2013-實(shí)驗(yàn)八jinjing大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)化

1、2022/7/291實(shí)驗(yàn)八 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化中山大學(xué)藥學(xué)院2022/7/292一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)試劑四、實(shí)驗(yàn)步驟五、注意事項(xiàng)講授內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2022/7/293學(xué)習(xí)和掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備的原理和方法了解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。學(xué)習(xí)和掌握質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?022/7/294二、實(shí)驗(yàn)原理基因工程（genetic engineering）又稱DNA重組技術(shù)，在分子水平上對基因進(jìn)行操作的復(fù)雜技術(shù)，是將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作。實(shí)驗(yàn)原理2022/7/295 質(zhì)粒

2、(plasmid)為小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，在細(xì)菌體內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，擁有啟動子，編碼區(qū)和終止子；由于環(huán)狀結(jié)構(gòu)，質(zhì)粒進(jìn)入菌體內(nèi)不易被DNA外切酶降解，從而保證了它在非同種細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移，作為基因的載體，在基因工程中有用。實(shí)驗(yàn)原理質(zhì)粒特點(diǎn)：1. 自我復(fù)制系統(tǒng)2. 限制酶切位點(diǎn)3. 抗性標(biāo)記基因2022/7/296感受態(tài)細(xì)胞(competent cells)受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：電擊法，CaCl2等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA的分子通過的感受態(tài)細(xì)胞(competent cell) 。2022/7/297轉(zhuǎn)化（transformation）是將異源DNA

3、分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株（R-M-）。實(shí)驗(yàn)原理2022/7/298化學(xué)方法(熱擊法)：使用化學(xué)試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。 轉(zhuǎn)化的方法：實(shí)驗(yàn)原理2022/7/299CaCl2 法是目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方

4、法，簡便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時，可加入占總體積15的無菌甘油于-70保存(半年)，因此CaCl2法使用更廣泛。CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)原理2022/7/2910CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞原理：細(xì)菌處于 0，CaCl2 的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA 形成抗DNase 的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng) 42短時間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收 DNA 復(fù)合物。鈣離子的作用是結(jié)合于細(xì)胞膜上，是細(xì)胞膜呈現(xiàn)一種液晶態(tài)。在冷熱變化刺激下液晶態(tài)的細(xì)胞膜表面會產(chǎn)生裂隙，使外源DNA進(jìn)入。實(shí)驗(yàn)原理2022/7/2911重組DNA轉(zhuǎn)

5、化細(xì)菌過程示意圖實(shí)驗(yàn)原理2022/7/2912主要用不同抗生素基因篩選。常用的抗生素有：氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kana）、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等。克隆的篩選：實(shí)驗(yàn)原理2022/7/2913三、實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)器材：冷凍離心機(jī)、水浴鍋、恒溫?fù)u床、廣口瓶、鹽水瓶、已滅菌的微量移液管、玻璃儀器以及塑料離心管、EP管、槍頭、培養(yǎng)皿等。 試 劑大腸桿菌DH5、EGFP-N3重組質(zhì)粒 、LB液體培養(yǎng)基、20 mg/mL卡那霉素、LB固體培養(yǎng)基、0.1mol/L CaCl2實(shí)驗(yàn)材料2022/7/2914四、實(shí)驗(yàn)步驟1、受體菌的培養(yǎng)將DH5細(xì)菌接種在LB平板上，37 C培養(yǎng)過夜。從LB平板上挑取新活化

6、的E. coli DH5單菌落，接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中，37 C下振蕩培養(yǎng)12小時左右，直至對數(shù)生長期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37 C振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600 0.5左右。（搖瓶對比）實(shí)驗(yàn)步驟2022/7/29152、感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaCl2法）將培養(yǎng)液（10 mL）轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置10分鐘，然后于4 C下3000 g離心5分鐘。棄去上清，用預(yù)冷的0.1 mol/L的CaCl2 溶液2 mL輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置15分鐘后，4 C下3000 g離心10分鐘。棄去上清，加入0.5mL預(yù)冷0.1mol/L的CaCl2

7、溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置5分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。感受態(tài)細(xì)胞分裝成200 L的小份，貯存于-70 C可保存半年。（本次不分裝，下一步取20 L ）實(shí)驗(yàn)步驟2022/7/29163、轉(zhuǎn)化從-70 C冰箱中取20 L感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。加入質(zhì)粒DNA溶液(含量5-50ng，體積2L)，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后。 同時做受體菌對照管： 20L感受態(tài)細(xì)胞 + 2L無菌水42 C水浴中熱擊90秒。實(shí)驗(yàn)步驟2022/7/2917熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。 向管中加入100 L LB液體培養(yǎng)基(不含Kana)，混勻后37 C振蕩培養(yǎng)30分鐘，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長

8、狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Kana)。 將上述菌液搖勻后取30 L 涂布于含Kana的篩選平板上，待菌液完全被吸收后倒置培養(yǎng)皿，37 C培養(yǎng)16-24小時。（第二天老師統(tǒng)一觀察拍照）實(shí)驗(yàn)步驟注意：本實(shí)驗(yàn)中將采用兩種感受態(tài)細(xì)胞，一種為自制感受態(tài)細(xì)胞，一種為購買的感受態(tài)細(xì)胞。涂板時用已滅菌的EP管圓頭代替涂布棒進(jìn)行涂布，將菌液均勻涂布。（參見視頻）2022/7/2918自制感受態(tài)細(xì)胞質(zhì)粒自制感受態(tài)細(xì)胞無菌水購買感受態(tài)細(xì)胞質(zhì)粒購買感受態(tài)細(xì)胞無菌水倒板：從助教老師處取兩管培養(yǎng)基。將Kana迅速加入培養(yǎng)基中，每管加入12uL卡那霉素。蓋上蓋子后，上下輕輕混勻2次。于酒精燈下，將培養(yǎng)基倒入平板

9、中，迅速蓋上蓋子，輕輕于桌面搖勻，靜置，待培養(yǎng)基變成固體。于培養(yǎng)皿上標(biāo)記。注意：質(zhì)粒，市售感受態(tài)細(xì)胞，LB培養(yǎng)基，滅菌水和滅菌EP管到助教老師處領(lǐng)取。2022/7/29192022/7/2920五、注意事項(xiàng)1、細(xì)胞生長狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于 C的培養(yǎng)菌，最好從70 C或-20 C甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5菌株的OD600為0.5時，細(xì)胞密度在5107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。注意事項(xiàng)2022/7/29212、質(zhì)粒的

10、質(zhì)量和濃度：轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒應(yīng)主要是超螺旋DNA。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時，轉(zhuǎn)化效率就會降低。3、試劑的質(zhì)量：所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的（GR.或AR.），并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。注意事項(xiàng)2022/7/29224、防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行所用器皿，如離心管，tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理，所有的試劑都要滅菌注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。注意事項(xiàng)2022/7/2923六、問題與討論CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞的原理。影響CaCl2法轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素有哪些？如何提高轉(zhuǎn)化率？涂布菌液時應(yīng)注意什么？感受態(tài)細(xì)胞有何特點(diǎn)？如何保證它的質(zhì)量？如陰性對照中長出菌，原因？還有哪些方法可以將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞？各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)討論20