生物制藥工藝學(xué)第15章第四節(jié)基因藥物精品課件

1、第四節(jié) 基因藥物一、基因治療的概念1、基因治療的定義:(P632頁) 基因治療是將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕?qū)肴梭w靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)。而用于基因治療的核酸等稱為基因藥物（gene medicines） 在未形成概念前，20世紀(jì)70年代就開始臨床實(shí)驗(yàn)，由于實(shí)驗(yàn)未取得成果，而且沒有得到NIH的批準(zhǔn)，廣受抨擊。 80年代，在動(dòng)物身上進(jìn)行了大量試驗(yàn)，為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 1990年9月，臨床實(shí)驗(yàn)正式開始?；颊呤且幻紘?yán)重聯(lián)合免疫缺陷癥的年輕姑娘，她從父母處各繼承了一個(gè)缺陷的ada基因，造成體內(nèi)缺乏腺苷酸脫氨酶。 我國復(fù)旦大學(xué)的薛京倫研究

2、小組，做了世界上首例血友病 基因治療。 成功地對先天性重癥免疫缺陷癥進(jìn)行基因治療的法國基因治療組組長艾倫費(fèi)希爾博士（左）和成員瑪麗娜卡巴甘那卡勃博士（右）。 2019年10月,一名法國男孩在接受試驗(yàn)性基因治療后罹患白血病，而基因治療很可能是白血病發(fā)病的原因。 Fisher說，他非常希望這種基因治療方法從總體而言利大于弊。除基因治療之外，治療SCID的另一種治療方法是近親的骨髓移植。除非骨髓移植非常匹配，否則手術(shù)的失敗率是25%。他強(qiáng)調(diào)說，這一失敗率比現(xiàn)在接受基因治療的11例患者的并發(fā)癥發(fā)生率高2倍以上。 從基因角度：對缺陷的基因進(jìn)行原位修復(fù)用正常有功能的基因置換有缺陷的基因增補(bǔ)缺陷基因（不需要

3、去除異?；?，而是另外轉(zhuǎn)入與缺陷基因同源的有功能的基因來彌補(bǔ)缺陷的基因）從治療角度導(dǎo)入基因以改變患者細(xì)胞的基因表達(dá)導(dǎo)入基因：缺陷基因相對應(yīng)的有功能的同源基因缺陷基因無關(guān)的治療基因基因治療的兩種形式體細(xì)胞基因治療種系基因治療只限于某一體細(xì)胞的基因的改變只限于某個(gè)體的當(dāng)代對缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正當(dāng)代及子代2、基因治療的方式基因矯正或置換基因增補(bǔ)基因封閉其他3、導(dǎo)入的方式體外導(dǎo)入（ex vivo）體外將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)再將這種基因修飾過的細(xì)胞回輸病人體內(nèi)使這種帶外源基因的細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)達(dá)到治療或預(yù)防的目的體內(nèi)導(dǎo)入（in vivo）外源基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織細(xì)胞使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并表達(dá)基因治療的基本

4、程序治療性基因的選擇基因載體的選擇病毒載體非病毒載體靶細(xì)胞的選擇體細(xì)胞生殖細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移間接體內(nèi)療法直接體內(nèi)療法外源基因表達(dá)的篩選 利用載體中的標(biāo)記基因回輸體內(nèi)目前臨床試驗(yàn)的治療基因： 合適的能達(dá)到治療/預(yù)防的目的基因的cDNA 目的基因的cDNA的獲得cDNA文庫中目的基因的克隆人工合成基因片段PCR法篩選擴(kuò)增目的基因 二、治療的基因的選擇三、載體系統(tǒng)-運(yùn)送基因的工具病毒載體非病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒腺相關(guān)病毒單純胞疹病毒哺乳動(dòng)物人工染色體脂質(zhì)體裸DNA基因縫合線法 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期進(jìn)入宿主細(xì)胞 雙鏈RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 雙鏈DNA前病毒 整合到宿主細(xì)胞基因組DNA中 宿主細(xì)

5、胞RNA聚合酶II mRNA 病毒RNA基因組 作為合成相應(yīng) 病毒蛋白質(zhì)的模板 包裝成新的病毒顆粒，離開宿主逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建長末端重復(fù)序列包裝信號LTRgagpolenvLTR調(diào)節(jié)和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒核心蛋白產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生病毒外膜蛋白包裝信號LTR目的基因標(biāo)記基因LTR 逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一般結(jié)構(gòu)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體假病毒顆粒的產(chǎn)生病毒復(fù)制需要的gag，pol，env基因已經(jīng)預(yù)先整合進(jìn)包裝細(xì)胞的基因組腺病毒DNA 載體的特點(diǎn) 基因重排低 外源基因于病毒DNA重組后能穩(wěn)定復(fù)制幾個(gè)周期 安全性能好 不整合人的染色體DNA，不會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤 宿主范圍廣 對受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格 使用效果

6、好 外源基因在載體上容易高效表達(dá) 3、腺相關(guān)病毒（adeno associated virus，AAV） 屬于細(xì)小病毒科，其成熟病毒顆粒中有的含正鏈DNA，有的含負(fù)鏈DNA。不能獨(dú)立繁殖，其繁殖依賴于輔助病毒（腺病毒或皰疹病毒）。基因組僅5kb，有兩個(gè)ORF，5和3端各有一個(gè)由145個(gè)氨基酸組成的反向重復(fù)序列（ITR），對病毒的復(fù)制、整合、包裝等有重要調(diào)控作用。優(yōu)點(diǎn)：1)、反向末端重復(fù)序列中沒有轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，減少激活原癌基因的可能性2）、宿主廣，只能形成慢性感染3）、可發(fā)生位點(diǎn)特異性整合，有利于表達(dá)4）、熱穩(wěn)定性好，而作為輔助病毒的腺病毒在60即被滅活5）、安全性較好，本身不致病4、單純皰疹病

7、毒（herpes simple virus，HSV） 雙鏈DNA病毒，基因組大小152kb，可缺失多個(gè)基因仍保持復(fù)制能力。特點(diǎn)：1）、序列清楚 2）、可容納至少30kb外源基因3）、宿主廣，可侵染脊椎動(dòng)物各種細(xì)胞4）、重組病毒培養(yǎng)過程中易得到較高滴度5）、從外周進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)，不影響神經(jīng)元功能 但表達(dá)產(chǎn)物對多種類型宿主有毒性，且可引起嚴(yán)重免疫反應(yīng)，要進(jìn)入臨床仍需改進(jìn)5、 痘病毒載體 痘苗病毒為線形雙鏈的有包膜病毒, 其核心顆粒不依賴宿主細(xì)胞而獨(dú)立引進(jìn)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制,宿主范圍廣泛，易于培養(yǎng)；痘苗病毒基因組中大量非必需基因的缺乏并不影響其在宿主細(xì)胞的復(fù)制能力,可允許在同一或不同非必需區(qū)插入多個(gè)基因 痘苗

8、病毒缺點(diǎn)是載體對細(xì)胞的毒性,同時(shí)病毒能被人體的補(bǔ)體系統(tǒng)滅活并降解表 常用病毒載體得特征和適用范圍病毒載體生物學(xué)特性適用范圍反轉(zhuǎn)錄病毒載體可感染分裂細(xì)胞；整合到染色體中表達(dá)時(shí)間長有致癌的危險(xiǎn)Ex vivo基因治療腫瘤基因治療 腺病毒載體可感染分裂和非分裂細(xì)胞不整合到染色體中外源基因表達(dá)水平高表達(dá)時(shí)間較短免疫原性強(qiáng)In vivo基因治療腫瘤基因治療疫苗 AAV病毒載體可感染分裂和非分裂細(xì)胞整合到染色體中無致病性；免疫原性弱；可長期表達(dá)外源基因在骨骼肌、心肌、肝臟、視網(wǎng)膜等組織中表達(dá)水平較高In vivo 基因治療Ex vivo基因治療遺傳疾病的治療獲得性慢性疾病的基因治療 HSV病毒載體具嗜神經(jīng)性

9、，可逆軸突傳遞可潛伏感染，容量大可感染分裂和非分裂細(xì)胞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療腫瘤的基因治療四、靶細(xì)胞1、造血細(xì)胞 常用反轉(zhuǎn)錄病毒，體外基因轉(zhuǎn)移，彌散的組織多，分散廣。對轉(zhuǎn)入外源基因的細(xì)胞可檢驗(yàn)，考慮安全性及有效性。2、肌肉細(xì)胞 常用。肌肉細(xì)胞分布廣，含量豐富，為“永久性”細(xì)胞，基因不會(huì)因分裂而丟失；細(xì)胞長而大，且為多核細(xì)胞，基因易轉(zhuǎn)移和表達(dá)。為“非生命”器官，安全；溶酶體少，外源DNA不易被降解，基因存活時(shí)間長；血流豐富，產(chǎn)物可釋放入血3、皮膚 表皮涂抹或膚內(nèi)注射裸露DNA活脂質(zhì)體包裹DNA。安全、簡便，易行，但皮膚不斷更替。4、其他 如肝細(xì)胞、靜脈注射等。五、轉(zhuǎn)移方法1、化學(xué)法DNA介導(dǎo)：用

10、磷酸鈣微量沉淀外源DNA，然后與靶細(xì)胞混合。染色體介導(dǎo)：用秋水仙素處理使染色體固縮，破碎，差速離心，分離出染色體，與受體細(xì)胞混合。脂質(zhì)體介導(dǎo)：臨床已用受體介導(dǎo)：外源DNA與某些細(xì)胞特異性受體的多肽配基形成復(fù)合物，與受體結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞2、物理法直接注射法，顯微注射法，電穿透法等3、病毒介導(dǎo)目前最常用和最成熟的方法六、基因治療的臨床試驗(yàn)當(dāng)前基因治療試驗(yàn)：治療性試驗(yàn)基因標(biāo)記非治療性試驗(yàn)治療性試驗(yàn)1、遺傳性疾病2、惡性腫瘤（1）抑癌基因或細(xì)胞因子基因治療（2）自殺基因系統(tǒng)（3）抑制血管生成（4）反義藥物（5）導(dǎo)入MHCI類抗原基因（6）導(dǎo)入MDR1(Multidrug Resistance)基因3、病毒

11、性感染4、其他遺傳疾病缺失的基因產(chǎn)物細(xì)胞類型嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷腺苷酸脫氫酶T/B淋巴細(xì)胞慢性肉牙腫瘤細(xì)胞色素b中性粒細(xì)胞戈謝病糖腦苷酶巨噬細(xì)胞鐮刀狀細(xì)胞貧血珠蛋白紅細(xì)胞和地中海貧血和珠蛋白紅細(xì)胞Lesch-Nyhan癥群次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基底神經(jīng)節(jié)Ducheme肌委縮萎縮素肌肉細(xì)胞帕金森病多巴胺腦黑質(zhì)肺氣腫1抗胰蛋白酶肺上皮細(xì)胞囊性纖維化CF跨膜傳導(dǎo)調(diào)控劑肺/胰上皮細(xì)胞苯丙酮尿癥苯丙氨酸羥化酶肝細(xì)胞家族性高膽固醇血癥低密度脂蛋白受體肝細(xì)胞血友病A和B凝血因子和血小板、肝細(xì)胞 遺傳性單基因疾病腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SC

12、ID)第一個(gè)基因臨床治療的方案(1990.9.14,NIH)病因:淋巴細(xì)胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆積 破壞免疫功能 患兒很少活到成年治療策略：淋巴細(xì)胞ADA酶 恢復(fù)至正常水平的 5%-10% 維持免疫系統(tǒng)功能 改善病人癥狀治療基本步驟: ADA基因+逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 導(dǎo)入患者淋巴細(xì)胞 體外擴(kuò)增 回輸病人體內(nèi)淋巴細(xì)胞ADA酶恢復(fù)至正常水平的5%-10% 維持免疫系統(tǒng)功能,改善病人癥狀惡性腫瘤的細(xì)胞因子基因治療基因工程“瘤苗”策略a：將刺激免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子基因(IL-2/IL-12/IFN-)轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞，提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞因子基因的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)分泌細(xì)胞因子增強(qiáng)抗腫瘤的免疫

13、反應(yīng)，形成局部的抗腫瘤免疫微環(huán)境引發(fā)全身的抗腫瘤免疫機(jī)能策略b： 引入抑瘤基因，如p53基因 今又生（Gendicine）是世界上第一個(gè)獲得批準(zhǔn)臨床使用的抗腫瘤基因藥，由正常人腫瘤抑制基因p53和改構(gòu)的5型腺病毒基因重組而成。 通常判斷一個(gè)抗癌基因必須同時(shí)具備以下條件：1、在該腫瘤中該基因發(fā)生了變化，包括突變、缺失、甲基化等。 2、將該基因的野生型導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞能夠部分或全部抑制其表型。 3、該基因在該腫瘤相應(yīng)的正常組織中存在正常表達(dá)。P53結(jié)構(gòu)示意圖P53基因產(chǎn)物是一種核磷酸化蛋白，能夠與8種以上細(xì)胞蛋白結(jié)合，生物學(xué)活性是引起細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞分化。大約50%的人類腫瘤中存在p53基因的變化The H2 alpha helix, shown in gold and comprised of residues 278-286, is thought to be a key component of of the DNA binding domain with its numerous charged residues, helping to bind to the major groove of the DNA molecule. 自殺基因 將一基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞，它編碼的蛋白可將無毒的前藥轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸镜奈镔|(zhì) 如胸苷激酶基