課程：人染色體核型分析

1、課程任務(wù)：了解細(xì)胞培養(yǎng)及增殖方式。掌握人染色體核型分析方法，運(yùn)用該方法分析不同生物染色體核型， 根據(jù)人染色 體核型分析結(jié)果，判斷生物性別、表型或綜合癥。課程涉及內(nèi)容：.細(xì)胞培養(yǎng)講解及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)展示，觀察各個(gè)培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)胞，時(shí)長 1h.細(xì)胞增殖方式講解。時(shí)長0.5h.染色體形態(tài)及染色體異常致病講解（細(xì)胞有絲分裂中期）：0.5h.實(shí)操：人染色體核型分析實(shí)驗(yàn)1.5h.設(shè)計(jì)：生物核型分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.5h.評(píng)價(jià)體系：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的“作品展示”及“研究報(bào)告”的完成情況0.5h第一部分：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（簡(jiǎn)要介紹動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)） 一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞分類：原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞。概念：原代細(xì)胞是指從機(jī)

2、體中取出來后立即培養(yǎng)的細(xì)胞， 進(jìn)行傳代（什么是傳代） 培養(yǎng)后的細(xì)胞即為傳代細(xì)胞。培養(yǎng)原則：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需從原代細(xì)胞培養(yǎng)開始。選材：易于培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞包括：幼年動(dòng)物的腎、肺、卵巢、精巢、肌肉及月中瘤 等組織。較難培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞：神經(jīng)細(xì)胞等。培養(yǎng)技術(shù)（此處簡(jiǎn)要描述如下，可根據(jù)具體的時(shí)間要求講解）：?jiǎn)螌蛹?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：首先取出健康動(dòng)物的組織塊，用濃度與活性適中的胰酶或膠 原酶與EDTA（螯合劑）等將細(xì)胞聯(lián)接處消化分散，給予良好的營養(yǎng)液與無菌的 培養(yǎng)環(huán)境（接近體溫與體內(nèi)的 PH ,在培養(yǎng)中進(jìn)行靜止或慢速轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)。但無 論用何種培養(yǎng)液一般都要加一定量的小牛（或胎牛）血清，這樣細(xì)胞才能很好地 貼壁生長和分裂

3、。分散的細(xì)胞懸液在培養(yǎng)瓶中很快（在幾十分鐘或數(shù)小時(shí)內(nèi)）就 貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。分散呈圓球形的細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展并開始 有絲分裂，逐步形成致密的細(xì)胞單層，稱為單層細(xì)胞。原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳代 到十代左右就不易繼續(xù)傳下去了， 細(xì)胞生長出現(xiàn)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，但 有極少數(shù)細(xì)胞可能度過“危機(jī)”而傳下去。這些存活的細(xì)胞一般又可順利的傳 40-50代次，并且仍然保持原有染色體的二倍體數(shù)量及接觸抑制的行為，這種細(xì) 胞被稱作為“細(xì)胞系”。一般情況下（胚胎干細(xì)胞等除外），當(dāng)細(xì)胞傳至50代以后又要出現(xiàn)“危機(jī)”，難以再傳下去，這種傳代次數(shù)有限的體外培養(yǎng)細(xì)胞通常 稱為“有限細(xì)胞系”；但在傳代過程中如

4、有部分細(xì)胞發(fā)生了遺傳突變，并使其帶 有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，有可能在培養(yǎng)條件下無限制的培養(yǎng)傳代下去，這種傳代細(xì)胞稱為“永生細(xì)胞系或連續(xù)細(xì)胞系”，該細(xì)胞系細(xì)胞的根本特點(diǎn)是：染色體明顯改變， 一般呈亞二倍體或非整倍體，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。（根據(jù)具體時(shí)間安排，需具體補(bǔ)充：簡(jiǎn)要舉例說明CHC胞系、HeLa細(xì)胞系、BHK21細(xì)胞系等常用 連續(xù)細(xì)胞系在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究工作）細(xì)胞克隆技術(shù)：用單細(xì)胞克隆培養(yǎng)或通過藥物篩選的方法從某一細(xì)胞系中分離出 單個(gè)細(xì)胞，并由此增殖形成的，具有基本相同的遺傳性狀的細(xì)胞群體稱之為“細(xì)胞克隆”，經(jīng)過生物學(xué)鑒定，如具有特殊的遺傳標(biāo)記或性質(zhì)，這樣的細(xì)胞系可稱 為“細(xì)胞株”。體外培

5、養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)：體外培養(yǎng)的細(xì)胞，無論是原代細(xì)胞還是傳代細(xì)胞， 一般不能 保持體內(nèi)原有的細(xì)胞形態(tài)，但大體可分為兩種基本形態(tài)：成纖維樣細(xì)胞與上皮樣 細(xì)胞，此外還有一些可活動(dòng)的游走細(xì)胞。懸浮培養(yǎng)技術(shù)：最后簡(jiǎn)要介紹我公司目前從事的干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、類別及其對(duì)于再生醫(yī)學(xué)研究工作的意義（需具體補(bǔ)充）。二、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)展示、操作及各個(gè)培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)胞形態(tài)觀察：要求實(shí)驗(yàn)室長期制 備保存不同培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)胞，方便同學(xué)們可以更形象的觀察到細(xì)胞生長的不同狀 態(tài)：細(xì)胞系、細(xì)胞衰老、永生細(xì)胞系、細(xì)胞株等等。第二部分：細(xì)胞增殖方式（開始此部分之前有一個(gè)過渡的用講）細(xì)胞周期包括：核分裂（有絲分裂）及胞質(zhì)分裂，使已經(jīng)復(fù)制好的染色體DNA

6、平均分配到2個(gè)子細(xì)胞中，完成細(xì)胞增殖，這包括兩個(gè)階段：分裂間期及分裂期。分裂間期：DNA的復(fù)制及有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，中心體加倍。結(jié)果：每條染色質(zhì)都形成兩條姐妹染色單體，呈細(xì)長、彌漫狀線性分布，分裂時(shí)長占整個(gè)分裂周期的90-95%,時(shí)間較長，位于分裂期前發(fā)生。根據(jù)細(xì)胞分裂期核膜、染色體、紡錘體裝配及核仁等形態(tài)結(jié)構(gòu)的規(guī)律性變化，有絲分裂又被人為的劃分為：前期、中期、后期和末期，于光學(xué)顯微鏡下可觀察到各期細(xì)胞核內(nèi)變化。前期：出現(xiàn)紡錘體及染色體，同時(shí)伴隨著核膜及核仁的消失，染色體散亂地分布 在細(xì)胞的中心位置。中期：所有染色體的著絲點(diǎn)都排列在赤道板上， 此時(shí)染色體的形態(tài)和數(shù)目最清晰 （是進(jìn)行染色體觀察合計(jì)

7、數(shù)的最佳時(shí)期）。后期：著絲點(diǎn)一分為二，姐妹染色單體分開，染色體數(shù)目加倍。末期：染色體變成染色質(zhì)，紡錘體消失，核膜及核仁重現(xiàn)，細(xì)胞膜從中間向內(nèi)凹陷，分裂成兩個(gè)細(xì)胞。綜上可知，當(dāng)細(xì)胞處于有絲分裂中期時(shí)，染色體形態(tài)易于觀察，適用于做核型分析實(shí)驗(yàn)。第三部分：染色體形態(tài)及染色體異常致病講解一、染色體概念：染色體是細(xì)胞在進(jìn)行有絲分裂時(shí)期遺傳物質(zhì)特定的存在形式，是間期細(xì)胞染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密組裝的結(jié)果。不同生物的細(xì)胞含有不同數(shù)目的染色體，所有單被染色體組包含的 DNAS成該生物的基因組。二、染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)細(xì)胞有絲分裂的中期，染色體具有比較穩(wěn)定的形態(tài)，又兩條相同的姐妹染色單體 構(gòu)成，彼此以著絲粒相連?？筛鶕?jù)著絲粒

8、在染色體上所處的位置， 將中期染色體 分為四種類型：11-7根據(jù)著絲粒位置進(jìn)行的染色體分類絲敕位染色體符號(hào)著絲粒比.著絲粒指數(shù)”中著地粒mLOOTSQ 500-0.375亞中若絲粒sm1 68-3.000.3730.250亞端著絲粒st3.01-7 000 249-0.125耀著絲粒t7,01 - 0.125-0.000*長鞫長度Z短臂長度；“短臂長度/染色體怠長度口 ILevan 等，1964 . Green等. 1980)中著絲粒染色體，兩臂長度相等或大致相等;亞中著絲粒染色體；亞端著絲粒染色體，具有微小短臂； 端著絲粒染色體;染色單體中苕?zhèn)嗔喼腥艮D(zhuǎn)W后端著絲粉端若州制 阪色體 染色體

9、染色體 染色體 1124根據(jù)算短歸位置進(jìn)行的染色體分美國示主縊痕：染色單體被著絲粒分為長臂及短臂， 中間著絲粒區(qū)淺染內(nèi)縊，也被稱之 為王縊痕。次縊痕：染色體上其他的淺染縊縮部位成為次縊痕，它的數(shù)目、位置、大小是某些染色體所特有的形態(tài)特征，因此也可作為鑒定染色體的標(biāo)記。核仁組織區(qū)：位于染色體的次縊痕部位，但并非所有次縊痕部位都是核仁組織區(qū)，是rRNA基因(5S rRNQ所在部位，與間期細(xì)胞核仁形成有關(guān)。隨體：位于染色體末端的球性染色體節(jié)段，通過次縊痕區(qū)與染色體主體部分相連。是識(shí)別染色體形態(tài)的重要特征之一，有隨體的染色體稱之為sat染色體。端粒：染色體兩個(gè)端部特化結(jié)構(gòu)。一個(gè)基因組內(nèi)的所有端粒都是由

10、相同的重復(fù)序 列組成。其生物學(xué)作用在于維持染色體的完整性和獨(dú)立性，可能還與染色體在核 內(nèi)的空間排布有關(guān)。染色體核型：核型是指染色體組在有絲分裂中期的表型， 是染色體數(shù)目、大小、形態(tài)特征的總 和，核型分析是在對(duì)染色體組測(cè)量計(jì)算的基礎(chǔ)上，進(jìn)行分組、排隊(duì)、配對(duì)并進(jìn)行 形態(tài)分析的過程。對(duì)于探討人類遺傳病的機(jī)制（染色體疾?。?、物種親緣關(guān)系、 遠(yuǎn)緣雜種的鑒定都有重要意義。將一個(gè)染色體組的全部染色體逐個(gè)按其特征繪制 下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖像稱為核型模式圖，它代表該物種的核型模式。常見染色體疾病普及：常染色體病：由于122號(hào)常染色體發(fā)生畸變引起的疾病，可分為單體綜合征、 三體綜合征、部分單體綜

11、合征和部分三體綜合征4類。其中以三體綜合征和部分三體綜合征較為多見。三體綜合征：某一號(hào)同源染色體的數(shù)目不是正常的2個(gè)而是3個(gè)，即細(xì)胞的染色體總數(shù)為47的染色體病。染色體疾病常見的三體綜合征有21三體（唐氏綜合征DownSyndrome） 18三體（愛德 華氏綜合征EdwardsSyndrome并口 13三體（帕陶氏綜合征 PatauSyndrome）,其 中以21三體綜合征最常見。根據(jù)染色體核型分析可有效地識(shí)別此類疾病。第四部分：實(shí)操：人染色體核型分析實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)和掌握核型分析的方法，運(yùn)用該方法分析不同生物染色體核型， 根據(jù)人染色體核型分析結(jié)果，判斷生物性別、表型或綜合癥。實(shí)驗(yàn)原理：核型

12、亦稱染色體組型，是指體細(xì)胞有絲分裂中期細(xì)胞核（或染色體組）的表型。每 一個(gè)體細(xì)胞含有兩組同樣的染色體，用2n表示。其中與性別直接有關(guān)的染色體， 即性染色體，可以不成對(duì)。每一個(gè)配子帶有一組染色體，叫做單倍體，用n表示。 兩性配子結(jié)合后，具有兩組染色體，成為二倍體的體細(xì)胞。如蠶豆的體細(xì)胞2n=12,它的配子n=6;玉米的體細(xì)胞2n=20,配子n=10;人類體細(xì)胞2n=46,配 子 n=23o染色體在復(fù)制以后，縱向并列的兩個(gè)染色單體，通過著絲粒聯(lián)結(jié)在一起。著絲粒 在染色體上的位置是固定的。由于著絲粒位置的不同，染色體可分成相等或不相 等的兩臂，造成中著絲粒染色體，亞中著絲粒染色體、亞端著絲粒染色體和

13、端著 絲粒染色體等形態(tài)不同的染色體。止匕外，有的染色體還含有隨體或次縊痕。所有 這些染色體的特異性構(gòu)成一個(gè)物種的染色體組型。染色體核型分析是細(xì)胞遺傳 學(xué)、染色體工程、現(xiàn)代分類學(xué)和進(jìn)化理論的重要研究手段， 也是一種簡(jiǎn)便的方法。 實(shí)驗(yàn)材料：人類染色體非顯帶標(biāo)本或人類染色體顯帶標(biāo)本或10個(gè)分裂中期細(xì)胞的染色體永久裝片及照片、游標(biāo)卡尺、直尺、剪刀、鑲子、計(jì)算器、座標(biāo)紙、繪 圖紙、膠水等五、實(shí)驗(yàn)方法和步驟染色體制片（略，制備時(shí)間過長，實(shí)驗(yàn)室需求較高，操作易失?。ㄒ唬y(cè)量若用染色體制片標(biāo)本進(jìn)行直接測(cè)量時(shí)，必須利用顯微鏡與測(cè)微尺，事 先要用臺(tái)微尺對(duì)目微尺的單位長度進(jìn)行標(biāo)定后再進(jìn)行工作，僅對(duì)染色體長度較大的

14、標(biāo)本適合。一般標(biāo)本還是先行拍照放大后進(jìn)行測(cè)量，可得較好數(shù)據(jù)。首先目測(cè)照片上每條染色體長度，按長短順序初步編號(hào)，寫在每條染色體短臂的一端， 同時(shí)確定主縊痕的位置，用游標(biāo)卡尺逐條測(cè)量短臂和長臂長度。根據(jù)測(cè)量的數(shù)據(jù)， 計(jì)算染色體的相對(duì)長度，臂比及著絲粒指數(shù)。相對(duì)長度=（每個(gè)染色體的長度/全部染色體長度）x 100著絲粒比值=長臂長度/短臂長度著絲粒指數(shù)=短臂長度/該染色體長度說明：以上公式每一項(xiàng)所代入的數(shù)據(jù)，均為求出 5個(gè)或10個(gè)細(xì)胞同源染色體的 短臂長度、長臂長度和全長的平均值（即5個(gè)或10個(gè)細(xì)胞中編號(hào)相同的染色體各 項(xiàng)長度分別相加后以5或10除之）。著絲點(diǎn)位置按臂比值確定：著絲粒比值著絲點(diǎn)位置簡(jiǎn)

15、寫1.001.01 -1.701.71 -3.003.01 -7.007.01以上OO正中部著絲點(diǎn)中部著絲點(diǎn)區(qū)近中部著絲點(diǎn)區(qū)近端部著絲點(diǎn)區(qū)端部著絲點(diǎn)區(qū)端部著絲點(diǎn)M m sm st t T（二）配對(duì) 根據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)，即染色體相對(duì)長度、臂比、著絲粒指數(shù)、次縊痕的有 無及位置，隨體的形狀和大小等進(jìn)行同源染色體的剪貼配對(duì)。（三）染色體排列 按染色體由長到短同源染色體重新編號(hào)，由左向右順序貼在紙 上。著絲點(diǎn)排列在同一水平線上，短臂在上，長臂在下。如有超數(shù)染色體、性染 色體，則排在最后，完成上述步驟的染色體剪貼后，再附一張同一照片的中期分 裂相，即成為染色體核型圖。（四）繪制核型模式圖及核型分析表1 .核型模式圖 用繪圖紙和座標(biāo)紙繪制。座標(biāo)紙放在繪圖紙下作為標(biāo)記，橫座標(biāo) 為染色體序號(hào)，縱座標(biāo)為染色體的相對(duì)長度。繪染色體時(shí)，長臂在下，