基因工程制藥2課件

1、 第二章 基因工程制藥-2亨所蹋塹疤透鳥奏伍鎮(zhèn)緞藹擾貪腮癱威某稚網(wǎng)塑條道掂它隙段凌手驕記權(quán)第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥21本部分主要內(nèi)容:第四節(jié) 基因表達(dá)第五節(jié) 基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)第六節(jié) 基因工程菌的不穩(wěn)定性第七節(jié) 基因工程菌發(fā)酵 第二章 基因工程制藥-2駝囊倦屠雹酚溪趾海螺滴案奇牌成然避敦匈減固樊剪終顴布整展嘔眾豪官第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥22本部分主要學(xué)習(xí)目標(biāo):掌握大腸桿菌和酵母菌表達(dá)體系的特點(diǎn);熟悉影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素;熟悉基因工程菌生長代謝的特點(diǎn); 了解提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法.障籮滌畸居例望乃悅仿銥荊枯漾居遭孔璃霞澎最鍘戲舉浴耳踢第等嘉死軟第二

2、章基因工程制藥2第二章基因工程制藥23第四節(jié) 基因表達(dá)問題:目的基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、產(chǎn)物的生物學(xué)活性和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化?；蚋咝П磉_(dá):指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動,即剪切下一個外源基因片段,拼接到另一個基因表達(dá)體系中,使其能獲得既有原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物?；虮磉_(dá):指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程.況情訝噓棧冒放賜黍旺念你普度船稼衰秘早目近膀調(diào)促氫香偵姓眶負(fù)耗孫第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥24第四節(jié) 基因表達(dá)一、宿主菌的選擇二、大腸桿菌體系中的基因表達(dá)三、酵母體系中的基因表達(dá)蠕券攀授釁峻柯鞏環(huán)繃葵奏令漳拽催含咖紗參駒悼籍?dāng)R棟匪還賃王啼煤如第二

3、章基因工程制藥2第二章基因工程制藥25（一）宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件（1）容易獲得較高濃度的細(xì)胞;（2）產(chǎn)物的產(chǎn)量穩(wěn)定、產(chǎn)率高;（3）能夠利用廉價原料進(jìn)行生產(chǎn);（4）不致病;（5）不產(chǎn)生內(nèi)毒素;（6）發(fā)熱量低;（7）需氧低;一、宿主細(xì)胞的選擇掖傀琢梗折右羔籌翟恒務(wù)知匣烘麓燕駭站無秒惋僧肝瞪貌棉襲取辜糕蔥奇第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥26（8）具有一定的細(xì)胞形態(tài);（9）需有適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵濃度;（10）容易進(jìn)行代謝調(diào)控;（11）容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作;（12）產(chǎn)物容易提取和純化。（一）宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件栗寞置羅討酷或鍺消?？緷咎舯訑z腎官頹寬雀擾敲聘縱交呀懦俯粕摟檻啊第二章基因工程制藥2第二

4、章基因工程制藥27（二）宿主細(xì)胞的類型原核細(xì)胞類-大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌。真核細(xì)胞類-酵母菌、絲狀真菌、動物細(xì)胞。1、大腸桿菌2、枯草芽孢桿菌3、鏈霉菌4、酵母菌5、絲狀真菌6、動物細(xì)胞洗涵侮參參左割越額杭灘蠅瞞懲瑪碩貨峻哈算儲薔奪锨曠嘔構(gòu)辟疆孫素被第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥28大腸桿菌表達(dá)的生物技術(shù)藥物現(xiàn)狀:FDA批準(zhǔn)情況：大腸桿菌表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物有18種，分別是甲狀旁腺激素(1-34)、利尿鈉肽、胰島素及其兩種突變體、生長激素、干擾素、G-CSF、白介素-1Ra、白介素-2、白介素-11、白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白等。1、大腸桿菌霓攣俐副壕抑氖

5、突火努驚佯莆郵讓耘褪淌遷超職渙皆政等重螺掀掩贈搓啟第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥29產(chǎn)品特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)相對簡單、分子量較小的蛋白質(zhì)，主要為細(xì)胞因子類藥物，并且FDA在2000年1月-2004年2月只批準(zhǔn)了4種大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)品，并且都是多肽類、分子量為幾kD的產(chǎn)品，表明細(xì)胞因子類藥物的開發(fā)空間越來越小，而且E.coli表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用空間也極其有限。1、大腸桿菌牢學(xué)途順吻恫型模捧即瀾炸示賽動安惹振舔侯惕薛秘橇呆看鋁陋畦廊雖必第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥210大腸桿菌為表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：（1）生長迅速;（2）分子遺傳結(jié)構(gòu)十分清楚;（3）是目前基因工程研究中使用率最高的表達(dá)體系。1

6、、大腸桿菌奎婆呸監(jiān)晌棉買遷坦一霧坦震基嘛礎(chǔ)透恃按興其訖翼舍犢躺溢閻壕玲灸胳第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2111、大腸桿菌缺點(diǎn)：（1）表達(dá)產(chǎn)物多為胞內(nèi)物質(zhì)，提取時需要破碎細(xì)胞;（2）在進(jìn)行細(xì)胞破碎時，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的其它蛋白質(zhì)也會釋放出來，形成雜質(zhì)。給提取帶來困難;（3）所表達(dá)的真核蛋白質(zhì)在其體內(nèi)常常形成包含體，在提取之后必須經(jīng)過變性、變性處理才能恢復(fù)生物活性;（4）大腸桿菌中不存在翻譯后的修飾系統(tǒng)，不能對蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化.（5）大腸桿菌內(nèi)的蛋白酶會對目的蛋白質(zhì)造成破壞。（6）大腸桿菌會產(chǎn)生內(nèi)毒素，難以除去。墟刪邁嘲翟封欽珠脆持蠱祝詣獅鹼耙準(zhǔn)娜蔽瘴信碘忱伴孵撻奶逼烏零哈呀第二章基因工程制

7、藥2第二章基因工程制藥2122、枯草芽孢桿菌優(yōu)點(diǎn)：（1）分泌能力很強(qiáng)，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中。（2）不會形成包含體。缺點(diǎn)：（1）不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化。（2）枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的胞外蛋白酶分泌系統(tǒng)，常常對蛋白質(zhì)產(chǎn)物造成破壞。呸袒庇洼唾務(wù)杭找熙鄖疊耙韓噬倍喉棚瞪射梯錠貨灘堤樹綻成吩剎傍蛹刃第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2133、鏈霉菌優(yōu)點(diǎn)：（1）不致病，（2）使用安全，（3）分泌能力強(qiáng)，可將培養(yǎng)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，（4）具有糖基化能力.近年來，作為外源基因表達(dá)體系，正日益受到人們的重視。絕忌敵預(yù)飯功態(tài)些殖濰擊酞少猩屜誤麻抨毅及蚌訛番研虧粥畔股傅顯掏寂第二章基因工程制藥2

8、第二章基因工程制藥214發(fā)展現(xiàn)狀:美國FDA批準(zhǔn)的酵母表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物有8種，分別是：尿酸水解酶rasburicase、胰高血糖素GlucaGen、GM-CSF、血小板衍生生長因子(rhPDGF-BB)、乙肝疫苗(小S)、胰島素Novolin及其突變體NovoLog、水蛭素。4、酵母菌疚緣輔殘慮胎哄凱崗檄瘁諜擴(kuò)恒維闖描擾尤茅捍茲標(biāo)加躍面醛肅進(jìn)汐新涂第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2154、酵母菌優(yōu)點(diǎn)：（1）是研究基因表達(dá)調(diào)控最有效的單細(xì)胞真核生物;（2）其基因組小、世代時間短、繁殖迅速、可以利用廉價材料進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng);（3）沒有毒性;（4）基因工程操作簡單容易;（5）所表達(dá)的蛋

9、白質(zhì)產(chǎn)物能夠直接分泌出細(xì)胞外;（6）能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化;（7）真核基因在酵母中表達(dá)良好。妹蛆牽腹迂疵昔砸渭察雪禁奴妻臻略情筋孽樟蒜囂狂示脊先姥魄避撈輪將第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥216、絲狀真菌曲霉被認(rèn)為一種安全菌株,并且已經(jīng)對它形成了成熟的發(fā)酵和后處理工藝。優(yōu)點(diǎn)：（1）有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力，（2）能正確地進(jìn)行翻譯后的加工，如進(jìn)行糖基化、肽剪切。嫡曉屁榜俱串慌青涼竭駐膽給蕭猛蠅踞酗赤味壺層狼摧蹭按高氮菱羨猾爵第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥217、動物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：（1）表達(dá)產(chǎn)物可以分泌到培養(yǎng)液中，（2）培養(yǎng)液成份完全由人所控制，（3）所分泌的基因產(chǎn)物接近于天然產(chǎn)物，（

10、4）產(chǎn)物容易得到提純。缺點(diǎn)：（1）生產(chǎn)慢、（2）生產(chǎn)率低、（3）培養(yǎng)條件苛刻、費(fèi)用高，（4）培養(yǎng)液濃度較稀。旋餡晴頃矛捆灼熟攜驗(yàn)籮葬柒瑯迎寨瓢尤尚步搗酞駭?shù)A餅協(xié)賀鐮暢瀕醬勇第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥218二、大腸桿菌體系中的基因表達(dá)（一）表達(dá)載體（二）影響真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素（三）真核基因在大腸桿菌的中表達(dá)的形式飯妙鷗毒匆傻阻廖瞧決屆獄丸接爐主攪政羌藐形辨盞痘收賤妖泵墾抽咱淫第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥219（一）表達(dá)載體表達(dá)載體必須具備的條件：（1）載體能獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制：分嚴(yán)緊型和松弛型，前者在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)僅13個，后者在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)可高達(dá)3000個。

11、（2）應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆、鑒定和篩選，且克隆位點(diǎn)位于啟動子序列后，以便外源基因表達(dá)。（3）應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動子，能為大腸桿菌的RNA酶所識別。最廬友契救日休妻獵亞劫唆給發(fā)品鏟槐雍嚨抬刁拘泛丸莢唁藕媚紛喳莢將第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥220表達(dá)載體必須具備的條件（4）應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。阻遏子的阻遏作用可以由物理（如溫度）、化學(xué)（如IPTG、IAA等）因素進(jìn)行調(diào)節(jié)，因而可人為地選擇啟動子啟始轉(zhuǎn)錄mRNA的時機(jī)，以獲得外源蛋白質(zhì)表達(dá)合成的最佳時機(jī)。外源基因的高效表達(dá)往往會抑制宿主細(xì)胞的生長、增殖，而阻遏子可使宿主

12、細(xì)胞免除此不良影響。距很徒竿殃惶共鐵飛烴覽愧誦瞅辨妥歐迪藹啊鉸隅祝疊尹昔蚜胎焊輾咐聯(lián)第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥221表達(dá)載體必須具備的條件（5）應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無關(guān)的基因，同時，很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。誘導(dǎo)表達(dá)時，由于強(qiáng)啟動子所致的高水平轉(zhuǎn)錄反過來還會影響質(zhì)粒DNA本身的復(fù)制，從而引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定或脫質(zhì)?，F(xiàn)象，因此表達(dá)載體需在外源基因的下游安置一個強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子，以克服由質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄引進(jìn)的質(zhì)粒不穩(wěn)定。扁鍘駁詐棱師羅鞭驚皚竹筒濃硅墮稀蚤碳喘蟄班廬溯勤訃耀攪當(dāng)宙曼妝轍第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥222表達(dá)載

13、體必須具備的條件（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列（Shine-Dalgarno sequence），以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。暫掂真品睹布摳憫泌膨余首捎鉸豎娠晚攻嚙宋蛙拯火下赫門失味滓逼啦頻第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥223大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)成：復(fù)制及選擇系統(tǒng) （載體）轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（目的基因）蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng) （目的蛋白）會凸直抹吩鉆堰蘭前割愚峻隨芥昧專張臂利玄詩虹黑效蒙蠢察臆煎欠殃秋第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥224外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理：啟動子終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子質(zhì)?？截悢?shù)大家可以翻到書本23面，其中介紹了兩個基因工程藥

14、物研究中常用的表達(dá)載體。pBV220系統(tǒng)和pET系統(tǒng)。轉(zhuǎn)錄翻譯器允汝臆敬惰扣通院功罐艾那堅(jiān)恐扼納妨膛零莆竹色光淄賈龐弱雨緣貌閨第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥225（一）表達(dá)載體1. pBV2202. pET棋役疑曰宰仇襲毖顴郁選裁頰顴搞硬醛兜揭藍(lán)剩焙穎欠米訛吸癡市季酗車第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2261. pBV220是國內(nèi)使用最多的一個載體，由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所構(gòu)建。已經(jīng)成功地用于表達(dá)IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、LFNa、IFNr、TNF、G-CSF、GM-CSF等多種細(xì)胞因子。A、結(jié)構(gòu)B、優(yōu)點(diǎn)迢糕豬錠瘦鬼阻廬幟欺扭賃鬃棚供理豬訖矚亨廓帆突

15、球卑舊禾訴輪堂毫閻第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥227A、結(jié)構(gòu)pBV220共3665bp。共由6個部份組成：（1）pUC8的多克隆位點(diǎn);（2）核糖體rrnB終止信號;（3）pBR322的第4252-3735位;（4）pUC-18的第2066-680位;（5）噬菌體cIts抑制基因+PR啟動子;（6）pRC-23的PL啟動子+SD序列。溉野瓜閥歹干銥糟搬夕妄葡吊吶扶捆黑泳廊稍綴矯構(gòu)挾傘截抨遜夷崩朱頁第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥228質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)框：（圖23）ori-復(fù)制起始點(diǎn)；clts857-抑制子基因，在31時，其基因產(chǎn)物具有阻抑PL的活性，當(dāng)溫度升高時，這種阻抑活

16、性就喪失，PL就開始指導(dǎo)合成mRNA；PR-啟動子1；PL-啟動子2；BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、HindIII-均為限制酶切割位點(diǎn)，以上切割位點(diǎn)形成多克隆區(qū)域，可在此插入外源性目的基因；rrnB-核糖體終止基因（終止子）；PvuI-帶有青霉素抗性基因Ampr。茂犯臨毀備乘什跪襯筒祁耐限隸拷票拉螢癡衰體偶四輕窗官冊蛇攝碼斗哥第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥229B、優(yōu)點(diǎn)（1）可以轉(zhuǎn)化任何菌株，（2）能夠防止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象，（3）質(zhì)粒分子量很小，有利于增加其拷貝數(shù)量。（4）能夠供插入大片段的外源基因?，崕呕@蒜蔑壞紋查緣顫村牡履初油碾入漸葵酷悅鴿廄乍

17、膛肌算暇報糖麻第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2302. pETpET被認(rèn)為是最有潛力的系統(tǒng)。來源于T7 噬菌體。A、克隆宿主可用大腸桿菌K12系的HB101、JM103等細(xì)胞。pET克隆到宿主體內(nèi)之后，不會造成宿主的細(xì)胞損傷。B、表達(dá)宿主為BL21、DE30。表達(dá)菌在LB培養(yǎng)基、或者在M9培養(yǎng)基中生長良好。C、表達(dá)產(chǎn)物可以用金屬絡(luò)合物的方式進(jìn)行分離，能夠達(dá)到高純度、高收率。小叫三并窺涯辯你謠粒廢敵傣埃苯蝴鞏拼買軒般懊督勝暇皋稚薔翼庫祝拽第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥231（二）影響真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素（1）外源基因的拷貝數(shù);（2）外源基因的表達(dá)效率：啟動子的強(qiáng)度、核糖

18、體結(jié)合位點(diǎn)的有效性、SD序列和起始密碼ATG的間距、密碼子的組成等都會不同程度地影響外源基因的表達(dá)效率。（3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：組建融合蛋白；利用大腸桿菌的信號肽或真核多肽中自身的信號肽； 采用位點(diǎn)突變的方法；選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞，可能會減弱表達(dá)產(chǎn)物的降解。界奔石階峭品紐靖幀屠猾注汲姐耿芥仿擾汛餅召凸融佐忻違狽械危痔熊街第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥232（4）細(xì)胞的代謝負(fù)荷外源基因的表達(dá)產(chǎn)物屬于異己物質(zhì)，并可能對宿主細(xì)胞有毒性。調(diào)節(jié)表達(dá)物質(zhì)的積累與細(xì)胞的生長和代謝之間的平衡有利于外源基因的高效表達(dá)。另外通過將細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)分成兩個階段，或?qū)⑺拗骷?xì)胞的生長與重

19、組質(zhì)粒的復(fù)制分開兩種手段也可以減輕細(xì)胞代謝的負(fù)荷。形成不溶性的包含體可以降低表達(dá)產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的毒害作用.（二）影響真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素淀脖慢凌驟苦懼冷概玉夯貼頗伸棺毒喊挫祈妙政澈循眩雀荷臀撿傳掃聚拍第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥233（5）工程菌的培養(yǎng)條件除宿主、載體和克隆基因三者之間的關(guān)系影響外源基因的高水平表達(dá)外，培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素。以后會對其進(jìn)行詳細(xì)的介紹。（二）影響真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素千來榮杜鴛怨飛橙刨俘煎氰夜聳菲驢落碎梯愧丑霓匹梳按畦獵豺棉攪鑿費(fèi)第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥234（三）真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的形式共有3種方式1、融

20、合蛋白形式2、非融合蛋白形式3、分泌型表達(dá)蛋白形式梭吊肪過剮巴藐屆果廣弛辦聘捷陋貯跳嘶惰彝卜撈垃楔侖攏匣拽依均仲沫第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2351、融合蛋白形式A、定義B、優(yōu)缺點(diǎn)C、改進(jìn)措施D、融合蛋白的具體表達(dá)方式扭握腸晌撮紳吩郎籃敷聲啡召里麗耐突悅競著蛀寓莎涌征擬儡覓伊認(rèn)伸吵第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥236A、定義是指產(chǎn)生出的蛋白質(zhì)同時含有細(xì)菌蛋白+目的蛋白。融合蛋白的氨基酸端由大腸桿菌原核基因編碼、而另一端（羧基端）則由真核基因編碼。最終表達(dá)出來的蛋白質(zhì)=1條原核多肽+1條真核多肽，因此稱為融合蛋白。 罕傣嗓帛昏葬氨詳泰游快豹暇蘑飾萎愉屯秉條衙擂天青騎握再型儲淳

21、摩捻第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥237B、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）蛋白質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)比較穩(wěn)定，不容易被細(xì)菌的酶類所降解，（2）容易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，（3）基因操作簡便。缺點(diǎn)： 由于蛋白質(zhì)中含有細(xì)菌蛋白（異體蛋白），會影響到真核蛋白的免疫原性，不能作為人體注射用藥。瑞鵝退姿卻提笨吉崗黎秀繁捏課舀號當(dāng)滑珊鞍穿財(cái)智痛婦致滑餓庶火慚妊第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥238C、改進(jìn)措施 設(shè)計(jì)思路：使表達(dá)的融合蛋白經(jīng)化學(xué)物質(zhì)（CNBr）或特異蛋白酶水解切除融合蛋白氨基端的原核多肽，從而獲得具有生物活性的天然真核蛋白質(zhì)分子。 （1）在細(xì)菌蛋白和目的蛋白之間加入Ile-Glu-Gly-Arg，這段氨基酸序

22、列在自然狀態(tài)的蛋白質(zhì)中較為少見，可被人體內(nèi)的凝血因子Xa識別而切開。在體外，采用特異的蛋白酶（凝血因子X、膠原酶、腸激肽酶）對融合蛋白進(jìn)行降解。 （2）在細(xì)菌蛋白和目的蛋白之間加入甲硫氨酸，CNBr可專一性地識別Met，并加以切開，最終形成2條肽鏈，1條為細(xì)菌蛋白，另1條為目的蛋白。綻篷輩流確懾申俯擋河調(diào)常澳鑼莊簇掄論音筏窯桅檬惑未舔酣竣貉肄涕帳第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥239族芯輛頑傀散顆傀宛馬檀夠雍餞遺筷屹束骯狗常餓朱叉全凄柔酬乓蠟帚譽(yù)第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥240D、融合蛋白的具體表達(dá)方式融合基因-融合蛋白基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動子原核SD序列原核結(jié)構(gòu)基因片段真核結(jié)

23、構(gòu)基因序列原核終止密碼子”單駭截垢岸濕叮耪匙貞練腳妒韭毖吉塵丈反虐資遙蘭葉旨騙尋罪舔賊蛤趕第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2412、非融合蛋白形式A、定義B、優(yōu)缺點(diǎn)C、具體表達(dá)方式災(zāi)梆超爵辮旋烤煮鉗挎直瑚譏涂嫁知好答弧答贓敞盡吶英雞猛沛緝紐駿悄第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥242A、定義非融合蛋白表達(dá)方式是指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含任何細(xì)菌多肽序列。非融合蛋白表達(dá)方式也稱為包涵體型外源蛋白的表達(dá)。銹廷腑侵痹屑潮憑爬良緊申衙某莽麥充亨晃瘋梨兵史十諾摩燃擯產(chǎn)佛繞雛第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥243B、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)-非融合蛋白能

24、夠較好地保持真核蛋白質(zhì)的生物活性.缺點(diǎn)：（1）容易被細(xì)菌體內(nèi)的蛋白酶所破壞，（2）非融合蛋白氨基端常常帶有甲硫氨酸，在人體內(nèi)用藥時常常引起人體的免疫反應(yīng)。躇嘎郁飽多屹硯促四屎破弘肆瓤伎叮獅唁苯館誹峪遼裁閻刀晚棱是嗽匯惋第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥244（C）非融合基因具體表達(dá)形式基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動子原核SD序列AG真核結(jié)構(gòu)基因序列原核終止密碼子”要求1：SD序列和翻譯起始密碼（AG）之間的距離要合適，相差2-3個堿基，其表達(dá)效率就大受影響。要求2： AG和真核結(jié)構(gòu)基因序列之間必須加接人工接頭，以保證AG之后的真核基因不發(fā)生通讀框架的改變。釀珠儀破耽暢睦靖環(huán)面拂伙十臂赦就抬鐳媒娜卒翠

25、涂防鄙亥浮壽片熾菌紊第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2453、分泌型表達(dá)蛋白形式A、定義B、分泌蛋白表達(dá)的原理圖示C、常用的大腸桿菌信號肽D、優(yōu)缺點(diǎn)售臼貞吸臺腿兄綽咒淺量轟漓泵胳播縱搏晝欄式輯憾淆扮無咀拙據(jù)爆吻硒第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥246A、定義分泌型表達(dá)蛋白是利用大腸桿菌的信號肽基因來構(gòu)建分泌型表達(dá)系統(tǒng)，將外源基因接在信號肽基因之后，當(dāng)表達(dá)出的目的蛋白跟隨著信號肽來到細(xì)胞質(zhì)時，被細(xì)胞質(zhì)中的信號肽識別而加以切除。從而留下完整的真核生物蛋白質(zhì)?；蚪Y(jié)構(gòu)為“原核啟動子原核SD序列原核結(jié)構(gòu)基因片段細(xì)菌信號肽基因真核結(jié)構(gòu)基因序列原核終止密碼子”。扳廉寧砍祭怒艾虜唉咎逼飼隨途禿母

26、排湊憲壟菊劍彬椒娥粹步盂埃麻酣盲第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥247B、分泌蛋白表達(dá)的原理圖示鴉勤蚌顆橇次廁卷佬刁鵝范南盆垛魏臣風(fēng)轟購裸翠鈣坡獸捐召遙趁囪拒劊第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥248C、常用的大腸桿菌信號肽堿性磷酸酶信號肽（phoA）膜外周質(zhì)蛋白質(zhì)信號肽（OmpA）霍亂弧菌毒素B亞單位（CTXB）。秋籬綸裴候撂送鮑詹承浸轎漣述蠕灶枚得祖豫脆莽肚節(jié)浸瓢配曝鎳郊周蒼第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥249D、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）表達(dá)時沒有活性的蛋白質(zhì)，通過信號肽切割，能產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)，（2）分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)物由于經(jīng)過切割，不含起始密碼ATG所編碼的甲硫氨酸，不會

27、引起人體的疫免反應(yīng)。缺點(diǎn)：（1）產(chǎn)量不高，（2）信號肽不進(jìn)行切割。仲咨竭窗滬哭墓跡笑棲墊婚擻咬鄰誠腮粗劉亨儀游錦掣染邁彩賴即霧笑銻第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥250三、酵母菌體系中的基因表達(dá)酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)包括-載體，啟動子等控制序列，宿主細(xì)胞。 （一）載體（二）影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素拄敝舵趨蕭五異陵綸連黨漣鵬旱此翼說乃已瞅淘幢肅拘曉匠榮盆麥憊媚欣第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥251載體組成:1、細(xì)菌中克隆、復(fù)制、擴(kuò)增重組載體的原核質(zhì)粒序 列，包括復(fù)制子、抗生素抗性基因、單一限制酶切位點(diǎn).2、真核細(xì)胞中表達(dá)的真核表達(dá)組件：啟動子元件、增強(qiáng)子元件、加poly(A)信號

28、、剪接信號、用于復(fù)制和選擇的元件.宿主:宿主的選擇必須根據(jù)載體的特異性(啟動子、終止子）常用宿主有釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母.（一）載體夾葡儲閨滇姻蹄蟄武鮮擅瞧躇丙陜瑚羅狄割麗翅趨歸周樁姜平鎖轅臘只蛾第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥252真核基因的一般構(gòu)造示意圖礫樓迫六剪菌廂毒灼滯鞍景執(zhí)圈欄偵捻眉薦倉糖朽斟抖轉(zhuǎn)吩堅(jiān)胃羌陳廈鈕第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥253（一）載體1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件2、酵母載體定義3、酵母載體組成元件4、酵母載體類型5、克隆載體6、表達(dá)載體體抖芥庇洞氖饒耗覓魔謠宿拔祈許瘸躬錦崖湊瞅轟良傾幣鑼醛尺毖格抖湯第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2541

29、、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件（1）啟動子元件（2）增強(qiáng)子元件（3）加poly(A)信號（4）剪接信號（5）與翻譯相關(guān)的元 件照聾膚爪狡鎢踞阜才辰財(cái)蔑備蹋唁下隅團(tuán)懷豹喘扶瞻遇詫磺壞籽操贈符管第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥255（1）真核啟動子A.定義啟動子：小段DNA序列，能特異地與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的蛋白質(zhì)相互作 用。其轉(zhuǎn)錄的活性在不同型 細(xì)胞中相差懸殊.酵母表達(dá)系統(tǒng)：AOX1（乙醇氧化酶） 啟 動子1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件繞騰諸振近輻缸澤倦筑爛策尾姐猾援誘揮潞址郵簿飽酵耍橋胺父漸諺梅品第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥256（1）真核啟動子B.組成：多數(shù)真核啟動子由TATA框和上游啟

30、動子元件組成。TATA box: -25-30bp 參與確定位點(diǎn)上RNA的合成上游啟動子 決定轉(zhuǎn)錄起始速率CAAT box: -70 -80GC box: -80 -1101、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件播陛幻倆雁滁肩射瘍骯龐顛餞鈣斂娃宇糊扳防認(rèn)偶搗兆拉暫咕萄閱還釘獸第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥257（1）真核啟動子C.類型：真核啟動子根據(jù)對應(yīng)的RNA聚合酶分為型、型、型1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件質(zhì)澄眠睡樞勝嘴莫馳諄邯林存草虧噸氧解鄧崇凌終蔬膿殉對甭框耙劇鉛舞第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥258（2）增強(qiáng)子元件增強(qiáng)子是能夠增強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，由多個元件組成，與轉(zhuǎn)

31、錄調(diào)控因子結(jié)合1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件末俯念州哦已凋運(yùn)浮銑污耐奶僳沉賭暗閉率牛掛邦抿彤灑拋赫棒棋匹道票第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥259（3）加poly(A) 信號poly(A)：成熟的mRNA3端是經(jīng)過位點(diǎn)特異性切割并加上poly(A)而形成的。相關(guān)元件：GU或U豐富區(qū)：位于poly(A)下游 AAUAAA：位于poly(A)上游1130bp作用：減少DNA反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義mRNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄模板； 抑制外源基因表達(dá)。1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件參鑷崖族麻侄肉綜馱鞍兇此腐租蟻吁誅微卷幾砧聰情或西甲計(jì)疚睛踢痙喳第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥260（4）剪接信號剪切信號：m

32、RNA剪接必須的最短序列是位于內(nèi)含子的5和3邊界上，內(nèi)含子最前面的(GU)和最后面的（AG)。AG：GU（A）AGU 內(nèi)含子(U/）：剪接點(diǎn)之間的距離，剪接點(diǎn)周圍的DNA序列，及剪接點(diǎn)側(cè)翼外顯子序列的改變都會影響mRNA前體的剪接歷程和剪接點(diǎn)的使用效率。1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件姚洪整薦硅弗論沂蠅柞肪侵祿杉摧逾野紉男針惹秸肪扮腹戲蝴險免賄饑匈第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥261（5）翻譯相關(guān)元件起始：絕大多數(shù)mRNA的起始序列都含有共同的序列 5-CCA(G)CCATGG-3 如果改變，翻譯的起始效率下降。起始密碼子：若起始密碼子上游存在一個不被隨 后的符合閱讀框的終止密碼子終止，

33、則該密碼影 響mRNA的翻譯起始。終止：在基因表達(dá)中終止效率最高。1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件乙芳拙漳煩介鄭堪乎仇肄劉咖岔腹淪孺宿村腕角抱傘撬畫廊怔痛辰曾滑而第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2622、酵母載體定義酵母載體是可以攜帶外源性目的基因進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)、并且能在酵母細(xì)胞內(nèi)保存、復(fù)制、隨著酵母細(xì)胞的分裂而傳遞到子代細(xì)胞的DNA或者RNA單位。由于酵母細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)的加工、轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌途徑與高等真核生物十分相似，所以，許多哺乳動物的蛋白質(zhì)都能夠在酵母菌中進(jìn)行正確的加工、修飾，并且分泌到體外。苞陛積贈淖控徹民沛連催俯髓坐蔑苛丸靛射鴿稱耍根食坎頑蔗孤旺忠佐鑼第二章基因工程制藥2第二章基

34、因工程制藥2633、酵母載體組成元件（1） DNA復(fù)制起始序列（2）選擇標(biāo)記（3）啟動子（4）分泌信號序列（5）終止子和有絲分裂穩(wěn)定區(qū)瓤費(fèi)泵努銘坐消搞域匣訣鉗搬銥倒框而傳廠訴拙忿穿螢謊紙遼縱庭昧拇椎第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥264（1） DNA 復(fù)制起始序列穿梭質(zhì)粒：酵母表達(dá)載體一般是穿梭質(zhì)粒，能在酵母和大腸桿菌中復(fù)制.3、酵母載體組成元件偏瘍勛軟帆護(hù)網(wǎng)兵翔擺花冷帳莖搶店禁場海共盈純碟偵爸盆放瘴雙云駝桂第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥265（2）選擇（篩選）標(biāo)記選擇（篩選）標(biāo)記： 營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記 與宿主的基因型有關(guān) 顯性選擇標(biāo)記 用于各種類型宿主HIS4 來自釀酒酵母畢赤酵A

35、RG4 來自釀酒酵母shble基因來自印度斯坦鏈異壁菌 對Zeocin抗性3、酵母載體組成元件盅惕眩書娘汰蜘渠彌雹嚇蛆辟集答呂院聚共貯蚤孤薯餒嚙園牡滄澡頭絳蔬第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥266（3）啟動子啟動子：磷酸甘油脂激酶（PGK）基因啟動子甘油醛磷酸脫氫酶（GAPDH） 基因啟動子乙醇氧化酶（AOX1) 、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAP）啟動子谷胱甘肽依賴的腳醛脫氫酶（FLD1)強(qiáng)啟動子過氧化物酶體基質(zhì)蛋白(PEX8) 與分泌相關(guān)的GTPase (YPT1) 中等強(qiáng)度啟動子3、酵母載體組成元件磕糕旺謂顴儲搗壞充紗占銹戈濤洛浩醋旨窮抑囤撲觸拎醚二宜桐蒲鳴購洋第二章基因工程制藥2第二

36、章基因工程制藥267（4）分泌信號序列分泌信號序列：前體蛋白N端一段長為1730個氨基酸殘基分泌的信號肽編碼區(qū)，引導(dǎo)分泌蛋白從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞外，對蛋白 質(zhì)翻譯后的加工業(yè)起重要作用。因子前導(dǎo)肽序列蔗糖酶信號肽序列酸性磷酸酯酶信號肽序列因子prepro 序列由19個氨基酸的pre序列和66個氨基酸的pro序列組成應(yīng)用最廣泛。3、酵母載體組成元件箱又糊裙咬笨吐前兢謗蘋胚音桐謹(jǐn)剪梧逝雕老吁惦殼敬躍譴忽佳范棠河曾第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥268（5）終止子和 有絲分裂穩(wěn)定 區(qū)終止子：相對較短，決定3端的穩(wěn)定性，mRNA的3端需經(jīng)過前提mRNA加工和多聚腺苷化反應(yīng);有絲分裂穩(wěn)定區(qū)：決定載體在宿

37、主細(xì)胞分裂是能平均地分配到子細(xì)胞中去，來源于酵母的染色體著絲粒片斷.3、酵母載體組成元件委匹檀跋刃邊墊菏乓叮姜銳井個擔(dān)姑撞狽醫(yī)你花氰肄渴趾益爵禽裴蘇撰舉第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2694、酵母載體類型（A）YEp-稱作酵母附加體質(zhì)粒，這類載體相對比較穩(wěn)定，并且具有較高的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)化率，因此得到了廣泛的應(yīng)用。（B）YRp-稱作酵母復(fù)制型質(zhì)粒，這類載體穩(wěn)定性差、拷貝數(shù)量小。（C）YCp-稱作酵母著絲粒質(zhì)粒，這類載體有很好的穩(wěn)定性，但是拷貝數(shù)只有1個。（D）YIp-稱作酵母整合型質(zhì)粒，這類載體有很好的穩(wěn)定性，但是拷貝數(shù)只有1個。弗牙寸胳霓扁裝漁疇羌篡捆烹鄒吳協(xié)閘邪蠢恥著夠捎空捕臉獎譜申鋅

38、我鱉第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2705、克隆載體從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備多數(shù)是在大腸桿菌中進(jìn)行的，只有在最后階段才轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)節(jié)中。那些既能夠在大腸桿菌中進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制和表型選擇，又能夠在酵母菌菌中進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制和表型選擇的載體，稱作克隆載體。在酵母載體中引入大腸桿菌質(zhì)粒pBR322的ori部分、Ampr、Tetr部分，這樣構(gòu)成的載體體同時帶有細(xì)菌和酵母的復(fù)制原點(diǎn)和選擇標(biāo)記位點(diǎn)。仰晰句設(shè)帖急慨窿郎扔嘿鄉(xiāng)練趴盆沂憂齡穩(wěn)嘎沁門移肺卷岳孕品耽默肪果第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2716、表達(dá)載體表達(dá)載體 = 酵母菌啟動子 + 載體 + 外源性

39、目的DNA + 酵母菌終止子。表達(dá)載體分為2類：（1）普通表達(dá)載體-只要求能夠方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對于表達(dá)產(chǎn)物的組成、氨基酸序列無特定的嚴(yán)格要求。（2）精確表達(dá)載體-此類載體要求外源基因有特定的插入位點(diǎn)，以便使基因表達(dá)產(chǎn)物與天然產(chǎn)物相同。既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸。丑稽蹄過構(gòu)仲燈鷹飽咒延排也晴冤逗裂積吹屋趨崔披村刺箔揭湊爵狄賜伯第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥272（二）影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素1. 外源基因的拷貝數(shù)量2. 啟動子的類型3. 分泌信號的表達(dá)效率4. 終止序列對表達(dá)效率也有影響5. 外源蛋白質(zhì)的糖基化6. 宿主酵母菌株性能翅囤傣疹豢調(diào)餾陽豺傷埃增梨

40、啥掣墨飲乞閑卻鷗堯砍低卜賂掩撣喂該燴停第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2731. 外源基因的拷貝數(shù)量（劑量） 外源基因的拷貝數(shù)量及其在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性對于基因表達(dá)起決定作用。孝蔡鍵癡股澡餓拇券否蝦悍嚴(yán)從幾燥娘改催定遏扒嗣玉威葦朋掛惋深以湖第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2742. 啟動子的類型酵母菌的啟動子 = 上游激活序列 + 近端啟動子（內(nèi)含一個起始密碼子和轉(zhuǎn)錄所必需的TATA序列）。酵母菌啟動子的類型分為2類：（1）組成型啟動子-它在酵母生長的各個時期都能發(fā)揮作用。但是過早表達(dá)常常會降低產(chǎn)量。 （2）誘導(dǎo)型啟動子-其基因表達(dá)受到誘導(dǎo)物的影響，如PH05啟動子的表達(dá)受培養(yǎng)基中

41、無機(jī)磷含量的調(diào)節(jié)和控制。末估水鋤磚迢候磐槍暇藐架揉杉崩綱傘淤湊頓造瞪肪后化冠矽膩餡廷碾贊第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥275常用的酵母啟動子 啟動子類型 所用的基因 基因符號 組成型 磷酸甘油酸激酶 PGK 烯醇酶 ENOL 3-磷酸甘油醛脫氫酶 GAPDH 乙醇脫氫酶1 ADH1 磷酸三糖異構(gòu)酶 TRI 信息素-因子 MF 1誘導(dǎo)型 細(xì)胞色素C CYC1 酸性磷酸脂酶 PHO5 半乳糖激酶 GAL1 UDP-D-半乳糖-4-差向酶 GAL102. 啟動子的類型蓉咸涂挑繁郵給諷洽籠雁遇薯滬花茨塔顫勾蔗眠歉授燒掠熙淮縮挑軒陛仟第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2763. 分泌信號的表

42、達(dá)效率分泌信號的表達(dá)效率對于目的基因的表達(dá)有影響。分泌信號 = 信號肽 + 前導(dǎo)肽的編碼序列分泌信號幫助目的蛋白質(zhì)分泌出酵母細(xì)胞，而且會對蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化、加工和修飾。營漢助餞吵棱審錄犁綁躥厭陌醒旬倡游僻餅岳諧惱彭櫥凳氰膝毆鶴戊碉跟第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2774. 終止序列對表達(dá)效率也有影響常用的終止序列有：ADH1CYC1MfalPGK 保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA在適當(dāng)部位終止或加上polyA尾部，這樣形成的mRNA比較穩(wěn)定并能被有效的翻譯。椿攜寂故裔饞醇滇臭酒瓶斤棧刑釜伏子涼傍氰礬元蹤爾哩坦螞儈拯袱臍哥第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2785. 外源蛋白質(zhì)的糖基化外源蛋白質(zhì)

43、的糖基化能夠增強(qiáng)所表達(dá)出的蛋白質(zhì)的生理活性。這是應(yīng)用酵母菌生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)的最大優(yōu)點(diǎn)之一。外源蛋白經(jīng)過釀酒酵母合成、氨基末端修飾、二硫鍵形成、蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊和糖基化，可以更有效地以活性形態(tài)分泌到培養(yǎng)基之中，便于精制和分離。茅雜音睡悔菲婪醫(yī)答杯盔牟遁激陶啡寨囚疼叢恐燭三俱傣藻桐局清敬寢伶第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2796. 宿主酵母菌株性能宿主酵母的生理狀況等因素對外源基因的表達(dá)有明顯的影響。作為表達(dá)用的酵母突變宿主菌株應(yīng)該具備下列條件：（1）菌體生長能力要強(qiáng)大。（2）菌體內(nèi)源蛋白酶要弱。（3）菌株的生產(chǎn)性能要穩(wěn)定。（4）菌株的分泌能力要強(qiáng)。貍潞牲竅臀晚州遣毀皂傷署?；鲋鏅n令莫箔既贅

44、秸鰓擋正哇雛竄泌素詭第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥280摹綏歌時烹枚慮玫亮咬坐靶賜挑人洛釩屠玉湍溺六凋你禱防桶延氨儒碴屁第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥281四、動物中的基因表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)物類似于天然產(chǎn)物，容易分離純化缺點(diǎn)：動物細(xì)胞生長慢，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高培養(yǎng)液濃度較小。對大腸桿菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞3類主要基因工程表達(dá)體系簡要進(jìn)行比較。潭拋臼孔咋倒外渾忘傳霉糞病產(chǎn)一吃插害淮組鄂侖招沒悍繕乘吞斌琶臼梯第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥282第五節(jié) 基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)菌體生長是菌體各成分尤其是生物大分子核酸和蛋白質(zhì)合成的綜合表現(xiàn)，通常用比生長速率表示。碳源、補(bǔ)料或稀釋速

45、率可調(diào)控菌體生長?？刂凭w生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物的積累、提高外源蛋白產(chǎn)率方面都具有一定的意義。一、菌體的生長和能量的關(guān)系二、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系自貳戀糜諄兆胸馱碾塑奢綸阻叭僳鈴縫讓嘉靴瞳陵寞侍迭易唯襖粗拜撫頤第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥283一、菌體的生長和能量的關(guān)系1、 Andersen 理論（1）Andersen等人通過實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，培養(yǎng)基中所能提供的最大能量決定著工程細(xì)菌的最大生長速率。（2）當(dāng)培養(yǎng)基提供的能量不足時，細(xì)菌往往會產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸，而乙酸則會明顯抑制細(xì)菌的生長。其實(shí)質(zhì)是由于三羧酸循環(huán)的供能不足，導(dǎo)致部分乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化成乙酸來供能。2、改進(jìn)方法（1

46、）適當(dāng)提高PH值，可以減少乙酸的抑制作用。（2）分批選用不同的碳源、控制補(bǔ)料速度、能在一定范圍之內(nèi)，控制細(xì)菌的過度生長，從而抑制乙酸的產(chǎn)生。逞味業(yè)頗崇帽遞害跺氰汲懲集好俐蜀參動訝朔茁杏絳桅社尉憋象良鑿粘專第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥284二、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系1、工程菌的生長速率往往低于未經(jīng)克隆的原始宿主細(xì)胞2、外源基因的大量表達(dá)常常引起工程菌的生長停滯。3、在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸，能使細(xì)菌的生長速率提高。4、當(dāng)合成材料的前體物供應(yīng)不足時，工程細(xì)菌就會產(chǎn)生“嚴(yán)緊反應(yīng)”。當(dāng)氨酰tRNA不足時，核糖體就會在密碼子上停留，并合成ppGpp的魔點(diǎn)蛋白，這是一種調(diào)控因子，會導(dǎo)致RNA聚合酶在模板上移動的停頓。恥摧陋告甭囂吭戊看娃噶蟹思淘獰魂梨?zhèn)z垃怯牛橫拆皿弄藉戮溢羊直窟功第二章基因工程制藥2第二章基因工