基因克隆質(zhì)粒載體

1、關(guān)于基因克隆的質(zhì)粒載體第一張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、基因工程四大要素：目的基因克隆載體工具酶受體系統(tǒng)第二張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 單獨(dú)的基因不易進(jìn)入細(xì)胞 進(jìn)入后不能維持.三、什么是克隆載體？vector通過不同途徑能將承載的外源DNA片段帶入受體細(xì)胞，并在其中得以維持的DNA分子稱為DNA克隆載體或基因克隆載體。二、為什么要用克隆載體？第三張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月載體具有如下功能:1.運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3.為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件 第四張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022

2、年6月四、作為克隆載體的DNA分子必須具備主要條件：1.有1至多個(gè)克隆位點(diǎn)，供外源DNA片段組入克隆載體DNA分子。2.能自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3.必須具有用于選擇克隆子的標(biāo)記基因。4.必須是安全的。第五張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月五、克隆載體的種類根據(jù)來源可分為： 質(zhì)粒載體 病毒或噬菌體載體 質(zhì)粒DNA與病毒或噬菌體DNA組成的克隆載體 質(zhì)粒DNA與染色體DNA片段組成的克隆載體等第六張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第七張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第九

3、張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)用途可分為： 表達(dá)克隆載體 啟動(dòng)子探針型載體 cDNA克隆載體等根據(jù)應(yīng)用對(duì)象可分為： 原核生物克隆載體、植物克隆載體和動(dòng)物克隆載體等。第十一張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)其復(fù)制或存在方式可分為:自主復(fù)制型載體和附加載體 第十二張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四章 基因克隆的質(zhì)粒載體第十三張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨(dú)立于染色體的自主復(fù)制的遺傳成份.Plasmid一詞由Joshua Lederberg于1952年提出。

4、質(zhì)粒的命名:例:pBR322一、與構(gòu)建克隆載體相關(guān)的質(zhì)粒性質(zhì)p代表質(zhì)粒;“BR”代表兩位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首,“322”是實(shí)驗(yàn)編號(hào) .第十四張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月已在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)質(zhì)粒的宿主范圍較窄，只能生存于親緣關(guān)系很近的少數(shù)細(xì)菌種類中。是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。已進(jìn)化出多種機(jī)制以維持其在細(xì)菌宿主中的穩(wěn)定的拷貝并將質(zhì)粒分子精確地分配給子代細(xì)胞。1. 質(zhì)粒的特點(diǎn)：第十五張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄或多或少依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)。常常含有一些編碼對(duì)細(xì)菌宿主有利的基

5、因。 這些基因可賦予宿主迥然不同的特征，其中不少具有重要的醫(yī)學(xué)和商業(yè)價(jià)值。由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括產(chǎn)生抗生素、大腸桿菌素、腸毒素、限制酶與修飾酶，以及降解復(fù)雜的有機(jī)化合物等。第十六張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒通過合成長(zhǎng)效致死物和短效解毒劑得以在細(xì)菌中生存.第十七張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒絕大多數(shù)是環(huán)形雙鏈的DNA但也存在有線形質(zhì)粒 、RNA質(zhì)粒（酵母的殺傷質(zhì)粒）2.質(zhì)粒的生物學(xué)特征只能在在寄主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立增殖，隨寄主分裂而遺傳。自然界中，無論是真核生物還是原核生物細(xì)胞，甚至真菌的線粒體中都發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的存在。質(zhì)粒DNA分子可以穩(wěn)定存在于染色體外，呈游離狀態(tài)

6、,有一些質(zhì)粒在一定條件下能可逆地整合到寄主染色體上，隨染色體的復(fù)制而復(fù)制,稱為附加體。第十八張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十九張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3.環(huán)形雙鏈DNA質(zhì)粒分子組成與構(gòu)型多數(shù)為雙鏈環(huán)狀DNA分子. 分子量從不足2kb到100kb以上,多數(shù)為10kb左右.具有三種不同的構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)形DNA(cccDNA):兩條多核苷酸鏈均保持完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)。DNA呈超螺旋的SC構(gòu)型。開環(huán)DNA(ocDNA)：有一條保持完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個(gè)缺口。即OC構(gòu)型。線性分子（lDNA)：經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割之后，雙鏈斷裂而形成。稱L構(gòu)型。第二十張

7、，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以雙螺旋的形式圍繞著同一軸纏繞的，當(dāng)雙螺 旋DNA的這個(gè)軸再?gòu)澢p繞時(shí)，DNA就處于超螺旋狀態(tài)， DNA超螺旋狀態(tài)是結(jié)構(gòu)張力的表現(xiàn)。超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu) 的一個(gè)重要特征。 正超螺旋(positive supercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同 負(fù)超螺旋(negative supercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反 第二十一張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十二張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4. 作為克隆載體質(zhì)粒的條件適于作為基因克

8、隆載體的所有質(zhì)粒DNA分子，都必須包括三種共同的組分：復(fù)制子選擇性標(biāo)記基因克隆位點(diǎn)基因克隆載體還需要滿足具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)第二十三張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)分子特性，革蘭氏陰性細(xì)菌的質(zhì)?？煞譃閮煞N接合型 又叫自主轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒具有自主復(fù)制所必須的遺傳信息之外，還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因?？梢栽诓煌?xì)胞間轉(zhuǎn)移。非接合型的質(zhì)粒 不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，失去控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。不能自主轉(zhuǎn)移。5、 質(zhì)粒的類型第二十四張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月F質(zhì)粒的tra區(qū)包含細(xì)菌接合所需的基因第二十五張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于202

9、2年6月第二十六張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移與遷移.轉(zhuǎn)移一般指一個(gè)質(zhì)粒獨(dú)立地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞.遷移則指本身不能轉(zhuǎn)移,在另一個(gè)接合型質(zhì)粒存在下,從一個(gè)細(xì)胞移至另一種細(xì)胞.質(zhì)粒遷移的條件（自身編碼）bom位點(diǎn)(col E1) nic 位點(diǎn).mob基因.結(jié)合動(dòng)員基因.編碼遷移蛋白,實(shí)質(zhì)是一種核酸酶,切割nic位點(diǎn).遷移作用(mobiligation):由共存接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的遷移過程.第二十七張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十八張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月從基因工程安全角度考慮，接合型質(zhì)粒不宜作為克隆載體。因?yàn)閺睦?/p>

10、論上存在著發(fā)生使跨越生物種間遺傳屏障的潛在危險(xiǎn).而利用遷移作用可能將非接合型質(zhì)粒從一種細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一種細(xì)胞,這種方法叫三親雜交法. 一般將受體菌、供體菌及輔助轉(zhuǎn)移菌 三者共培養(yǎng)過夜.在基因工程中得到大量的應(yīng)用.第二十九張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三親雜交法第三十張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)質(zhì)粒的性狀特征，可分為五種不同的類型：F(Fertility)質(zhì)粒: (Resistance)質(zhì)粒Col質(zhì)粒降解質(zhì)粒（Degradative plasmids）致瘤質(zhì)粒（Virulence plasmids）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒第三十一張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022

11、年6月根據(jù)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移功能分類第三十二張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)質(zhì)粒的表現(xiàn)分為:定義：質(zhì)粒除了與控制本身復(fù)制和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因外，有的質(zhì)粒還攜帶一些其他的基因，宿主細(xì)胞由于含有這樣的質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，這樣的質(zhì)粒稱為顯性質(zhì)粒。相反，即使宿主細(xì)胞含有某種質(zhì)粒，但無異樣性狀表露，這樣的質(zhì)粒稱為隱蔽質(zhì)粒。受檢測(cè)手段的限制，現(xiàn)定為隱蔽型的質(zhì)粒未必是真正的隱蔽質(zhì)粒。顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒第三十三張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為: (1) 多拷貝質(zhì)粒 (2) 測(cè)序質(zhì)粒 (3) 整合質(zhì)粒 (4) 穿梭質(zhì)粒 (5) 表達(dá)質(zhì)粒 (6) 探針質(zhì)粒第

12、三十四張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒的復(fù)制子決定其拷貝數(shù)。復(fù)制子是一個(gè)遺傳單位，包括DNA復(fù)制起點(diǎn),相關(guān)的調(diào)控元件,復(fù)制終點(diǎn)。6、質(zhì)粒的復(fù)制復(fù)制起點(diǎn)是一段特定的DNA片段，長(zhǎng)約幾百堿基對(duì)，其相關(guān)的順式作用調(diào)控元件中含有參與DNA合成起始的由質(zhì)?；蛩拗骶幋a的可擴(kuò)散因子的結(jié)合位點(diǎn)。定義：質(zhì)粒DNA中能自主復(fù)制并維持正常拷貝數(shù)的一段最小的核酸序列單位。第三十五張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 與一個(gè)起始點(diǎn)相連而沒有被終點(diǎn)隔斷的任何序列,都是作為復(fù)制子的一部分而被復(fù)制. 起始點(diǎn)是一種順式作用位點(diǎn),只能作用于該位點(diǎn)所在的DNA分子.第三十六張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作

13、于2022年6月質(zhì)粒的拷貝數(shù)定義:(1) 通常定義:生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下(LB培養(yǎng)基)每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中平均所含有的質(zhì)粒的拷貝數(shù).(2) 特殊定義:在營(yíng)養(yǎng)富有余的培養(yǎng)基中,每個(gè)細(xì)胞當(dāng)中每條染色體所擁有的平均質(zhì)粒DNA分子數(shù).(3) 中定義:在LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的每個(gè)細(xì)胞,如果具有20個(gè)及以上的質(zhì)粒DNA分子,就叫高拷貝質(zhì)粒,如果低于20個(gè)則叫低拷貝質(zhì)粒.第三十七張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 質(zhì)粒就其復(fù)制方式而言分為兩類： 嚴(yán)緊型（stringent plasmid)每個(gè)寄主細(xì)胞中僅有份的拷貝。 松弛型（relaxed plasmid) 每個(gè)寄主細(xì)胞中僅有份的拷貝。 一般接合型的

14、質(zhì)粒是嚴(yán)緊型，具有較高的分子量。而非接合型的質(zhì)粒是松馳型的，具有較低的分子量。例外，接合型的質(zhì)粒6K分子量較小，為松馳型。 質(zhì)粒中已鑒定的復(fù)制子已逾30個(gè)，但分子克隆中常用的幾乎都帶有一個(gè)來源于pMB1的復(fù)制子，可使每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中維持個(gè)拷貝。第三十八張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月即同一種質(zhì)粒在不同的寄主類型中可能屬于嚴(yán)緊型的，也可能屬于松馳型的。如ColE1-K30在大腸桿菌中屬于松弛型的,在奇異變形桿菌中是嚴(yán)緊型的。質(zhì)?？截悢?shù)還與寄主狀況有關(guān)。第三十九張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月氯霉素?cái)U(kuò)增: pMB1或ColEI類質(zhì)粒復(fù)制子的復(fù)制完全依靠宿主細(xì)胞提供的半衰期

15、較長(zhǎng)的復(fù)制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的產(chǎn)物），因此在蛋白質(zhì)合成中斷時(shí)，質(zhì)粒復(fù)制能持續(xù)合成，這樣當(dāng)用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制時(shí)，帶有pMB1或ColEI復(fù)制子的質(zhì)粒將利用豐富的原料大量復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞可以積聚2000-3000個(gè)拷貝，這叫做氯霉素?cái)U(kuò)增。第四十張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 另外兩種質(zhì)粒（psc101和p15A）的復(fù)制子的復(fù)制受質(zhì)粒上編碼的蛋白因子的正調(diào)節(jié)。氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成后，這類質(zhì)粒便不能持續(xù)復(fù)制。 第四十一張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒復(fù)制控制的分子模型抑

16、制蛋白稀釋模型阻遏蛋白在低濃度時(shí)處于單體狀體，高濃度時(shí)處于多體狀態(tài)。只有多體狀態(tài)具有活性自體阻遏蛋白質(zhì)模型阻遏蛋白具有自體阻遏活性。第四十二張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四十三張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四十四張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月7、質(zhì)粒的不相容性(不親和性)指在沒有選擇壓力下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠共存于同一個(gè)寄主細(xì)胞系中的現(xiàn)象。只有當(dāng)兩種質(zhì)粒在同一寄主細(xì)胞中都不受限制時(shí)，才能判斷。親緣關(guān)系較近的質(zhì)粒，彼此之間互不相容，它們屬于同一種不親和群。 大腸桿菌質(zhì)粒中至少已鑒別出種以上的不親和群。第四十五張，PPT共一百二十

17、一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 質(zhì)粒不相容性現(xiàn)象與質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分離的調(diào)控有關(guān)。 攜帶相同復(fù)制子的不同質(zhì)粒屬于同一不相容組。帶有不可互換成分的復(fù)制子的質(zhì)粒則屬于不同的不相容組。 大多數(shù)質(zhì)粒都會(huì)產(chǎn)生出一種控制質(zhì)粒復(fù)制的阻遏蛋白質(zhì)，其濃度與質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比。 阻遏蛋白通過同其靶序列間的相互作用，使雙鏈中的一條斷裂從而導(dǎo)致質(zhì)粒復(fù)制的啟動(dòng)。并建立起一種調(diào)節(jié)質(zhì)粒拷貝數(shù)的負(fù)反饋環(huán)。當(dāng)質(zhì)粒面臨高拷貝數(shù)和高濃度的阻遏蛋白時(shí)，其復(fù)制活動(dòng)便被抑制了。反之，復(fù)制反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。第四十六張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四十七張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月8.質(zhì)粒的分離與純化(1)氯化銫密度

18、梯度離心法(2)堿變性法(3)微量堿變性法第四十八張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月氯化銫密度梯度離心法1、質(zhì)粒DNA占總DNA的1%2%；2、在細(xì)胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細(xì)菌染色體易斷裂成線性片段，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)；3、染色劑溴化乙錠（EB）能摻入到DNA鏈的堿基中，導(dǎo)致鏈的解旋；而且形成的EB- DNA復(fù)合物中，EB含量越高，密度會(huì)越低。第四十九張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流程： 首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDS）來促進(jìn)大腸桿菌的細(xì)胞裂解。 將溴化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中，EB會(huì)嵌入到DNA鏈的

19、堿基中去。 在EB達(dá)到飽和時(shí)，進(jìn)行氯化銫密度梯度離心。 第五十張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五十一張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第五十二張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月堿變性法： 根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片段之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。 在PH值12.012.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會(huì)被變性。 通過冷卻或恢復(fù)中性PH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速?gòu)?fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA第五十三張，PPT

20、共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流程：1、取1.5毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀；2、加入100微升冰冷的液，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA，45mg溶菌酶）靜置5分鐘；3、加入200微升微冷的液（0.2NaOH，1.0%SDS）緩緩混勻置室溫5分鐘。 65度水浴一段時(shí)間會(huì)加強(qiáng)染色體DNA的變性作用。4、加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸鈉，振蕩后，冰浴5分鐘。5、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNA。第五十四張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素

21、： 1、寄主菌株的遺傳背景 使用endA基因發(fā)生突變的菌株，編碼核酸內(nèi)切酶從野生型的菌株中提取質(zhì)粒須采取的措施： 選擇最適的培養(yǎng)條件，以限制在細(xì)胞生長(zhǎng)期間，體內(nèi)核酸內(nèi)切酶 的表達(dá)； 在純化質(zhì)粒DNA的過程中，用加熱法核酸內(nèi)切酶使失活； 采用最佳的實(shí)驗(yàn)流程，減少核酸內(nèi)切酶的污染并在純化了質(zhì)粒DNA之后，迅速除去污染的核酸酶。第五十五張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2、質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分子的大小 插入分子量大的外源DNA會(huì)引起質(zhì)粒拷貝數(shù)的下降。第五十六張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略 一般條件：選擇適合手頭工作目標(biāo)的質(zhì)粒載體選擇載體上的限制

22、性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)用合適的連接反應(yīng)條件選用最適合擴(kuò)增外源目的的質(zhì)粒的大腸桿菌菌株具備篩選轉(zhuǎn)化子的方法和驗(yàn)證目的基因克隆的技術(shù)有時(shí)需要特殊的步驟以降低轉(zhuǎn)化菌落的背景在每一階段都需要設(shè)置陰性及陽(yáng)性對(duì)照第五十七張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略：()質(zhì)粒載體應(yīng)該能在轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中進(jìn)行有效的復(fù)制。作為質(zhì)粒的克隆載體，希望在受體細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)。所以含有能在受體細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制的質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)（ori)，最好是松弛型質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。() 必須含有允許外源DNA片段克隆的位點(diǎn)，且這樣的克隆位點(diǎn)盡可能多。 為了便于多種類型末端的DNA片段的克隆，質(zhì)?？寺≥d體中往

23、往組裝一個(gè)含多種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的多克隆位點(diǎn)(MCS)連桿。第五十八張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月()必須含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因。(4)質(zhì)粒載體本身DNA分子應(yīng)盡可能小。()根據(jù)需要，使構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體中組裝各種元件，構(gòu)建成不同用途的質(zhì)?？寺≥d體。 如在克隆位點(diǎn)上游組裝強(qiáng)的啟動(dòng)子，下游組裝相應(yīng)的終止子，就成為強(qiáng)表達(dá)質(zhì)粒克隆載體?；蛘咴谫|(zhì)?？寺≥d體的合適位置組入受體細(xì)胞染色體DNA的同源序列，成為基因整合平臺(tái)系統(tǒng)的供體質(zhì)?？寺≥d體。第五十九張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)?？寺≥d體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建過程應(yīng)遵循的原則：()選用合適的出發(fā)質(zhì)粒。()正確獲得構(gòu)建

24、質(zhì)粒克隆載體的元件。()組裝合適的選擇標(biāo)記基因。()選用合適的啟動(dòng)子。()在能達(dá)到預(yù)期目的前提下，構(gòu)建過程應(yīng)力求簡(jiǎn)單。第六十張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（三）、質(zhì)粒載體的構(gòu)建與類型 1. 天然質(zhì)粒：沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo) 的體外修飾改造的質(zhì)粒。 在大腸桿菌中，常見的可用于基因克隆的天然質(zhì)粒有EolE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。 第六十一張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，它含有一個(gè)EcoR酶切位點(diǎn)，一個(gè)四環(huán)素抗性選擇記號(hào)（Tetr ），插入外源片段后不影響其復(fù)制功能，但該質(zhì)粒分子量較大，拷貝數(shù)

25、低只具有抗菌素抗性基因，無法使用插入失活技術(shù)選擇重組分子。第六十二張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 ColE1質(zhì)粒在其唯一的單切割位點(diǎn)EcoRl中克隆外源DNA片段后，可根據(jù)對(duì)大腸桿菌素E1的免疫性選擇轉(zhuǎn)化子，不能合成大腸桿菌素E1的菌落是具有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。但對(duì)大腸桿菌素E1的免疫篩選，在化學(xué)上是相當(dāng)麻煩的。第六十三張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.理想的質(zhì)粒載體必須具備的基本條件 (1) 具有復(fù)制起點(diǎn) 自我增殖的基本條件，一般具一個(gè)復(fù)制子。 (2) 具有抗菌素抗性 理想的質(zhì)粒載體具有兩種抗菌素抗性基因。 (3) 具有若干限制酶切單一位點(diǎn)（MCS） (4) 具

26、有較小的分子量和較高的拷貝數(shù) 低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片段后仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞，同時(shí)低分子量的質(zhì)粒對(duì)限制酶具有多重識(shí)別位點(diǎn)的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)，可獲得大量的克隆基因。第六十四張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月以Ampr和Tetr為選擇性標(biāo)記，克隆位點(diǎn)在這兩個(gè)選擇性標(biāo)記的單酶切位點(diǎn)上。選擇AmprTets或AmpsTetr的重組子。（4363bp）第六十五張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 3.質(zhì)粒載體的選擇記號(hào) 新陳代謝特性； 對(duì)大腸桿菌素E1的免疫性； 抗菌素抗性； 四環(huán)素抗性、氨芐青霉素抗性、 鏈霉素抗性、卡那霉素抗性 大多數(shù)質(zhì)粒本身帶有抗菌素基

27、因； 抗菌素抗性記號(hào)便于操作、易于選擇。第六十六張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記第六十七張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4.不同類型的質(zhì)粒載體（1）高拷貝的質(zhì)粒載體 克隆的目的是為分離大量的高純度的克隆基因（2）低拷貝的質(zhì)粒載體 有些克隆的編碼基因，其產(chǎn)物含量過高會(huì)嚴(yán)重的干擾寄主細(xì)胞的正常新陳代謝活動(dòng)。 編碼表面結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一些基因、調(diào)節(jié)細(xì)胞基礎(chǔ)代謝活動(dòng)的蛋白質(zhì)編碼基因以及囊纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因等。第六十八張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 (3)失控的質(zhì)粒載體 復(fù)制控制是溫度敏感型的低拷貝的質(zhì)粒。Example： pB

28、EU1和pBEU2質(zhì)粒，在30度下，每個(gè)寄主細(xì)胞只含有適量的拷貝數(shù)，當(dāng)培養(yǎng)溫度超過35度時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制將失去控制，每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)便持續(xù)上升。在這種高溫環(huán)境下，細(xì)胞的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)的合成可按正常的速率持續(xù)23小時(shí)。最后得到超量的基因編碼產(chǎn)物，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制失去存活能力，積累的質(zhì)粒DNA占細(xì)胞總DNA的50%。第六十九張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 (4)插入失活型質(zhì)粒載體 將外源DNA片段插入在質(zhì)粒上會(huì)導(dǎo)致選擇記號(hào)基因失活的位點(diǎn)，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度的提高獲得陽(yáng)性克隆的機(jī)會(huì)。Example： 在pBR329質(zhì)粒載體的EcoR1位點(diǎn)插入外源片段，會(huì)使氯霉素抗性基因

29、失活，在篩選的氯霉素敏感的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞群體中，含有插入片段的重組體質(zhì)粒的幾率會(huì)顯著上升。 第七十張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(5)正選擇的質(zhì)粒載體正向選擇：應(yīng)用只有突變體或重組體才能正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇。這種質(zhì)粒載體具有直接選擇記號(hào)并可 賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。 第七十一張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Example： 質(zhì)粒pKN80有來自Mu噬菌體DNA的EcoR1-C的片段，編碼一種致死功能的kil基因。該質(zhì)粒在Mu噬菌體的溶源菌株中正常復(fù)制；在非溶源菌株中是致死的。在Hind 或Hpa 位點(diǎn)插入外源DNA片段后，會(huì)產(chǎn)生具Ampr表型的Mu噬菌體的非溶源

30、的轉(zhuǎn)化子菌株。第七十二張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月正向選擇質(zhì)粒載體的條件限制： 1、需要特殊的寄主菌株或選擇培養(yǎng)基 2、可使用的克隆位點(diǎn)少 3、 假陽(yáng)性水平高 4、不能夠調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)活性第七十三張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 (6)表達(dá)型的質(zhì)粒載體表達(dá)載體： 按特殊設(shè)計(jì)構(gòu)建的，能使克隆在其中特定位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列，在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體。 第七十四張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月主要包括：大腸桿菌的啟動(dòng)子、及操縱位點(diǎn)序列、多克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號(hào)、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)及抗菌素抗性基因。 待表達(dá)的真核基因

31、編碼序列被克隆在緊挨于啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)上，而且必須是其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸末端這一頭靠近啟動(dòng)子方向插入，才能在啟動(dòng)子控制下進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄。第七十五張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第七十六張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 1、pSC101質(zhì)粒載體； 2、ColE 質(zhì)粒載體； 3、pBR322質(zhì)粒載體； 4、pUC質(zhì)粒載體； 5. 其它的重要的質(zhì)粒載體第七十七張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.pSC101質(zhì)粒載體 一種嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制控制的地拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有12個(gè)拷貝；分子量9.09kb，編碼有一個(gè)

32、四環(huán)素抗性基因（tetr ）。有Hind 、EcoR、BamH 、Sal 、Xho 、Pvu、 Sma 7種核酸內(nèi)切限制酶。其中在Hind 、 BamH 、 Sma 3個(gè)位點(diǎn)克隆外源DNA，都會(huì)導(dǎo)致tetr 基因失活。 是第一個(gè)真核生物的克隆載體。第七十八張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第七十九張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）應(yīng)用pSC101質(zhì)粒作基因克隆載體 葡萄球菌質(zhì)粒基因在大腸桿菌中的表達(dá) 金黃色葡萄球菌的質(zhì)粒p1258,編碼若干種能 在大腸桿菌檢測(cè)的結(jié)構(gòu)基因；能被核酸限制酶 EcoR 切割成4段。第八十張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八

33、十一張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）應(yīng)用pSC101質(zhì)粒作基因克隆載體 在大腸桿菌中克隆非洲爪蟾DNA 用核酸內(nèi)切酶EcoR 消化非洲爪蟾的核糖體DNA（ rDNA ），與EcoR 消化的pSC101質(zhì)粒進(jìn)行重組。 在挑取的55個(gè)轉(zhuǎn)化子中，經(jīng) EcoR 酶切，電泳后13個(gè)轉(zhuǎn)化子含有外源片段。轉(zhuǎn)化率23.6第八十二張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八十三張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.ColE 1質(zhì)粒載體 松弛型復(fù)制控制的多拷貝的質(zhì)粒，能產(chǎn)生細(xì)菌素。細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌的正常生命活動(dòng)有抑制作用（復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯能量代謝等）。但含有對(duì)細(xì)菌素的免疫基因

34、。第八十四張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八十五張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 用 ColE 1質(zhì)粒特征為基礎(chǔ)建立的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，存在一定的缺陷性： 1、應(yīng)用大腸桿菌素免疫作為標(biāo)記操作上不方便； 2、在細(xì)菌群體中，能夠以相當(dāng)高的頻率自發(fā)的產(chǎn)生出抗菌素的突變體細(xì)胞。第八十六張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3.pBR322質(zhì)粒載體第八十七張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月pBR322的構(gòu)建： 為改進(jìn)轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，并具有相對(duì)小的分子量、高拷貝數(shù)、外源基因插入不影響質(zhì)粒的復(fù)制功能、多克隆位點(diǎn)（多種限制酶的單一切割位點(diǎn)）、質(zhì)粒的穩(wěn)定性（克服質(zhì)粒的

35、結(jié)合轉(zhuǎn)移能力）。 第八十八張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八十九張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月pBR322的結(jié)構(gòu)來源第九十張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)： 1、具有較小的分子量 它的分子量為4363bp?？寺≥d體的分子量大小不要超過10kb。 2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào) pBR322 DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識(shí)別位點(diǎn)。其中7種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片段可以導(dǎo)致tetr 基因的失活；另外有3種限制

36、酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)。第九十一張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Example:a. 在pBR322質(zhì)粒的BamH或Sal位點(diǎn)插入外源DNA片段，切斷了tetr基因編碼序列的連續(xù)性，使之失去活性，產(chǎn)生出AmprTets表型的重組pBR322質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入AmpsTets的大腸桿菌細(xì)胞。先涂布在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，篩選出具Ampr菌落，再將它們涂布于含四環(huán)素的選擇性培養(yǎng)基上。插入外源片段的重組質(zhì)粒不能在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。第九十二張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月B X BBBXAmproriAmpsTetroriAmprTetroripBR322B

37、ABBTetsX第九十三張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 b.在Pst或Sca識(shí)別位點(diǎn)插入外源片斷會(huì)導(dǎo)致Ampr基因的失活，產(chǎn)生AmpsTetr表型的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌之后，獲得的重組子可以比較快的檢測(cè)出來。其依據(jù)是Ampr表型的細(xì)胞可以合成 內(nèi)酰胺酶，它能使青霉素轉(zhuǎn)變成青霉酮酸，而這種青霉酮酸能與碘結(jié)合。在含有可溶性淀粉和四環(huán)素的富裕培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子，經(jīng)37度培養(yǎng)過夜后，在此平板上加入少量的碘指示劑溶液產(chǎn)生青霉素 內(nèi)酰胺酶Ampr的菌落，其周圍的碘指示劑溶液變得明亮，而Amps菌落無此反應(yīng)。第九十四張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 3、具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過

38、氯霉素?cái)U(kuò)增之后每個(gè)細(xì)胞中可積累10003000個(gè)拷貝。第九十五張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 pBR322質(zhì)粒載體的改良 為了更加實(shí)用，人們對(duì)pBR322質(zhì)粒進(jìn)行了改良，得到許多pBR322質(zhì)粒衍生質(zhì)粒，它們各自具有不同的特點(diǎn)。第九十六張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng)用pBR322質(zhì)粒作為基因克隆載體 水稻葉綠體光誘導(dǎo)基因psbA的結(jié)構(gòu)分析 基因psbA編碼的蛋白質(zhì)，與光合作用系統(tǒng)相關(guān)，并且它能與除草劑阿特拉津結(jié)合，它的第264位氨基酸發(fā)生取代反應(yīng)，由絲氨酸變?yōu)楦拾彼?，可?dǎo)致其失去與除草劑阿特拉津結(jié)合的能力，推測(cè)是三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變 ；在原生生物衣藻、藍(lán)色細(xì)菌中

39、，此蛋白質(zhì)在同一位置由絲氨酸變?yōu)楸彼岬娜〈磻?yīng)，會(huì)使他們獲得對(duì)除草劑的抗性功能。 而且，非競(jìng)爭(zhēng)條件下，對(duì)除草劑阿特拉津抗性的千里光屬和莧屬，干物質(zhì)產(chǎn)量比敏感植物下降了25%和40%。 第九十七張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 通過對(duì)基因psbA的體外操作，有可能創(chuàng)造出抗除草劑的或高光效的轉(zhuǎn)基因植株。用pBR322質(zhì)粒作為載體，成功的克隆了水稻的psbA基因。 首先，將水稻葉綠體DNA，用EcoR內(nèi)切酶消化，經(jīng)含有溴化乙錠的熔點(diǎn)瓊脂糖電泳，回收分子大小為1.82.5kb之間的DNA片段。 再與經(jīng)過EcoR內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶作了脫磷酸處理的pBR322質(zhì)粒DNA連接。 然后轉(zhuǎn)

40、化給大腸桿菌，在氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，形成Ampr轉(zhuǎn)化子菌落群體。 用經(jīng)32p標(biāo)記的玉米psdADNA探針作菌落雜交，從1000多個(gè)菌落中篩選出8個(gè)陽(yáng)性克隆。第九十八張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 對(duì)這8個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的Southern分析，表明6個(gè)片段帶有長(zhǎng)度為2.2kb的編碼水稻葉綠體psdA基因。實(shí)際上其中1.2kb的片段編碼著水稻psdA基因的全部序列。通過dna序列分析表明與高等植物的同原性在92%，與藍(lán)色細(xì)菌同源性75%。第九十九張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4. pUC質(zhì)粒載體 人們應(yīng)用多克隆位點(diǎn)技術(shù)，在pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在

41、其5-端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。 第一百?gòu)?，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 一種典型的pUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個(gè)部分： 1、來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）； 2、氨芐青霉素抗性基因（ampr ）,但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不在含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的但識(shí)別位點(diǎn)。 3、大腸桿菌-半乳糖基因（lacZ）的啟動(dòng)子及編碼-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱之為lacZ基因； 4、位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。第一百零一張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于20

42、22年6月AmproripUC18(3 kb)MCS (Multiple cloning sites,多科隆位點(diǎn)）Lac promoterlacZ第一百零二張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月pUC質(zhì)粒載體的形體圖第一百零三張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)第一， 具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù) 僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點(diǎn)；在操作過程中復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變?cè)斐闪嘶騬op的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個(gè)細(xì)胞500700個(gè)拷貝。第二，適用于組織化學(xué)檢測(cè)重組體 具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基

43、因，所編碼的-肽鏈可參與- 互補(bǔ)作用，用X-gal顯色對(duì)重組子進(jìn)行鑒定，而pBR322質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。 第三，具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段 方便具有不同粘性末端的外源片段的插入。第一百零四張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5.其它的重要的質(zhì)粒載體喪失遷移功能的質(zhì)粒載體能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體第一百零五張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）喪失遷移功能的質(zhì)粒載體第一：擁有較高水平的拷貝數(shù),平均每個(gè)大腸桿菌寄主細(xì)胞可達(dá)3045份; 第二:失去了bom位點(diǎn)，即便在共存的F質(zhì)粒提供轉(zhuǎn)移裝置的條件下，也不可能發(fā)生遷移作用。第一百零六張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一百零七張，PPT共一百二十一頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體 pGEM-3Z是一種與pUC系列十分類似的小分子的質(zhì)粒載體，總長(zhǎng)度2743bp，編碼有一個(gè)氨芐青霉素