣程序1、基本原理 先將標準物或血樣品與抗血清混勻，免疫反應624h，使抗原與抗體充分結合，甚至達到平衡，然后再加入標記抗原，與抗體反應1224h，最后分離B與F，這稱為順序飽和分析法。 2、加樣程序 以人血漿精氨酸加壓素RIA測定程序為例 （直接測定）。（1）加樣（單位l；總反應體600l）。（2）孵育：4，24h。（3）分離B與F。無肽血漿，用于血漿的直接測定。其制備方法為：在電磁攪拌下，抽取2%加膜活性炭溶液5ml，共兩管，離心、去上清。血漿5ml，倒入上述活性炭管中，加蓋，充分振蕩10min，離心，上清倒入上述另一活性炭管中，振蕩10min，再離心，取

29、上清，即無肽血漿。（二）放射免疫分析平衡飽和加樣程序1、基本原理 所謂平衡飽和，是指抗原和抗體反應達到即不結合，也不解離的平衡狀態(tài)，稱為飽和狀態(tài)，即平衡飽和。所以，有人稱此為飽和分析法。這意味著抗原或被測抗原、標記抗原、抗體三者一起溫育。2、加樣程序 一般先加標準物或被測樣品，再加抗血清，最后加標記物。這樣的順序是讓標準物或被測物與抗體有短暫的結合，提高抗原的競爭抑制能力。在小分子半抗原的放射免疫分析中，標記抗原和未標記抗原與抗體結合的親合力常常是不相同的，前者比后者的親合力高。 以大鼠垂體、下丘腦-內(nèi)啡肽RIA測定程序為例：（1）加樣（單位l；總反應體積500l）。（2）孵育：4，24h。（

30、3）分離B與F：每管加入2%加膜活性炭溶液300l，搖勻，立即離心，去上清，測沉淀（F）的cpm數(shù)。三、放射免疫分析的質量控制（一）質量控制的目的和內(nèi)容 1、在一個測定方法內(nèi)產(chǎn)生的誤差。 2、在同一實驗室內(nèi)不同方法之間產(chǎn)生的誤 差。這兩種情況屬于內(nèi)部質量控制。 3、用同一測定方法，在各實驗室之間產(chǎn)生 的誤差。 4、采用不同方法，在各實驗室之間產(chǎn)生的 誤差。后兩種情況屬于外部質量控制。（二）產(chǎn)生測量誤差的因素（三）放射免疫分析中測量誤差的控制1、選擇準確性高的方法2、建立方法對比3、建立各種類型的標準。如規(guī)定標準品的 純度、制備方法、使用年限及使用條件4、建立操作規(guī)程，按規(guī)程操作5、建立可靠的檢

31、查制度四、標記抗原的放射免疫技術（RIA）（一）原 理 將標記抗原和未標記抗原一起加入相應的抗體時則兩種抗原產(chǎn)生相互的競爭，而生成有標記抗原和抗體復合物以及非標記抗原和抗體復合物。二者含量在一定限度內(nèi)呈反比，利用此法可測定未知抗原或抗體。 抗體為限量的（二）放射免疫抗原的制備1、完全抗原 為了保證免疫反應的特異性，放射免疫抗原純度必須在90%以上。通常采用電泳、凝膠過濾、離子交換層析等技術獲得較高純度的抗原。2、半抗原 要獲得較好的免疫原性，必須將半抗原與蛋白質大分子的載體結合起來形成一個完全抗原。結合的載體，通常包括血清白蛋白、 球蛋白、纖維蛋白、甲狀腺球蛋白、雞卵蛋白等（三）抗體的制備與提純 （四）抗原的標記1、放射性同位素的選擇 選擇同位素的原則： 方法簡單、經(jīng)濟、便于推廣應用。 易于防護。 同位素與標記物結合好，不易從標記物上脫落。 對標記物不引起輻射損傷，使蛋白變性。 具有較高的計數(shù)效率。目前常用的同位素有3H、125 I，其它還有14C、35S和32P等。表1 各種標記同位素的性質比較同位素毒性分類半衰期3H14C131I125I35S32P低毒低毒高毒低毒中毒中毒12.26年5730年8.07天60.20天67.48天14.26天2、標記方法 目前