生物固氮作用

1、生物固氮作用生物固氮作用生物固氮作用 （biological nitrogen fixation）:生物固氮是指固氮微生物將大氣中的氮還原成氨的過(guò)程。 生物固氮只發(fā)生在少數(shù)的細(xì)菌和藻類(lèi)中。估計(jì)全球每年生物固氮作用所固定的氮（N2） 約達(dá) 17500 萬(wàn)噸，其中耕地土壤約有 4400 萬(wàn)噸，超過(guò)了每年施入土壤 4000 萬(wàn)噸肥料氮素（工業(yè)固氮）的量（Burris ， 1977） 。因此，生物固氮作用有很大潛力。生物固氮概括地說(shuō)是指某些微生物和藻類(lèi)通過(guò)其體內(nèi)固氮酶系的作用將分子氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘钡淖饔谩?因地殼含有極少的可溶性無(wú)機(jī)氮鹽，所有生物幾乎都需要依賴(lài)固氮生物固定大氣中的氮而生存，因此生物固氮對(duì)維持

2、自然界的氮循環(huán)起著極為重要的作用。對(duì)固氮生物的研究和利用能為農(nóng)業(yè)開(kāi)辟肥源，對(duì)維持和提高土壤肥力有很大意義。固氮生物又叫做固氮微生物。 固氮微生物種類(lèi)到 1982 年固氮微生物達(dá)70多個(gè)屬，大多數(shù)是原核微生物（細(xì)、放、藍(lán)細(xì)菌），也有真菌。根據(jù)固氮微生物與高等植物以及其他生物關(guān)系，分為 三個(gè)類(lèi)型 :自生固氮微生物、共生固氮微生物和聯(lián)合固氮微生物。1（ 自生固氮微生物 :在土壤中或培養(yǎng)基中生活時(shí)，可以自行固定空氣中的分子態(tài)氮（氨態(tài)氮） 。在進(jìn)行固氮作用時(shí)對(duì)植物或其它生物沒(méi)有明顯的依存關(guān)系。常見(jiàn)的自生固氮微生物包括以圓褐固氮菌為代表的好氧性自生固氮菌、以梭菌為代表的厭氧性自生固氮菌，以及以魚(yú)腥藻、念珠

3、藻和顫藻為代表的具有異形胞的固氮藍(lán)藻（異形胞內(nèi)含有固氮酶，可以進(jìn)行生物固氮）。光合固氮微生物 能進(jìn)行光合作用，以二氧化碳為碳源、光合產(chǎn)物為能源進(jìn)行固氮作用的微生物。有藍(lán)細(xì)菌 （見(jiàn)藍(lán)藻門(mén) ）中的許多屬種（如念珠藻屬、魚(yú)腥藻屬等）和光合細(xì)菌中的紅螺菌屬以及綠硫菌屬等。化能自養(yǎng)固氮微生物 有些化能自養(yǎng)微生物（如氧化亞鐵硫桿菌等）能以二氧化碳、亞鐵氧化物和分子態(tài)氮為碳、能、氮源。異養(yǎng)固氮微生物 進(jìn)行異養(yǎng)生活，以適宜的有機(jī)碳化合物為碳源和能源，滿(mǎn)足生活和固氮的需要。這個(gè)生理、生態(tài)群包括許多種類(lèi)，如固氮菌科的所有屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬的一些種、固氮螺菌屬、腸桿菌科的一些屬種、反硫化細(xì)菌、產(chǎn)甲烷細(xì)菌和其他一

4、些異養(yǎng)細(xì)菌的種類(lèi)。2( 共生固氮微生物 : 只有和植物互利共生時(shí)，才能固定空氣中的分子態(tài)氮。也就是說(shuō)，二種微生物緊密地生長(zhǎng)在一起時(shí)，由固氮的共生菌進(jìn)行分子態(tài)氮的還原作用。3. 聯(lián)合固氮微生物 : 有些固氮微生物如固氮螺菌、雀稗固氮菌等，能夠生活在玉米、雀稗、水稻和甘蔗等植物根內(nèi)的皮層細(xì)胞之間。這些固氮微生物和共生的植物之間具有一定的專(zhuān)一性，但是不形成根瘤那樣的特殊結(jié)構(gòu)。這些微生物還能夠自行固氮，它們的固氮特點(diǎn)介于自生固氮和共生固氮之間，這種固氮形式叫做聯(lián)合固 TOC o 1-5 h z 氮。聯(lián)合固氮微生物常見(jiàn)的有以下兩種類(lèi)型:紅萍和魚(yú)腥藻聯(lián)合體系 紅萍(又稱(chēng)綠萍，學(xué)名滿(mǎn)江紅)鱗片葉的葉腔內(nèi)有魚(yú)

5、腥藻生長(zhǎng)，行共生固氮作用。固氮地衣 有些地衣的光合伙伴是固氮藍(lán)細(xì)菌，能進(jìn)行固氮作用。 自生固氮微生物生物固氮作用的條件: 1 、防氧保護(hù)系統(tǒng)(好氣性固定微生物需具備之);、能量和電子供體，以及傳遞電子的電子載體系統(tǒng);、固氮酶催化系統(tǒng);、氨、氨基酸同化成蛋白質(zhì)系統(tǒng);共生固氮微生物生物固氮作用的條件則更復(fù)雜。 生物固氮系統(tǒng)具有生物固氮能力的僅限于原核生物，即細(xì)菌和藍(lán)綠藻。有些固氮微生物，如藍(lán)綠藻自生于陸地或水域生態(tài)系統(tǒng)中，其他則群生于寄生植物的根際，其中對(duì)高等植物最為重要的有與豆科植物或結(jié)瘤的非豆科植物共生的固氮微生物。在陸地生態(tài)系統(tǒng)中主要有三種固氮體系，即共生固氮、聯(lián)合固氮和自生固氮體系。三種固

6、氮體系中，能源和固氮能力都存在明顯差異。共生體系由于固氮微生物直接從寄主植物獲得碳水化合物作為固氮能源，其固氮能力最強(qiáng)。豆科(Leguminosae) 植物近 2000 個(gè)種中約有15%具有共生固氮系統(tǒng)，其中近300 種豆科植物中有90% 與根瘤菌共生形成根瘤。如大豆、蠶豆、三葉草、苜蓿與根瘤菌的共生，是農(nóng)業(yè)中最重要的共生體系。在森林和林地中有8個(gè)科 23 個(gè)屬的植物與固氮微生物形成共生體系。如赤楊屬 (Alnus) 和薊木屬 (Ceanothus) 與放線(xiàn)菌之間形成結(jié)瘤共生體系。這些非豆科植物是缺氮土壤的先鋒植物。豆科植物根上的根瘤是由于根瘤菌侵入根部后形成的，根瘤是固氮的場(chǎng)所。根瘤菌侵入寄

7、主的過(guò)程很復(fù)雜。在根瘤菌入侵寄主根毛或表皮細(xì)胞之前，土壤中的根瘤菌是一種不能運(yùn)動(dòng)的小球菌 (圖 5-19) 。由于植物根分泌物(氨基酸、維生素)的影 響，這些小球菌產(chǎn)生鞭毛，具有移動(dòng)侵入寄主的能力。根瘤菌在根表面分泌某種未知物質(zhì)(分子 )使根毛彎曲。這種物質(zhì)的分泌受到根釋放成分(如類(lèi)黃酮)的促進(jìn)。此后，根瘤菌分泌酶溶解根毛細(xì)胞壁，根瘤菌隨即由此處侵入根毛，根毛形成侵染絲(infectionthread) 。根瘤菌在侵染絲中大量繁殖隨侵染絲進(jìn)入皮層。根瘤菌被釋放到皮層細(xì)胞質(zhì)中，刺激細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)形成根瘤(root nodule)( 圖 5-19) 。根瘤中大部分為含有根瘤菌的四倍體細(xì)胞，只有少

8、部分為未被侵染的二倍體細(xì)胞。成熟根瘤中的根瘤菌失去鞭毛而成為不能移動(dòng)的類(lèi)菌體(bacteriod) ，一個(gè)典型的根瘤細(xì)胞中通常含有數(shù)千個(gè)類(lèi)菌體，這些類(lèi)菌體在細(xì)胞內(nèi)聚成一個(gè)個(gè)小群體，每個(gè)小群體有數(shù)個(gè)類(lèi)菌體組成 (大豆根瘤中為 4,6 個(gè)) 。每群體外面有一層膜包著，此膜稱(chēng)為類(lèi)菌體外周膜(peribacteroid membrane) ，在此膜與類(lèi)菌體之間的空間稱(chēng)為類(lèi)菌體外周空間 (peribacteriodspace) 。在類(lèi)菌體外周膜以外的細(xì)胞質(zhì)中存在著豆血紅蛋白 (leghemoglobin) 。此蛋白含有紅色的血紅素基團(tuán) (hemegroup) 。據(jù)認(rèn)為豆血紅蛋白的作用是為類(lèi)菌體在嚴(yán)格控制

9、的條件下供應(yīng)氧。因?yàn)轭?lèi)菌體的呼吸作用需要氧，但過(guò)多的氧則會(huì)抑制催化氮素固定的固氮酶的活性。根瘤中的固氮作用只在類(lèi)菌體內(nèi)進(jìn)行。寄主植物向類(lèi)菌體供給碳水化合物，主要形式是蔗糖。類(lèi)菌體利用這些糖進(jìn)行呼吸作用，產(chǎn)生電子和 ATP ，將 N2 還原 成 NH4+ 。.固氮的生物化學(xué)與生理學(xué)生物固氮的總反應(yīng)式如下 :N2+8e+16MgATP+16H2O2NH3+H2+16MgADP+16Pi+8H+催化此反應(yīng)的酶是固氮酶。固氮酶是多功能的氧化還原酶，除了還原N2 以外，還能還原多種類(lèi)型的底物，如乙炔、氰化物、氧化亞氮、聯(lián)氨、疊氮化物和H+ 等。用氣相色譜儀能很容易測(cè)定乙炔還原成乙烯的產(chǎn)生量，這為研究固氮

10、酶活性提供了極為簡(jiǎn)單的方法。該法對(duì)生物固氮研究取得重大進(jìn)展發(fā)揮了作用。固氮酶由鐵鉬蛋白 (Fe-Moprotein) 和鐵蛋白 (Fe-protein) 組成。這兩個(gè)蛋白單獨(dú)存在時(shí)都不呈現(xiàn)固氮酶活性，只有兩者聚合構(gòu)成復(fù)合體時(shí)才有催化氮還原的功能。鐵鋁蛋白由分子量分別為 51kD和60kD的2個(gè)a亞基和2個(gè)B亞基組成的 四聚體(a 2 B 2),分子:K20245kD。每分子鐵鋁蛋白含有兩個(gè)鋁原子，28個(gè)鐵原子。鐵蛋白的分子量在59,73kD 之間，由兩個(gè)分子量同為 30kD 的亞基組成(Y 2) 0鐵蛋白含有個(gè)鐵原子。在氮還原為NH4+的過(guò)程中，固氮酶中的Fe和Mo 都發(fā)生氧化還原反應(yīng)，如圖

11、5-20 所示。類(lèi)菌體利用碳水化合物進(jìn)行呼吸作用產(chǎn)生 NADH 或 NADPH 和 ATP 。已經(jīng)查明，固氮的天然電子傳遞體（供體 ）有鐵氧還蛋白、黃素氧還蛋白等。固氮生物體內(nèi)存在著ATP 和二價(jià)的金屬離子（如 Mg2+）是固氮不可缺少的條件。只有在Mg2+ 的作用下， ATP 才可以與 Fe 蛋白結(jié)合，而且必需有 Fe-Mo 蛋白的參與才發(fā)生ATP 水解反應(yīng)。 Fe 蛋白將電子傳遞給Fe-Mo蛋白的同時(shí)伴隨著ATP 水解產(chǎn)生 ADP 。 Fe-Mo 蛋白最后將電子傳遞給N2 和質(zhì)子，產(chǎn)生 2 分子 NH3 和 1 分子 H2 。固氮酶對(duì)氧敏感，其催化反應(yīng)需在厭氧下進(jìn)行。除了專(zhuān)性厭氧的生物外，

12、氧對(duì)其他固氮生物的固氮酶有損傷作用，但這些生物通過(guò)呼吸作用產(chǎn)生固氮必需的 ATP 又需要氧，所以高效率的固氮作用一般是在微氧下進(jìn)行的。不同固氮生物避免氧對(duì)固氮酶?jìng)Φ臋C(jī)制各異。如具有異形胞的藍(lán)藻的固氮功能主要在異形胞中進(jìn)行，這種細(xì)胞外有一層防氧進(jìn)入的糖脂組成的外膜，缺少水光解放氧的PS,其中戊糖磷酸途徑的兩種酶活性較低，而超氧物歧化酶和脫氫酶活性都比較強(qiáng)，使異形胞保持了一個(gè)微氧環(huán)境。豆科植物的根瘤中類(lèi)菌體有一層類(lèi)菌體周膜，瘤內(nèi)皮層內(nèi)側(cè)細(xì)胞排列緊密并形成間隙，兩者對(duì)于保持類(lèi)菌體的低氧環(huán)境十分重要。此外，根瘤細(xì)胞內(nèi)的豆血紅蛋白也部分地控制著類(lèi)菌體氧氣的需求。在非豆科植物共生固氮體系中，在與放線(xiàn)菌共

13、生的瘤中有囊泡存在，這種囊泡可能與藍(lán)藻的異形胞一樣具有防氧功能。很明顯，共生體系中的根瘤本身就是一個(gè)良好的氧保護(hù)系統(tǒng)。在類(lèi)菌體內(nèi)合成的 NH3（ 很可能是 NH4+） 要從類(lèi)菌體內(nèi)運(yùn)出來(lái)，才能參與寄主植物中的代謝。在含類(lèi)菌體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中， NH4+ 轉(zhuǎn)化成谷酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和酰脲。這些物質(zhì)由轉(zhuǎn)移細(xì)胞分泌到木質(zhì)部，運(yùn)輸?shù)街参锏钠渌糠?。由于生物固氮的重要性，有關(guān)控制生物固氮的環(huán)境與遺傳因素的研究受到重視。研究表明，凡是能增加植物光合作用能力的因素，如合適的水分、溫度、強(qiáng)光照和高 CO2 水平等都可以促進(jìn)固氮作用。豆科植物與固氮生物的遺傳因素也影響固氮作用的速率和產(chǎn)量。例如其中一個(gè)遺傳因素

14、是豆科植物的結(jié)瘤能力，它依賴(lài)于根瘤菌與寄主植物之間的由遺傳控制的識(shí)別過(guò)程。為提高結(jié)瘤能力，科學(xué)工作者正在進(jìn)行改造根瘤菌基因以及選擇合適的寄主品種的研究工作。另外一個(gè)遺傳因素是固氮酶在還原N2 的同時(shí)還原H+ 。由總反應(yīng)式可見(jiàn)，固氮酶催化的反應(yīng)中有1/4的電子用于還原H+ 產(chǎn)生 H2 。而 H2 被還原后逸出進(jìn)入大氣，這個(gè)過(guò)程使能量白白浪費(fèi)。不過(guò)，大多數(shù)根瘤菌和自生固氮細(xì)菌均含有氫化酶，該酶將H2 氧化成H2O ，這一過(guò)程推動(dòng)由 ADP 和 Pi 合成 ATP 的反應(yīng)。有研究表明，與具有較高氫化酶活性的根瘤菌共生的豆科植物（如大豆）的產(chǎn)量比與無(wú)氫化酶活性的根瘤共生的稍高?？赡苁乔罢邷p少了能量的浪

15、費(fèi)?；谶@種認(rèn)識(shí)，通過(guò)基因工程技術(shù)可能會(huì)獲得具有更高活性的氫化酶的根瘤菌并增加豆類(lèi)產(chǎn)量。此外，用基因工程技術(shù)將固氮基因?qū)敕嵌箍浦参锔?，促使這些植物固氮的工作也獲得了一定的進(jìn)展。植物的不同生長(zhǎng)階段會(huì)影響生物固氮作用。如大豆、花生、木豆，通過(guò)生物固氮固定的氮素中 90% 在生殖階段中進(jìn)行，而10% 在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中進(jìn)行。奇怪的是，幾種豆類(lèi)的生物固氮提供的氮素僅為其一生所需總氮量的 1/4 至 1/2 ，其余主要在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段從土壤中吸收NO3- 或 NH4+ 。不過(guò)，多施氮肥并不能增產(chǎn)。原因是植物對(duì)氮肥吸收增加反而使生物固氮能力下降。硝酸鹽肥料的影響有幾個(gè)方面 :抑制根瘤菌與根毛的接觸，中止侵染絲的形成;根瘤生長(zhǎng)緩慢，抑制已成熟根瘤的固氮作用 ;當(dāng)增施 NO3- 和 NH4+ 時(shí)，加速根瘤的衰老。 共生與自生的區(qū)分概念 : 共生固氮微生物 與綠色植物互利共生的固氮微生物自生