以獲得高分辨率光學(xué)切片的熒光顯微鏡系統(tǒng)課件

1、熒光顯微鏡 掃描型激光共聚焦顯微鏡 上轉(zhuǎn)換激光共聚焦顯微鏡吳艷分子影像與核醫(yī)學(xué)研究中心401#1124熒光顯微鏡Fluorescence microscopy 熒光顯微鏡是用來(lái)觀察研究樣品熒光現(xiàn)象的光學(xué)顯微鏡，目前主要由光源、濾片系統(tǒng)、光路系統(tǒng)等組成。 廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)領(lǐng)域，可對(duì)組織和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、蛋白質(zhì)表達(dá)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等進(jìn)行定位、定性觀察及分析。熒光顯微鏡儀器型號(hào)： OLYMPUS IX73 研究級(jí)倒置熒光顯微鏡Fluorescence microscopy參加過(guò)儀器使用培訓(xùn)，通過(guò)網(wǎng)上儀器知識(shí)考試，網(wǎng)上提前預(yù)約，管理員審核通過(guò)方可使用。注意事項(xiàng)：汞燈使用時(shí)盡量減少啟動(dòng)次數(shù)；燈熄滅后要等

2、待冷卻才能重新啟動(dòng)；點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15min 放置地點(diǎn) ：401-1312室 管理員：吳安慶老師顯微鏡參數(shù)1主機(jī)功能：系統(tǒng)具有明場(chǎng)、相差、微分干涉、熒光觀察功能；2透射光光源：外置電源供應(yīng)器100W鹵素?zé)敉干涔庹彰餮b置；3物鏡：長(zhǎng)工作距離萬(wàn)能平場(chǎng)半復(fù)消色差相差（熒光）物鏡：4（數(shù)值孔徑N.A.0.13）、10（N.A.0.3），20（N.A.0.7）、40（N.A.0.6），60X（N.A.0.7）4物鏡轉(zhuǎn)盤(pán)：6孔以上編碼型物鏡轉(zhuǎn)盤(pán),與軟件連接后能夠保存物鏡信息，隨物鏡轉(zhuǎn)換能夠自動(dòng)校準(zhǔn)標(biāo)尺；5載物臺(tái)：精確定位功能手動(dòng)載物臺(tái)；具備XY鎖定和復(fù)位功

3、能, 可重現(xiàn)標(biāo)本位置，游標(biāo)尺的精度100m；6聚光鏡：超長(zhǎng)工作距離萬(wàn)能聚光鏡，孔位數(shù)5；7熒光照明器：主機(jī)反射熒光系統(tǒng)可采用復(fù)眼照明技術(shù)，平均熒光視野亮度，便于量化分析；8. 熒光光源：130W以上長(zhǎng)壽命熒光光源, 光導(dǎo)管傳輸，長(zhǎng)度1.5米，符合RoHS 和WEEE法令要求；9. 高通透性熒光激發(fā)塊：紫外， BP340-390, DM410，BA420-IF 藍(lán)色，BP460-495, DM505，BA510-IF 綠色，BP530-550, DM570，BA575-IF；10熒光激發(fā)塊轉(zhuǎn)盤(pán)：編碼型熒光激發(fā)塊轉(zhuǎn)盤(pán)，7孔位設(shè)計(jì)，便于今后擴(kuò)展應(yīng)用,無(wú)需工具即可更換濾色鏡組,與軟件連接后能夠隨圖片保

4、存熒光濾色鏡組信息；11濾色鏡：透射用日光平衡濾色片、綠色濾色片，熒光用減光片ND6/ND25；12DIC附件：40X、60X物鏡配置微分干涉附件。顯微鏡參數(shù) 基本原理激發(fā)濾鏡：從光源中分濾出一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。（一般有紫外、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片） 帶通濾色鏡(BP)：有寬、窄帶之分。如：BP450-490 長(zhǎng)、短通濾色鏡組合（LP + KP）：LP450 + KP490 雙色鏡：雙色分光鏡；反射短波長(zhǎng)，透過(guò)長(zhǎng)波長(zhǎng)。阻斷濾鏡：吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡；選擇并讓特異的熒光透過(guò)，表現(xiàn)出專(zhuān)一的熒光色彩。 多為長(zhǎng)通濾色鏡；LP490紫外藍(lán)綠高壓汞燈被熒光探針染色的生物樣本激發(fā)被標(biāo)記結(jié)構(gòu)的熒光光學(xué)圖像光

5、學(xué)成像濾鏡分光標(biāo)本制作要求 （一）載玻片載玻片厚度應(yīng)在0.81.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無(wú)明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。 （二）蓋玻片蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。（三）標(biāo)本組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。（四）封裱劑封裱劑常用甘油，必須無(wú)自發(fā)熒光，無(wú)色透明，熒光的亮度在pH8.59.5時(shí)較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。（五）鏡油一般

6、暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須使用鏡油，最好使用特制的無(wú)熒光鏡油，也可用上述甘油代替。注意事項(xiàng):1、為延長(zhǎng)汞燈壽命，打開(kāi)汞燈后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15分鐘后才能關(guān)閉。2、汞燈熄滅后待完全冷卻才能重新啟動(dòng)，否則燈內(nèi)汞蒸氣尚未恢復(fù)到液態(tài)，內(nèi)阻極小，再次施加電壓，會(huì)引起短路，導(dǎo)致汞燈爆炸。這樣不僅損壞電器，更重要的是汞蒸氣溢出，將導(dǎo)致工作室污染。故關(guān)閉汞燈之后，不能馬上再次打開(kāi)，必須等待至少30分鐘。開(kāi)了不能馬上關(guān)，關(guān)了不能馬上開(kāi)。熒光顯微鏡的不足:1.無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光,透射光的同時(shí)采集,無(wú)法實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)采集及共定位。2.熒光散射光太強(qiáng)，造成實(shí)際分辨率

7、的大大下降。3.熒光漂白及對(duì)細(xì)胞組織的照射損傷。4.無(wú)法對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描,完成3D的工作。5.只能在二維環(huán)境下觀察。6.樣品不能太厚。激光共聚焦掃描顯微鏡（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ） 以激光作為光源，采用光源針孔與檢測(cè)針孔共軛聚焦技術(shù)，對(duì)樣本進(jìn)行斷層掃描，以獲得高分辨率光學(xué)切片的熒光顯微鏡系統(tǒng)共聚焦顯微鏡的類(lèi)型點(diǎn)（慢）掃描共聚焦顯微鏡 分辨率高，圖像清晰，采集圖像速度慢線(xiàn)（狹縫）掃描共聚焦顯微鏡 分辨率低，速度快，噪音高轉(zhuǎn)盤(pán)式掃描共聚焦顯微鏡 性能介于上述兩者之間激光共聚焦掃描顯微鏡OLYMPUS FV1200 研究級(jí)倒置熒光顯微鏡 參加過(guò)儀

8、器使用培訓(xùn)，通過(guò)網(wǎng)上儀器知識(shí)考試，網(wǎng)上提前預(yù)約，管理員審核通過(guò)方可使用。注意事項(xiàng)：1、開(kāi)機(jī)和關(guān)機(jī)需要管理員來(lái)操作2、換樣本的時(shí)候需要將物鏡降下來(lái)，或點(diǎn)擊軟件上Escape3、能用普通熒光顯微鏡觀察拍照的樣本就不要用共聚焦顯微鏡，節(jié)約激光器壽命。放置地點(diǎn)：401-1312室管理員：吳安慶老師收費(fèi)：200元/小時(shí) 上轉(zhuǎn)換共聚焦掃描顯微鏡多線(xiàn)氬離子激光器(458 nm, 488 nm, 515 nm)半導(dǎo)體激光器：405 nm, 559 nm, 635 nm上轉(zhuǎn)換專(zhuān)用激光器：808 nm,980 nm活細(xì)胞CO2培養(yǎng)系統(tǒng)OLYMPUS FV1200放置地點(diǎn)：401-1111管理員：吳艷普通激光共聚焦

9、顯微鏡的功能上轉(zhuǎn)換材料的成像檢測(cè)普通共聚焦：400元/小時(shí)上轉(zhuǎn)換共聚焦：1000元/小時(shí)院內(nèi)5折，校內(nèi)8 折只允許3天后15天內(nèi)的預(yù)約儀器參數(shù)針孔光欄分光鏡發(fā)射熒光單色器及檢測(cè)器多線(xiàn)氬離子激光器(458 nm, 488 nm, 515 nm)半導(dǎo)體激光器：405 nm, 559 nm, 635 nm上轉(zhuǎn)換專(zhuān)用激光器：808 nm,980 nm計(jì)算機(jī)圖像存儲(chǔ)與處理及控制系統(tǒng)IX83儀器參數(shù)儀器參數(shù)儀器參數(shù)基本原理激光器擴(kuò)光器樣品濾光片針孔檢測(cè)器入射光發(fā)射光長(zhǎng)通濾光片基本原理入射光發(fā)射光長(zhǎng)通濾光片激光器擴(kuò)光器樣品濾光片針孔檢測(cè)器基本原理入射光發(fā)射光長(zhǎng)通濾光片激光器擴(kuò)光器樣品濾光片針孔檢測(cè)器基本原理

10、儀器特點(diǎn) 1、光源 用激光做光源，從理論上消除了色差。因?yàn)榧す獾膯紊詮?qiáng)、光源波束集中、波長(zhǎng)相同。2、采用了共扼聚焦技術(shù) 在物鏡的焦平面上放置了一個(gè)小孔，將焦平面以外的雜散光擋住，消除了球差。3、點(diǎn)與面掃描技術(shù) 共聚焦顯微鏡：將樣品分解成二維或三維空間上的無(wú)數(shù)點(diǎn)，用十分細(xì)小的激光束（點(diǎn)光源）逐點(diǎn)逐行掃瞄、成像，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件組合，最后得到一個(gè)整體平面的或立體的像。4、圖像信號(hào)及處理： 光電倍增管放大信號(hào)，計(jì)算機(jī)采集和處理光信號(hào)。儀器特點(diǎn)更靈敏： 共聚焦顯微鏡采用了光電倍增技術(shù)，可將很微弱的熒光信號(hào)放大。只要有信號(hào)就能被檢測(cè)到。定位更精確： 不僅可以定位到細(xì)胞水平，還可以定位到亞細(xì)胞水平、和分子

11、水平。這也是熒光標(biāo)記的抗體被稱(chēng)為分子探針的原因。光漂白和熒光淬滅作用?。?由于利用光源光束點(diǎn)掃描，檢測(cè)過(guò)程快，時(shí)間短，計(jì)算機(jī)精確控制激發(fā)光強(qiáng)度，光漂白和熒光淬滅作用很小。激光共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢(shì) 石蠟切片，冰凍切片，涂片，印片、鋪片，培養(yǎng)的粘附細(xì)胞，懸浮細(xì)胞，各種染色，非染色熒光標(biāo)記的組織（包括活組織） 激光共聚焦顯微鏡的樣本共聚焦顯微鏡的應(yīng)用高清晰成像半定量熒光強(qiáng)度分析熒光探針表達(dá)量測(cè)定分層掃描多種熒光標(biāo)記同時(shí)檢測(cè) 1、高清晰成像激光共聚焦顯微鏡因使用共扼光路使非焦平面的光線(xiàn)被抑制，減少了成像的干擾，以及使用光色較純的激光，所以成像分辨率可達(dá)普通光學(xué)顯微鏡的1.4倍?？梢郧逦谋憩F(xiàn)某些細(xì)微結(jié)構(gòu)

12、。鼠成纖維細(xì)胞單克隆anti-tubulin標(biāo)記 高清晰成像渦蟲(chóng)綱扁蟲(chóng)肌動(dòng)蛋白絲鬼筆環(huán)肽高清晰成像培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞吖叮橙染色高清晰成像 2、半定量熒光強(qiáng)度分析 熒光信號(hào)通過(guò)光電倍增管轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，經(jīng)過(guò)電腦分析可對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定。隨機(jī)圈取細(xì)胞可得到所圈細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度值利用熒光與透射光同時(shí)掃描，觀測(cè)相等面積內(nèi)不同組間熒光標(biāo)記蛋白表達(dá)的差異。3、熒光標(biāo)記表達(dá)量測(cè)定 4、分層掃描（切片掃描）按共扼聚焦的原理，通過(guò)調(diào)節(jié)針孔的大小，可控制樣品掃描層面的厚度。即樣品中相當(dāng)薄的一層被探測(cè)到，而其他層面不影響成像。當(dāng)觀測(cè)較厚樣品時(shí)，普通透射光不能透過(guò)樣品，則可以通過(guò)切片掃描檢測(cè)熒光的方法來(lái)觀測(cè)。

13、較厚層面 較薄層面 人血管內(nèi)皮細(xì)胞PI標(biāo)記觀測(cè)損傷。標(biāo)記細(xì)胞為損傷細(xì)胞。 4、分層掃描（切片掃描）連續(xù)分層掃描，可得到CT片類(lèi)似的效果，對(duì)樣品Z軸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。經(jīng)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)重組，可觀測(cè)空間結(jié)構(gòu)，空間定位，三維重組。 4、分層掃描（切片掃描） 5、多色熒光標(biāo)記檢測(cè)普通熒光顯微鏡每次只能觀測(cè)一種熒光，要觀測(cè)多種熒光標(biāo)記的樣品需要多次觀測(cè)，對(duì)樣品損傷大。激光共聚焦顯微鏡可以多激光多通道同時(shí)掃描，多通道同時(shí)探測(cè)。綠色：SYBR 14染色，活精子紅色：PI染色，死精子肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞藍(lán)色：Hoechst 33342 ，染DNA紅色：PI，染核仁RNA綠色：Alexa Fluor 488染肌絲蛋白常用熒光探針介紹細(xì)胞活性探針細(xì)胞器探針細(xì)胞骨架探針核酸探針細(xì)胞內(nèi)離子探針細(xì)胞活性探針活細(xì)胞探針：吖叮橙（AO）是一種離子泵活性指示劑，弱堿性，在動(dòng)物細(xì)胞溶酶體、植物液泡和含胰島素的分泌小粒等酸性細(xì)胞器中濃集。死細(xì)胞探針：碘化丙錠（PI）膜不透性DNA探針，細(xì)胞膜破損后與DNA結(jié)合核酸探針Hoechst 與DNA結(jié)合，分辨率高 Hoechst 33258 Hoechst 33342 毒性低 先進(jìn)行免疫染色再進(jìn)行Hoechst染色DAPI 與雙鏈DNA結(jié)合熒光增強(qiáng)20倍，與單鏈D