《代謝控制發(fā)酵》考試試卷及答案說課講解

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。代謝控制發(fā)酵考試試卷及答案-20032004年度生物工程專業(yè)代謝控制發(fā)酵考試試卷及答案（2004年6月）班級姓名得分名詞解釋（20分）：Catabolitrepression(2分)分解代謝物阻遏：在培養(yǎng)基中有多種營養(yǎng)物質(zhì)時，微生物先選擇利用易分解利用的營養(yǎng)物質(zhì)，而這種營養(yǎng)物質(zhì)的分解，對分解利用其它營養(yǎng)物物質(zhì)所需酶的合成起阻遏作用。其實質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)cAMP少了。2Pasteureffect(2分)巴斯德效應(yīng)：微生物細(xì)胞的有氧呼吸抑制了發(fā)酵作用。酵母發(fā)酵酒精時，由于供氧使TCA循環(huán)加快，ATP增加，細(xì)胞內(nèi)能

2、荷增大，反饋抑制和阻遏EMP途徑中關(guān)鍵酶FPK酶，使酒精產(chǎn)量下降。3.Energycharge(2分)能荷：是細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)的一個認(rèn)為假設(shè)參數(shù)，指細(xì)胞內(nèi)含有的核苷酸中相當(dāng)于ATP的數(shù)量百分比。能荷ATP1/2ADP/ATPADPAMP100%4.Concertedfeedbackinhibition協(xié)同反饋抑制：在代謝途徑中，會產(chǎn)生兩個以上的代謝產(chǎn)物，任何一種代謝產(chǎn)物的積累都不會對代謝途徑的第一步反應(yīng)得酶起抑制作用，只有當(dāng)代謝產(chǎn)物同時過量積累時，才會對代謝途徑的第一步反應(yīng)得酶起抑制作用。5.Cooperte(synergistic)feedbackinhibition增效性反饋抑制：在代謝途徑

3、中，每種代謝產(chǎn)物只能單獨地、部分地抑制第一步反應(yīng)的酶。當(dāng)它們均過量積累時，對反應(yīng)第一步酶起強烈的抑制作用。此時，抑制作用大于兩種代謝產(chǎn)物單獨抑制作用之和。6.Metabolicinterlock代謝互鎖：在代謝途徑中，前端反應(yīng)的酶受到與其看似無關(guān)的代謝產(chǎn)物的抑制（阻遏）作用。7.Analogue-resistentmutant抗代謝結(jié)構(gòu)類似物突變株：對于代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似物的抗性突變株。代謝產(chǎn)物對代謝途徑有抑制（阻遏作用），使其酶不能合成，而代謝結(jié)構(gòu)類似物存在時，與代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似，起相同作用，使反應(yīng)的酶無法合成，但結(jié)構(gòu)類似物并不減少（因為它不參與蛋白質(zhì)代謝）。其抗性菌株就是在代謝結(jié)構(gòu)類似物存

4、在的情況下，仍能合成代謝產(chǎn)物，使產(chǎn)物大量積累。8.Antigencarrierlipid(ACL)抗原載體脂(antigencarrierlipid)簡稱ACL。它是細(xì)菌萜醇，其結(jié)構(gòu)式為：含有11個異戊二烯單位的醇。ACL存在于細(xì)胞膜上，它的長長的非極性烴鏈插在脂肪質(zhì)雙分子層的非極性區(qū)，而分子的極性末端（磷酸根一端）則是游離狀態(tài)，作為細(xì)胞質(zhì)水相中的多糖裝配單位的受體，并且象手臂一樣把它共價結(jié)合著，已在細(xì)菌胞膜內(nèi)側(cè)形成的多糖單位轉(zhuǎn)運到膜的外面，組成肽聚糖脂多糖等細(xì)胞表層的聚糖復(fù)合物。9.Preferencedsynthsis2、優(yōu)先合成與平衡合成cabABCDEFG優(yōu)先合成：代謝途徑中，產(chǎn)生E,

5、G兩種代謝產(chǎn)物。酶a的活性大于酶b。所以優(yōu)先合成E。E積累后，酶a活性受抑制，C流向G，G積累后又抑制了酶c。填空（10分）每空白點2.5分。在下列營養(yǎng)條件下填寫E.coli的乳酸操縱子的表達(dá)方式：當(dāng)無葡萄糖、細(xì)胞cAMP水平高、又無乳糖時，不表達(dá)。當(dāng)無葡萄糖、細(xì)胞cAMP水平高、有乳糖時，大量表達(dá)。當(dāng)有葡萄糖、細(xì)胞cAMP水平高、又無乳糖時，不表達(dá)。當(dāng)有葡萄糖、細(xì)胞cAMP水平高、有乳糖時，少量表達(dá)。畫圖并簡述（30分）1、原核生物細(xì)胞和真核生物細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)的部位。（6分）圖21原核微生物細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)部位（模式圖）1-可溶性營養(yǎng)物質(zhì)或代謝產(chǎn)物的跨膜傳送2-代謝途徑的酶催化作用3-酶和載體蛋

6、白的合成圖22真核微生物細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)部位1-可溶性營養(yǎng)物質(zhì)或代謝產(chǎn)物的跨膜傳送2-代謝途徑的酶的催化3-核中進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄4-細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的翻譯5-細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的跨膜傳送2、阿拉伯糖對E.coli利用阿拉伯糖的酶系合成的誘導(dǎo)機制（10分）圖2-12阿拉伯糖對ara操縱子araC位點的調(diào)控作用當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞以阿拉伯糖作為生長所需碳源和能源時，它們產(chǎn)生三種將阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的酶。321L-AraL-RuL-Ru-5-eqoac(,P)D-Xu-5-eqoac(,P)1L-阿拉伯糖異構(gòu)酶2核酮糖酸酶35-eqoac(,P)核酮糖差向異構(gòu)酶它們分別是三個基因（B.A.D）編碼的產(chǎn)物。這三個基因在E.c

7、oli中是屬于阿拉伯糖操縱子中的一個基因簇，稱為araB.A.D，另外兩個基因araE和araF位于基因簇araB.A.D遠(yuǎn)離的地方，負(fù)責(zé)阿拉伯糖的跨膜運輸?shù)?，araE編碼一種膜蛋白，araF編碼一種位于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的阿拉伯糖結(jié)合蛋白。與araB.A.D相鄰的是一個復(fù)合的啟動子區(qū)和一個調(diào)節(jié)基因araC，這個調(diào)節(jié)基因的性質(zhì)和我們前邊介紹Lac.operon中的調(diào)節(jié)基因性質(zhì)全然不同。araC的蛋白同時顯示正、負(fù)調(diào)節(jié)因子的功能。3、普通酶和變構(gòu)酶反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)的不同。（6分）圖2-32變構(gòu)酶的典型動力學(xué)曲線ATCase的反應(yīng)動力學(xué)曲線如下：eqoac(,1)Asp和CTP對ATCase酶的激活

8、和抑制作用從S形曲線上可知，都有一個閾值，即Asp濃度超過某個閾值時才顯示抑制作用。eqoac(,2)隨Asp濃度的增加，ATC酶與底物的親和力協(xié)同性增大。eqoac(,3)半飽和（飽和速度的一半）所需底物濃度因CTP的存在而增加。eqoac(,4)CTP能抑制ATC酶活性，但不能全部抑制，增加Asp濃度可以恢復(fù)酶的全部活力，這說明CTP與底物是分別與酶結(jié)合，而不是競爭同一個活性中心。eqoac(,5)底物濃度飽和而達(dá)到最大反應(yīng)速度Vmax時，不受抑制劑的影響，即當(dāng)顯著提高底物濃度時，看不到抑制作用。簡述細(xì)菌二元調(diào)節(jié)系統(tǒng)（信號傳導(dǎo)）如何調(diào)控基因表達(dá)？（8分）eqoac(,1)位于細(xì)胞質(zhì)膜上的傳

9、感蛋白（sensorprotein）該蛋白質(zhì)具有激酶活性，又稱傳感激酶。eqoac(,2)應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（responseregulatorprotein）位于細(xì)胞質(zhì)中。傳感激酶在與膜外環(huán)境的信號反應(yīng)過程中本身磷酸化，磷?；虮晦D(zhuǎn)移到應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白上。磷酸化的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白即成為阻遏蛋白，該阻遏蛋白再通過操縱子的阻遏作用進(jìn)行調(diào)節(jié)控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。請論述和回答（40分）如果你分離到一株啤酒酵母，其生長速率是已知生產(chǎn)菌株的二倍，因此你將其用于生產(chǎn)酒精的試驗，但結(jié)果表明，該酵母菌株發(fā)酵葡萄糖的產(chǎn)物是酒精和其他產(chǎn)物的混合物，并且酒精的產(chǎn)量只有現(xiàn)有生產(chǎn)菌株的50%。請你根據(jù)本課程所學(xué)過的知識、并結(jié)合微生物學(xué)

10、、微生物遺傳學(xué)等有關(guān)知識，簡要寫出你將打算如何改進(jìn)你新分離酵母菌株，使其優(yōu)于現(xiàn)有的生產(chǎn)菌株的方案？（10分）答：呼吸抑制發(fā)酵在低糖0.2%酵母比生長速率0.1/h時，還是進(jìn)行呼吸和生長的，而使其生長速率大大提高，因此可以篩選呼吸缺陷型突變株。分離獲得的啤酒酵母活化接一環(huán)，30培養(yǎng)24h，5mL酵母完全培養(yǎng)基YEPD30，16h，5mL酵母完全培養(yǎng)基YEPD，對數(shù)生長期1mL適當(dāng)稀釋100個菌落/平板0.1mLYEPD溴化乙吖啶黃2030g/mL處理，致死率達(dá)99%，突變頻率為10-3左右YEPD平板上挑選小酵母菌落含有三苯基四氮唑鹽（TTC）和YEPD平板上挑選白色小菌落（正常的和呼吸強的酵母

11、菌，因有細(xì)胞色素酶可還原TTC使菌落變紅，而呼吸缺陷型突變株，不能還原TTC使菌落不變色為白色）含甘油培養(yǎng)基平板上（不長），YEPD平板（長出菌落）再進(jìn)行酒精發(fā)酵挑選高產(chǎn)菌株論述代謝控制發(fā)酵的基本思想（路）。（10分）答：(1)黑曲霉生物合成檸檬酸機制圖3-11黑曲霉自蔗糖生物合成檸檬酸代謝調(diào)節(jié)圖（2）代謝控制育種eqoac(,1)耐高糖、耐高濃度葡萄糖、a-脫氧葡萄糖R。eqoac(,2)耐高檸檬酸且不利用檸檬酸。eqoac(,3)抗Mn、Zn、Fe等金屬離子的突變株。eqoac(,4)抗SHAMr突變株，增加倒呼吸鏈解除高濃度的ATP的PFK反饋抑制。eqoac(,5)在葡萄糖為唯一碳源上

12、孢子長得少的HMP代謝流減弱。eqoac(,6)挑選形成菌球體系多而小的突變株。eqoac(,7)耐高溫突變株。（3）發(fā)酵條件eqoac(,1)溫度35370Ceqoac(,2)嚴(yán)格控制培養(yǎng)基中的Mn、Zn、Fe，我國的菌株是金屬離子抗性突變株，無需控制。eqoac(,3)控制低P。eqoac(,4)氮源、蛋白質(zhì)量控制在0.45%,適量補充(NH4)2SO4eqoac(,5)控制前期長菌pH4.0左右,后期產(chǎn)酸pH2.0以下。eqoac(,6)溶解氧要高（溶氧分壓90%滿足率）試設(shè)計篩選高產(chǎn)L-賴氨酸的科研方案（包括出發(fā)菌株的選擇、生物合成途徑的調(diào)節(jié)機制、遺傳標(biāo)記的篩選、發(fā)酵條件的控制等）。（

13、20分）答：1.切斷或減弱支路代謝切斷支路代謝，Hom-或Met-+Thr-。（北微所AS1.299-Hom-As1563,1568,2.5%;上微所黃色短桿菌2305-Hom-H-2,3%;日本黃色短桿菌No2247-Hom-H1013,4.2%）變換優(yōu)先合成NTG降低HD酶活性eqoac(,1)增強代謝流轉(zhuǎn)向合成Lyseqoac(,2)Hom減少，Thr合成減少，解降Thr+Lys的協(xié)同反饋抑制。例：日本.黃色短桿菌No2247獲得一批Thrs,Mets突變株，其中一株所產(chǎn)25g/L（2.5%），此突變株HD僅為野生菌株的1/30。這樣低的HD酶比活性下，不添加Thr和Met也能生長，但若

14、單獨過量添加一種Thr和Met，反而由于過剩的Thr或Met能以致或阻遏本來活力已經(jīng)很低的HD，使Thr和Met合成不足而抑制生長，即呈現(xiàn)Thrs或Mets2.解除反饋調(diào)節(jié)選育抗結(jié)構(gòu)類似物突變株Lys的結(jié)構(gòu)類似物：S-2氨基乙基-L-半胱氨酸（簡稱AEC），-氯己內(nèi)酰胺（CCL）,-氟己內(nèi)酰胺（FCL）,苯酯基Lys（CBL）,甲基賴氨酸（ML），-氨基月桂基內(nèi)酰胺（ALL）,青霉素，桿菌素等。Thr的結(jié)構(gòu)類似物：-氨基-羥基戊酸（AHr）,鄰甲基蘇氨酸（OMT）等Leu結(jié)構(gòu)類似物：-噻唑丙氨酸（-TA）等(1)解除AK酶的反饋調(diào)節(jié)ThrHxr、Allr、AECr、LysHxr、AHVr、ML

15、r、CCLr、CBLr等。(2)解除PS酶的代謝調(diào)節(jié)解除代謝互鎖eqoac(,1)Leu-Naa-Leuleqoac(,2)S-Leur2-TarLeuHxreqoac(,3)苯醌s、喹啉s是Leu合成酶（或某酶）抑制劑3.增加前體Asp反饋抑制（調(diào)節(jié)）并不意味著完全阻止合成反應(yīng)，通過受控制反應(yīng)物的底物積累能拮抗性地克服這種抑制，關(guān)鍵酶AK所催化的底物Asp，AK酶的反應(yīng)速度與底物Asp濃度間的關(guān)系曲線呈S型，隨著Asp的增多，AK酶和Asp親和力協(xié)同性的增大，根據(jù)變構(gòu)酶S型動力學(xué)性質(zhì)，存在底物對反應(yīng)速度發(fā)生影響的閾值，Asp既是反應(yīng)底物，又是反應(yīng)的激活劑，必須控制在閾值以上。當(dāng)濃度飽和而達(dá)到

16、最大反應(yīng)速度時，就不在受反饋抑制，因此為了高產(chǎn)Lys應(yīng)設(shè)法增加前體物Asp濃度以抵消抑制物的影響。（1）選育丙氨酸（Ala-）缺陷（2）選育Asp結(jié)構(gòu)類似物抗性，AspHxr（3）設(shè)法增強PC酶活性eqoac(,1)采用200-500g生物素/mL激活PC酶eqoac(,2)選擇在琥珀酸為唯一碳源生長快速的突變株。FPseqoac(,3)選擇丙酮酸激酶缺陷FPseqoac(,4)檸檬酸合成酶活性降低eqoac(,5)用乙酰CoA激活PC酶（因為乙酰CoA與Asp之間存在平衡合成）eqoac(,6)采用低糖（4-5%）添加方法可激活PC酶（4）設(shè)法增加（強化）Glu的反饋控制，使Glu優(yōu)先合成4

17、.選育溫度敏感突變株選育溫度敏感突變株也應(yīng)是Lys發(fā)酵代謝控制育種的有效途徑。其突變位置發(fā)生在亮氨酸合成酶系，高絲氨酸脫氫酶或丙酮酸-L-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶編碼的基因中，均有利于積累Lys。缺陷型。日本戶扳修等人，以乳糖發(fā)酵短桿菌AJll082(AECR+CCLR+A1a-)為出發(fā)菌株，30下250g/mLMNNG誘變處理30分鐘，分離選育30下生長良好，而在34不能生長的溫度敏感突變株乳糖發(fā)酵短桿菌AJll093(AECR+CCLR+A1a-+tems)。同法從已獲得谷氨酸棒桿菌AJ109043株(AECR+A1a-)誘變選育AJl099(AECR+A1a-+tems)，這兩株菌都是34以上高溫培

18、養(yǎng)時表現(xiàn)為Leu-，添加2.5mg/mLLeu可恢復(fù)正常生長，使用此兩株溫度敏感突變株29-30培養(yǎng)，發(fā)酵24-48小時期間將溫度提高到34以上，抑制菌體多余生長，并解除了Leu對PS酶的反饋阻遏，解除代謝互鎖，結(jié)果兩株菌分別積累賴氨酸45g/L和39g/L，對糖轉(zhuǎn)化率分別為45和39。5.Lys生產(chǎn)菌株的定向選育標(biāo)記以谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌、北京棒桿菌、鈍齒棒桿菌等Glu生產(chǎn)菌株為出發(fā)菌，通過誘變定向選育獲得遺傳標(biāo)記應(yīng)為：Hom-+A1a-+AECR+CCLR+CBLR+AspHxR+Leu-+TAR+Thr-+Met-+tems例如：乳糖發(fā)酵短桿菌AJ11274Lys菌株選育過程如下乳糖

19、發(fā)酵短桿菌AJ1511野生型產(chǎn)Lys0AJ3445AECR產(chǎn)Lys11.6g/LAJ3424AECR+A1a-產(chǎn)Lys33g/LAJ3796AECR+A1a-+CCLR產(chǎn)Lys39g/LAJ3991AECR+A1a-+CCLR+MLR產(chǎn)Lys43g/LAJ11274AECR+A1a-+CCLR+MLR+FPs產(chǎn)Lys48g/L（四）細(xì)胞融合選育高產(chǎn)Lys菌株蛋白胨1%、酵母1%NaCl0.5%、蔗糖0.5%PH7.0、31.5Glu產(chǎn)生菌AJ11638DECr（德夸香素）KMr（酮丙二酸r）LogphasecellALys產(chǎn)生菌AJ11082（低葡萄糖消耗速率）AECr、CLLr、MLr、FPs、L-Ala-LogphasecellB0.3g/mLPenicilian（31，90分鐘）Centrifugation收集菌體，高滲洗滌后，懸浮于高滲溶液中300g/mLLysozyme（31.5靜止21h）ProtoplantAProtoplantB等量混合centrifugationResuspensioninhypertonicsolution（pH10.5,0.1MCaCl2）33%PEG6000+0.1MCaCl處理36，15min進(jìn)行融合，融合反應(yīng)液離心后，收集