新一代測序技術及其在動物遺傳育種中的應用

1、新一代測序技術及其在動物遺傳育種中的應用摘要：隨著基因測序技術的進步，新一代測序技術為分子生物學的發(fā)展起到了巨 大的推動作用，它的出現(xiàn)使基因測序的成本呈幾何級數(shù)的趨勢下降，并走上大規(guī) 模實用化的道路。本文綜述了新一代測序技術的基本原理、技術路線以及在動物 遺傳育種方面的一些應用，并對納米技術為依托的第三代測序技術的發(fā)展提出了 展望。關鍵詞：新一代測序技術技術路線動物遺傳育種DNA測序技術是分子生物學研究中最常用的技術，它的出現(xiàn)極大地推動了 生物學的發(fā)展。成熟的DNA測序技術始于20世紀70年代中期。1977年，Maxam 和Gilberts報道了通過化學降解測定DNA序列的方法。同年，與Gil

2、bert同樣獲 得諾貝爾化學獎的SangerQ推出了雙脫氧鏈終止法。這兩大傳統(tǒng)的測序技術以及 在它們基礎上發(fā)展起來的各種DNA測序技術統(tǒng)稱為第一代測序技術，它在分子 生物學的研究中發(fā)揮了非常重要的作用，目前基于熒光標記和Sanger的雙脫氧 鏈終止法原理的熒光自動測序儀仍被廣泛地應用。但隨著人類基因組計劃的完 成，人們進入了后基因組時代，即功能基因組時代，傳統(tǒng)的測序方法已經不能滿 足深度測序和重復測序等大規(guī)?；蚪M測序的需求，這促使了新一代DNA測序 技術的誕生。新一代測序技術也稱為第二代測序技術，它主要包括羅氏454公司 的GS FLX測序平臺、Illumina公司的Solexa Genom

3、e Analyzer測序平臺和ABI 公司的SOLID測序平臺。1第二代測序技術原理1.1 454 GS FLX測序技術原理454生命科學公司在2005年最早推出了第二代測序平臺Genome Sequencer 20，并測序了支原體Mycoplasma genitalium的基因組。并在2007年推出性能更 優(yōu)的第二代基因組測序系統(tǒng)一 GenomeSequencer FLX System(GS FLX)4。GS FLX系統(tǒng)的測序原理是基于焦磷酸測序法，它依靠生物發(fā)光對DNA序列進行檢 測。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，GS FLX 系統(tǒng)將引物上每一個dNTP的

4、聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來。通過檢測熒光 信號釋放的有無和強度，就可以達到實時測定DNA序列的目的。此技術不需要 熒光標記的引物或核酸探針，也不需要進行電泳；具有分析結果快速、準確、高 靈敏度和高自動化的特點。Illumina 公司的 Solexa Genome Analyzer 測序技術原理Solexa測序技術第二代分析系統(tǒng)Genome Analyzer IIx是當前世界上應用最 為廣泛的新一代測序系統(tǒng)，較當前普遍使用的一次只能讀取1000個左右的堿基， 且DNA樣品需要長時間的制備和分析的測序儀，具有高準確性、高通量、高靈 敏度和低運行成本等突出優(yōu)勢。可以同時完成傳統(tǒng)基因組學研究以及功

5、能基因組 學研究。為目前遺傳分析和功能基因組等研究領域提出了全新的應用方案。它的基本原理是所需的文庫，可以使用任意能產生數(shù)百堿基長、兩翼有接頭 的片段的方法構建。通過PCR橋，反復30輪擴增，每個單分子得到了 1000倍 擴增，成為單克隆DNA簇。DNA簇產生之后，擴增子被線性化，測序引物隨后 雜交在目標區(qū)域一側的通用序列上。之后采用邊合成邊的測序原理進行測序，最 后進行數(shù)據分析，自動讀取堿基，數(shù)據被轉移到自動分析通道進行二次分析。ABI公司的SOLID測序原理Applied Biosystems(AB)公司所開發(fā)的 SOLID sequencer 在 2007 年 l0 月開始 商業(yè)用途釋放

6、。SOLID開發(fā)的初衷是在已經具有參考序列情況下的重測序。與 其他新一代測序儀不同的是，它不是利用DNA聚合酶在合成過程中讀取序列， 而是利用DNA連接酶在連接過程讀取序列5。ABI SOLiDTM 4.0采用邊連接邊 測序的原理，用結合在磁珠上單分子DNA片段簇為測序模板，以四色熒光標記 寡核苷酸進行連續(xù)的連接反應為基礎，對擴增的DNA片段進行大規(guī)模高通量測 序。SOLIDTM 4.0系統(tǒng)采用雙堿基編碼的方法使得其準確度可以達到99.94% 以上。2新一代測序技術技術路線l)NA嶂極交面制備 gm配塞未酷片段肉元共價統(tǒng)共價八片段單分子擴喈PCRDNA 簇光學圖鐐采集與處理熒光化學發(fā)光并行測障

7、反應,磁基薛圖 16 ( HYPERLINK /DNAsequencing01_3.htm /DNAsequencing01_3.htm)3第二代測序技術在動物遺傳育種中的應用隨著第二代測序技術的迅猛發(fā)展，科學界也開始越來越多地應用第二代測序 技術來解決生物學問題。比如在基因組水平上對還沒有參考序列的物種進行重頭 測序(de novo sequencing)，獲得該物種的參考序列，為后續(xù)研究和分子育種奠 定基礎；對有參考序列的物種，進行全基因組重測序(resequencing)，在全基因 組水平上掃描并檢測突變位點，發(fā)現(xiàn)個體差異的分子基礎。在轉錄組水平上進行 全轉錄組測序(whole tran

8、scriptome resequencing)，從而開展可變剪接、編碼序 列單核苷酸多態(tài)性(cSNP)等研究；或者進行小分子RNA測序(small RNA sequencing)，通過分離特定大小的RNA分子進行測序，從而發(fā)現(xiàn)新的microRNA 分子。在轉錄組水平上，與染色質免疫共沉淀(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉 淀(MeDIP)技術相結合，從而檢測出與特定轉錄因子結合的DNA區(qū)域和基因 組上的甲基化位點。3.1轉錄組分析第二代測序技術可對單個細胞樣品中的所有RNA即整個轉錄組進行整體測 序，對每個細胞中表達150000個拷貝mRNA的基因都能夠檢測，該技術還可 以檢測以前沒發(fā)現(xiàn)過的基

9、因或新的轉錄本(transcript)，定量測定基因的表達模式 7】。如Mortazavi8】等人利用Solexa技術對小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌進行了 RNA 測序，對測得的每條序列進行計數(shù)從而獲得每個特定轉錄本的表達量，能檢測到 豐度非常低的轉錄本。分析測得的序列，至少有3500個基因擁有不止一種剪切 形式，其中有接近10%是從未被報道過的RNA的剪切形式。3.2重測序如果對照一個參考基因組，新一代測序技術可以短時間內非常輕松的完成一 個基因組的重測序。2008年Hillier9對線蟲CB4858品系進行Solexa重測序，尋 找線蟲基因組中的SNP位點和單位點的缺失或擴增。但是也應該看到，

10、由于高 通量測序讀取長度的限制，使其在對未知基因組進行從頭測序(de novo sequencing)的應用受到限制，這部分工作仍然需要傳統(tǒng)測序(讀取長度達到850 個堿基)的協(xié)助。但是這并不影響高通量測序技術在全基因組mRNA表達譜、 microRNA表達譜、ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的應用。3.3基因組圖譜2009年12月，我國科研人員又在Nature在公布了大熊貓基因組精細圖譜 研究成果10，表明大熊貓基因組大小2.4G，重復序列含量36%，基因2萬多個， 且經過二倍體測序，證明大熊貓基因組仍然具備很高的雜合率，從而推斷其具有 較高的遺傳多態(tài)性。3.4轉錄調控研究(ChIP

11、-seq)染色體免疫共沉淀(chromatin immun即recipitation，ChIP)技術是研究蛋白與 DNA相互作用的重要方法。以往的研究需結合芯片技術(即ChIP-on-chip或 ChIP-chip)，因為芯片技術基于雜交原理，需根據已知的序列設計探針，對于未 知的序列無能為力。把ChIP技術和第二代測序技術結合，即 ChIP-sequencing(ChIP-seq)，可以在基因組水平上很方便的檢測某種蛋白所結合 的DNA序列，全面了解蛋白與DNA的相互作用?，F(xiàn)通過Illumina公司的測序 平臺就可以對染色質免疫共沉淀得到的微量DNA片斷進行大規(guī)模測序11。首先 將獲得的DN

12、A片段加上接頭后進行PCR擴增得到ChIP-Seq文庫后直接進行大 規(guī)模測序，并能把所檢測蛋白的DNA結合位點精確定位到基因組上。如2009 年Ouyang12等H引利用ChIP-seq技術發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎干細胞中，大約有65% 的基因表達是由12個轉錄因子調控的。3.5甲基化測序甲基化影響X染色體失活、基因組印跡等表觀遺傳現(xiàn)象，目前基因的甲基 化異常的檢測已成為探討表觀遺傳現(xiàn)象的分子研究熱點。過去，檢測甲基化的研 究方法通量都較小，限制了對甲基化在基因組水平的深入研究。而新一代測序可 以應用到甲基化的檢測，通過對5-甲基胞嘧啶抗體富集的高甲基化的DNA片段 進行高通量測序，可以獲得全基因組范

13、圍內高精度的甲基化狀態(tài)，為表觀遺傳調 控分析提供可靠的證據。2010年，我國研究人員借助Illumina的高通量測序技 術獲得家蠶基因組甲基化圖譜，同時證明了對低甲基化水平的生物個體進行表觀 遺傳基因測序的可行性13。4展望DNA測序技術經過了 30多年的發(fā)展，新一代測序技術解決了第一代測序技 術存在的一些難題，然而在遺傳學中，成千上成的基因組需要測出及分析，高通 量的第二代測序技術還是面臨著成本高、效率低、準確度不夠等難題，第三代測 序技術已經開始嶄露頭角。第三代測序技術主要是以納米技術為基礎的單分子測序技術，它的基本原理 是利用合成測序理論，將樣本DNA數(shù)以百萬的單鏈分子綁定在該儀器特有的

14、、 沒有背景熒光的玻璃表面，通過加入熒光標記的核苷酸和聚合酶到單分子陣列 中，核苷酸會結合到DNA分子上特異性結合的位點上。用激光激發(fā)結合在DNA 分子的熒光標記的核苷酸，使標記物發(fā)出熒光，相機以15ms速度快速掃描整個 陣列，檢測特異性結合到DNA片斷上的熒光堿基。在些之后，結合的核苷酸對 會被移動除去，然后，通過重復加入標記的核苷酸來重復這一過程。它的一個非 常重要的優(yōu)勢就在于它不需要擴增建立DNA庫，從而可以切斷了數(shù)據結果中潛 在錯誤的來源。因此我們有理由相信第三代測序技術會在不久以后將可以用于大 規(guī)?；瘧弥?，為人類以及動物遺傳學研究創(chuàng)造更大的空間。參考文獻：Maxam AM,Gilb

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