食品微生物8微生物分離、純化與保藏技術(shù)課件

1、8 微生物分離、純化與保藏技術(shù)8.1 微生物菌種的分離純化模塊二：微生物檢驗基礎(chǔ)技能訓練食品微生物（1）學習并掌握微生物分離純化的原理和分離純化的技術(shù)。（2）學習從樣品中分離、純化出所需菌株。第一節(jié) 微生物菌種的分離純化一、實訓目的：微生物分離、純化與保藏技術(shù)二、實訓原理分離純化技術(shù)是微生物學中重要的基本技術(shù)之一。分離純化：從混雜的微生物群體中獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法。純種（純培養(yǎng)）：一株菌種或一個培養(yǎng)物中所有的細胞或孢子都是由一個細胞分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代。微生物的分離與純化技術(shù)的應用：分離具有特殊功能的微生物、優(yōu)良菌種及純化被污染的菌種等。微生物菌種的分離純化三、實驗材料樣品：細菌：大腸桿

2、菌，金黃色葡萄球菌放線菌：細黃鏈霉素酵母菌：啤酒酵母霉菌;黑曲霉培養(yǎng)基：普通瓊脂斜面和平板，營養(yǎng)肉湯儀器與用具：接種環(huán)、接種針、試管架、酒精燈、記號筆、標簽、火柴、滅菌培養(yǎng)皿、無菌水、菌種等。微生物菌種的分離純化取樣制備稀釋液分離四、實訓方法與步驟0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml微生物菌種的分離純化1、傾注平板法分離：注意培養(yǎng)基溫度，混合均勻先加菌微生物菌種的分離純化2、涂布分離法分離：微生物菌種的分離純化1.斜線法 2.曲線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法 1) 倒平板，標記培養(yǎng)基名稱，編號和實驗日期。 2）劃線方法3、平板劃線法微生物菌

3、種的分離純化利用選擇培養(yǎng)基創(chuàng)造只讓所需微生物生長的條件，所需微生物有效地與其他微生物競爭，在生長能力方面遠遠超過其他微生物。所創(chuàng)造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。經(jīng)過多次重復移種，最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。如分離專性寄生菌，須把樣品接種到相應敏感宿主細胞群中，使其大量生長。多次重復移種便可得到純的寄生菌。 4、富集分離法微生物菌種的分離純化利用裝原培養(yǎng)基的試管作培養(yǎng)容器，在沸水浴中加熱數(shù)分鐘，逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。快速冷卻，并進行接種。加入無菌的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕?；蛟诮臃N后，用N2或CO2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上

4、試管口密封。為了更有效地分離某些厭氧菌，可把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。、厭氧法微生物菌種的分離純化五、實訓結(jié)果第一節(jié) 微生物菌種的分離純化（一）菌落觀察菌落大小形狀表面邊緣濕潤度透明度色素菌名菌落1菌落2菌落3菌落4菌落51、微生物菌落特征 1）肉眼觀察 2）細致區(qū)分還要用顯微鏡，觀察細菌形態(tài)。菌落濕潤，正反面顏色一致 干燥，正反、中央與邊緣 小、扁平或隆起 大、扁平或隆起 小、而致密 大、疏松、顏色不一致 細菌 酵母菌 霉菌 放線菌 微生物常規(guī)鑒定、篩選2、微生物生理生化反應 第二節(jié) 微生物常規(guī)鑒定、篩選1）營養(yǎng)要求：采用選擇培養(yǎng)基2）酶：產(chǎn)酶種

5、類和反應特性3）代謝產(chǎn)物：種類，產(chǎn)量，顯色反應等（二）微生物常規(guī)鑒定思考與討論 微生物菌種的分離純化1如何確定平板上某單個菌落是否為純培養(yǎng)？2. 接種環(huán)（針）接種前后燒灼的目的是什么？為什么在接種前一定要將其冷卻？如何判斷燒灼過的接種環(huán)已冷卻？廣東食品藥品職業(yè)學院食品科學系8 微生物分離、純化與保藏技術(shù)8.2 微生物菌種的保藏模塊二：微生物檢驗基礎(chǔ)技能訓練菌種的保藏與菌種管理菌種退化：菌種在自發(fā)突變的影響下，引起某些優(yōu)良特性降低或喪失的現(xiàn)象。生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少；抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力下降；菌種衰退原因：基因突變一、菌種退化菌種保藏與復壯工作:

6、為菌種創(chuàng)造良好條件，減緩菌種衰退菌種退化：菌種在自發(fā)突變的影響下，引起某些優(yōu)良特性降低或喪失的現(xiàn)象。菌種衰退原因：基因突變一、菌種退化菌落和細胞形態(tài)的改變； 生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少；抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力下降； 菌種保藏與復壯工作:為菌種創(chuàng)造良好條件，減緩菌種衰退菌種的保藏與菌種管理二、菌種的復壯(一)菌種的提純(二)通過寄主體進行復壯 (三)淘汰已衰退的個體 菌種的保藏與菌種管理(一)菌種的提純 從已衰退的菌種中，通過分離純化，將尚未退化的個體分離出來，以恢復和建立具有原來生產(chǎn)性狀的群體，繼續(xù)供科研及生產(chǎn)使用。菌種提純：只要求達到菌落純化的水平

7、，通過稀釋平板法、劃線法、表面涂血法等常規(guī)操作法，適用于退化不太嚴重的情況。要求達到“細胞純”的水平，采用單胞分離法，也可二者結(jié)合，先用前一種方法獲得較純的菌種后再采用單胞分離法進一步純化。菌種的保藏與菌種管理(二)通過寄主體進行復壯 對于寄生性微生物如蘇云金桿菌、白僵菌、多角體病毒等，由于長期使用，其毒力下降，導致殺蟲效率降低及衰退現(xiàn)象?？梢杂镁N去感染菜青蟲幼蟲等，然后從致死的蟲體上重新分離，經(jīng)過幾次重復感染與分離，就可以逐步恢復和提高毒力。 菌種的保藏與菌種管理(三)淘汰已衰退的個體通過物理、化學的方法處理菌體(或孢子)，使大部分死亡(80%以上)，存活的菌多為生長健壯者，可從中選出優(yōu)良

8、菌種來。菌種的保藏與菌種管理三、菌種保藏菌種保藏：是使微生物種子經(jīng)過長時間保存后，盡可能保持其原來性狀和活力不變，不死亡、不污染（一）菌種保藏的目的保持其原有性狀和活力的穩(wěn)定；確保菌種不死亡、不變異、不被污染；菌種的保藏與菌種管理保藏菌種的選?。哼x取優(yōu)良的純菌種，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠體，在其休眠和停止生長的條件下保藏。根據(jù)菌種的生理、生化特點，人為地創(chuàng)造低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)條件，使菌種的代謝活動和生長繁殖處于受抑制的休眠狀態(tài)。（二）菌種保藏依據(jù)：菌種的保藏與菌種管理(三)菌種保藏方法：斜面低溫保藏法 砂土管保藏法石蠟油封藏法冷凍真空干燥保藏法濾紙保藏法甘油懸液保藏法液氮超低溫保

9、存菌種的保藏與菌種管理1.斜面低溫保藏法常用保藏法菌種接種斜面培養(yǎng)基生長健壯的菌種4左右的冰箱中保藏定期移植至新培養(yǎng)基繼續(xù)保藏適用菌種的短期保藏一般可保存16個月左右。特點(三)菌種保藏方法：菌種的保藏與菌種管理簡便易行容易推廣存活率高；優(yōu)點:保藏期短傳代次數(shù)多易發(fā)生變異易被污染缺點:一些貴重菌株及生產(chǎn)優(yōu)良菌株不宜用此法保藏。(三)菌種保藏方法：菌種的保藏與菌種管理沙土管的準備：河(海)沙過24目篩，10鹽酸浸泡24h，去鹽酸，水沖洗至pH中性，去水烘干或曬干。取菜果園土粉碎過篩，烘干。沙土按3：2或1：1混合裝入指形管或高100mm，直徑為10mm的小試管，高約1cm(約2g)，塞棉塞121

10、濕熱滅菌1h，也可1702h干熱滅菌(或蒸汽三次間歇滅菌)，烘干。經(jīng)肉湯檢查確實證明無菌即可使用。2、沙土管保藏法(三)菌種保藏方法：菌種的保藏與菌種管理菌種斜面產(chǎn)孢孢子懸浮液（106/ml ）加入沙土管（ 0.30.5ml/管）減壓干燥密封4低溫保藏沙土管保藏流程：(三)菌種保藏方法：菌種的保藏與菌種管理砂土管保藏法的特點包藏初期，菌死亡率高，后逐漸減慢，存活下來的孢子在以后保存期間穩(wěn)定性較好。(三)菌種保藏方法：適用于產(chǎn)孢子的微生物及形成芽孢的細菌對于一些對干燥敏感的細菌及酵母則不適用。菌種的保藏與菌種管理砂土管保藏法的優(yōu)點具低溫、干燥、隔氧和少營養(yǎng)物等條件保藏期較長、效果較好。某些抗生素

11、產(chǎn)生菌保藏期可達18年(土霉素和鏈霉素產(chǎn)生菌)到22年(新霉素產(chǎn)生菌)，但對利福霉素、卡那霉素、四環(huán)素等容易產(chǎn)生變異的菌種，就不適合作長期的沙土管保存。微生物移接方便，經(jīng)濟簡便。(三)菌種保藏方法：菌種的保藏與菌種管理3、礦油保藏法（石蠟油低溫保藏法） 長好的斜面菌覆蓋滅菌液體石蠟 菌體與空氣隔絕 直立保藏于-44低溫或室溫注意事項：斜面培養(yǎng)菌種，斜面不宜過長；純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油，置三角燒瓶經(jīng)121高壓蒸汽滅菌12h，放烘箱中(160左右)干熱處理，除滅菌時滲入水分，待石蠟油變清澈透明后冷卻即可加入斜面，斜面上不能出現(xiàn)氣泡，液蠟添加量以高出斜面頂部約1cm左右為宜。(三)菌種保藏方法：菌種的保藏與

12、菌種管理礦油保藏法特點：適用于各大類不產(chǎn)孢子的微生物菌種的中期保藏不適用于能分解烴類的菌種的保藏。主要保藏措施是低溫、阻氧。一般可保存12年左右。(三)菌種保藏方法：菌種的保藏與菌種管理4、真空冷凍干燥法 低溫下快速將細胞凍結(jié)，然后在真空條件下干燥、封裝，隔絕空氣，微生物的生長和酶活動停止。達到長期保藏的目(三)菌種保藏方法：菌種的保藏與菌種管理真空冷凍干燥法優(yōu)點：具低溫、干燥、除氧主要因素，適用于除絲狀真菌的菌絲體外的其它各類微生物。菌種存活時間長、效果好，一般可保存5年以上，有的可保藏15年以上不發(fā)生變異。體積小、不易污染、便于運輸，為最廣泛的菌種保藏法。(三)菌種保藏方法：凍干保藏的效果

13、因微生物種類而異，一般是細菌放線菌真菌藻類，而菌絲體不宜用此法保存。菌種的保藏與菌種管理冷凍真空干燥操作流程安培瓶配制保護劑滅菌菌種培養(yǎng)制備菌懸液分裝安培瓶洗凈烘干裝標簽滅菌預凍真空干燥測定水分熔封管口檢查真空度保藏無菌血清或脫脂牛乳-40冰箱速凍結(jié)2060min1%3%5、濾紙保藏法 方法：3#濾紙剪成5mm50mm小條，放入干燥培養(yǎng)皿中滅菌。將培養(yǎng)好的菌種用滅菌脫脂乳或奶粉復原乳制成孢子懸液，用滅菌鑷子將滅菌濾紙條在滅菌操作下浸入菌懸液，充分吸附菌細胞，取出后放入滅菌小試管或安瓿管中，在真空干燥機上抽干，真空條件下火焰熔封，冷藏將要保藏微生物細胞或孢子吸附在滅菌濾紙上，干燥后冷藏。(三)菌種保藏方法：菌種的保藏與菌種管理不同的保存方法都有一定的不足，因此，盡量同時用多種方法保存(三)菌種保藏方法：菌種的保藏與菌種管理（四）微生物的保藏機構(gòu)中國微生物菌種保藏委員會(CCCCM)中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)美國典型菌種保藏中心(ATCC)荷蘭霉菌中心保藏所(CBS)英國國