BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀簡單操作技巧步驟

1、*-1-BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀簡易操作步驟一、開機(jī)1）先打開凈化交流穩(wěn)壓電源，其次打開110V穩(wěn)壓輸出電源，再次打開流式細(xì)胞儀，最后打開計(jì)算機(jī)。2）向前拉開儲(chǔ)液箱抽屜，檢查鞘液筒、廢液筒水量，如需充填鞘液，先將減壓閥（紅色箭頭所示）方向調(diào)在VENT位置（箭頭方向），再加入超純水，保持水位在鞘液桶的3/4左右，加好后擰緊桶蓋并將減壓閥方向調(diào)在RUN位置。二、開啟CellQuest軟件、編輯實(shí)驗(yàn)文件1）在屏幕下方點(diǎn)擊CELLQuest（第四個(gè)圖標(biāo)）啟動(dòng)軟件。桌面會(huì)出現(xiàn)一Untitl實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的左上角的放大鈕（綠色），將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。電子版本：NOVOPUBLICNo

2、voBio流式細(xì)胞儀BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀簡易操作步驟_corr_ZYH_201405202）從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大小，然后放開鼠標(biāo)。出現(xiàn)散點(diǎn)圖對(duì)話方框（當(dāng)所要編輯的圖窗口被選中時(shí)，會(huì)在其四角出現(xiàn)四個(gè)小黑塊）。OutPlut3）在出現(xiàn)的散點(diǎn)圖對(duì)話方框中點(diǎn)擊PlotSource，選擇AcquisitionandAnalysis（收取、分析），確認(rèn)X和Y軸參數(shù)預(yù)設(shè)為FSC-H1024、SSC-H1024。4）從屏幕上方Plots菜單中選擇DotPlot功能，可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，在出現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)選擇X軸：FL1-H1024；如果是

3、雙標(biāo)，Y軸選擇：FL2-H1024（根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測樣品確定所選通道，本步驟選FL1/FL2來說明），如果是單標(biāo)，Y軸選擇：SSC-H。點(diǎn)擊OK,FL1/FL2的散點(diǎn)圖出現(xiàn)。完成后可將重制圖移至原圖右方?？诙ntitled巨目X:Y:二untitledx|IbAcquisitionDotPlot|bAcquisitionDotPlot|=-!COsu?且=s:oiuo訕制務(wù)押FSC-H_r-_L,0LzL0AcquisitionDorPlot101102103FSC-H說明：散點(diǎn)圖（Dotplot），又稱二維散點(diǎn)圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)的相互關(guān)系。在圖中，橫坐標(biāo)X軸和縱坐標(biāo)

4、Y軸參數(shù)分別設(shè)為FSC-H1024、SSC-H1024；雙熒光標(biāo)記時(shí)，第二圖X和Y軸參數(shù)分別設(shè)為FL1-H1024、FL2-H1024,X軸為為熒光1強(qiáng)度的相對(duì)值，單位是道數(shù)，Y軸則通常表示熒光2或光散射強(qiáng)度的相對(duì)值。儀器使用者可因?qū)嶒?yàn)需求來修改所有圖譜中顯示之參數(shù)。修改動(dòng)作為輕擊圖譜上X和Y軸參數(shù)，并依需要選擇之（FSC：細(xì)胞大小，SSC：細(xì)胞折射率，F(xiàn)L1：FITC綠色熒光，F(xiàn)L2：PE橙色熒光，F(xiàn)L3：PerCP紅色熒光）。5）在工具板中選擇四象限工具，在FL1/FL2散點(diǎn)圖上拖動(dòng)Quadrant的中心將它設(shè)定在（x,y）=（101,101）處，這些象限將指定陰性/陽性區(qū)域。Aixiui

5、sitionDDtFtotPLHHI6）從工具板中點(diǎn)擊直方圖圖示，在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大小，然后放開鼠標(biāo)。單色熒光只需一個(gè)直方圖，和第二個(gè)散點(diǎn)圖一樣，橫坐標(biāo)選擇FL-1,縱坐標(biāo)默認(rèn)為Counts；若是雙色熒光，需畫2個(gè)直方圖，一個(gè)橫坐標(biāo)選擇FL-1-1024，另一個(gè)橫坐標(biāo)選擇FL-2-1024；7）在上面直方圖中畫出M1和M2,其中M1代表隱性數(shù)目（一般標(biāo)示是101）,M2代表陽性數(shù)目（除M1以外所有的部分）。48）從Stats菜單中選擇QuadrantStats（象限統(tǒng)計(jì)），5）步驟中的點(diǎn)圖將分為四個(gè)象限。Hl&luurd*iniK-5StotsiheglainMatsQ

6、udiilrdniSidEdirL.Fjqiitt*i,旨jn霍lliLiiiihS補(bǔ)pls01|A|PijivrtN阿承NFricndlTutc/quisitkjnDaleL：4-：Sep-Q6LogOedtUnits:Lin赳如YduesPvtiefillO:昭WDErtriftsfalXMeanY險(xiǎn)an灼fed4X1LLV0.0235.2556.23UR60.10(1101290.5射53321320.俯LL刊BT第.78997吐鬪3.9259369LR60.10(110轉(zhuǎn)2530505292215XPmjTieter(ILoRLccaJboFi5,52PanelOat巴Noda虻Toi

7、lalE:柚trtPar劉netaF：FL2-HfLo()*三、建立儀器和計(jì)算機(jī)之間通訊從Acquire菜單中選擇ConnecttoCytometer（快捷鍵Win+b），此時(shí)會(huì)出現(xiàn)AcquisitionControl對(duì)話方框。PlatsGeCytometeretectors/HmpsDetectors/Amps窗口確認(rèn)FSC與SSC（根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣品確Threshold定，一般細(xì)胞選擇LIN，細(xì)菌選擇LOG），其它FL1-3為LOG（對(duì)數(shù)放大），將其拖至空白區(qū)。CompensationStatusInstrumentSetting：SortCounters四、儀器設(shè)置文件注意：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量，取決

8、于最適化儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件不能在數(shù)據(jù)收取后再更改，研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件（Instrumentsettings），含信號(hào)器高壓（Detector/Amps），閾值（Threshold），熒光補(bǔ)償（Compensation）等儀器條件的組合。一般而言，儀器設(shè)定的順序?yàn)镈etector/Amps-Threshold-Compensation。1）檢查現(xiàn)有儀器條件，從Cytometer菜單中選擇Detectors/Amps。出現(xiàn)Detectors/Amps窗口。在Time-DelayCalibrat:Detectors/Amps：:|jjRj；Thresh

9、oId；：；：；FlPlP2P3P4P5P6P7Detect”F5CSSCFL1FL2FL3FL2-AFLZ-Wn.4YaltajeAmpGamIIJQUModeLin訂匚|FourColoroo5o36oo5556一y._.y一_.春._廿.oooooo-O.OSJ-O.0.0Lin訂LinLinODMPuram:FLM訂PrimarvSecondaryValue：Pamm：Mram：FSC-H055-HOssc-HOfli-hOfli-hOflz-hOFL2-hOFL3-HOFL3-HOFL4-H；Nene2222225555552）從Cytometer菜單中選擇Threshold，出現(xiàn)T

10、hreshold窗口在Threshold窗口：確認(rèn)FSC為設(shè)閾參數(shù)，初步確認(rèn)預(yù)設(shè)閾值52。將其拖至空白區(qū)。3）從Cytometer菜單中選擇Compensation,確認(rèn)所有預(yù)設(shè)數(shù)值皆為零。將其拖至空白區(qū)。五、上樣品、設(shè)置儀器使儀器處于HighRUN,樣品管支撐架左移，上陰性對(duì)照管樣品，支撐架回位。確認(rèn)AcquisitionControl窗口中Setup前需打叉或打勾（即不儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，用于儀器設(shè)置）,點(diǎn)擊Acquire。:Acquisitio仃Ccnt廠口1二:：|File：HSetupAcquireRestartSaveAbort1、調(diào)節(jié)FSC/SSC探測器（電壓）觀察FSC/SSC圖的變化。

11、FSC電壓（Voltage）預(yù)設(shè)為E00,可調(diào)節(jié)AmpGain從1.009.99使主要細(xì)胞群得以清楚顯示（如細(xì)胞較大，將FSC電壓設(shè)置于E-1；較小細(xì)胞，將FSC電壓設(shè)置于E01）。調(diào)節(jié)SSC電壓使主要細(xì)胞群得以清楚呈現(xiàn)。調(diào)節(jié)FSC/SSC圖的原則，在于能得到一獨(dú)立離散的細(xì)胞族群，該細(xì)胞群不與其它族群、細(xì)胞碎片有重迭現(xiàn)象。調(diào)整定位后，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Pause。arrowDerectors/AmpsHadeFSCSSC2B?SSIE28訂LCKUnLIPT0CFourCoJorParamDetectorVoltageAmpGamEDO2.UTKMPIslider

12、control2、Gating圈選細(xì)胞檢品中，常含有大小不同、性質(zhì)相異的細(xì)胞群體。我們常用前方散射（FSC）與側(cè)方散射（SSC）的二維位圖，即散射光圖譜（ScatterPlot），來圈選出不同細(xì)胞群的范圍，選擇性顯示出有意義的細(xì)胞群體，如下圖圈選白血球之淋巴細(xì)胞族群。1）在工具板中選擇多邊形的Region,在FSC/SSC散點(diǎn)圖上劃定淋巴細(xì)胞R1區(qū)域（如下圖）。分析樣品時(shí)，區(qū)域內(nèi)細(xì)胞應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)成紅色，可移動(dòng)或改變形狀來圈選有意義的細(xì)胞。如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，您可以在工具列中點(diǎn)選GatesRegionlist，以鼠標(biāo)點(diǎn)選R1,再按Delete鍵刪除R1區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫R1。

13、S塞匚i=(I2(101(1tIKiEIKI1(1(FSC工dssF5C-H2552）選取希望Gate的FL1/FL2散點(diǎn)圖，從Plots菜單中選擇Formatdotplot。在出現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)，將NoGate改選G1=R1。點(diǎn)擊OK。Inspecto匚DotPlotRotTypeFileAnaJysrsMeFBeTub-!NoTldpX卩arameter25tVParEtur2SiiElSShowTitleDotPlot01100%IdentifyEventh丨EventCotorD|iCalorGtuiNqGjitiisDotPlotPtot7NoCatepBasicPlot3、調(diào)節(jié)FL1

14、、FL2的探測器（電壓）1）點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Restart。在Detector/Amps窗口中調(diào)節(jié)FL1、FL2的電壓，使NegativeControl細(xì)胞群著落在所選直方圖或散點(diǎn)圖之100-101處。Ear-H210H103FL1-H1D3-i10n*2）在Threshold窗口，適當(dāng)?shù)靥岣逨SC閾值52，以去除碎片或低階噪音。唯需注意不要切掉主要細(xì)胞族群。點(diǎn)匚quisitiunDotPlotELIO汕ICiLiU800lOijOIo3）點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Pause、Abort。移去陰性對(duì)照管，我們已設(shè)定好有意義細(xì)胞群之自體熒光，

15、不要再改動(dòng)Detector/Amps、Threshold等數(shù)值。4、調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償說明：最適化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重迭。（如是單色熒光實(shí)驗(yàn)可跳過此步驟）如是2色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1,FL1-%FL2（若3色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的補(bǔ)償）。1）HighRUN，換上單染CD3-FITC管。點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Acquire。調(diào)節(jié)FL2-%FL1使FITC陽性細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的右下象限。補(bǔ)償調(diào)節(jié)可通過點(diǎn)擊來選擇或直接拖動(dòng)滑標(biāo)上下移動(dòng)。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗

16、口中的Pause。J：Compensation：|lFL1-rLS-FL2-FL3-FL3-FL4一0-036-3000.0_*!#*_*廿*_ffEIAfflwj.o%t%FL2rLIFL3FL2FL42）移去單染CD3，換上單染CD19-PE管。點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Restart。調(diào)節(jié)FL1-%FL2使PE+細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的左上象限。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Pause。IB心心tionDE匾%FL2KFL1需FL3誓FLZ気FL4需FL53.）最后以CD3-FITC/CD19-PE雙染樣本上機(jī)，點(diǎn)擊Acquisiti

17、onControl窗口中的Restart，確定三群細(xì)胞工整垂直。當(dāng)您已完成2色熒光之光譜重迭時(shí)，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Pause、Abort。GatedunLymphusrM_IO1FL1-H10*4）移去樣本管，換上dH2O管，讓儀器暫且處于Standby狀態(tài)。關(guān)閉Compensation窗口。您已完成2色熒光之最適化。六、收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1）決定儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)：預(yù)設(shè)之儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)為10000。如需修改，從Acquire菜單10000ofAll，再點(diǎn)擊OK。中選擇Acquisition&Storage，并在出現(xiàn)的窗口功，確認(rèn)CollectionCriteria從Requi

18、re|Hcquisition&garageParameterestriplionCustomKeijiuordsCountersEditReagentList,EditPanels.QuantiQuestdisconnectfromEytamFACS3C；aiibnrD-at&FIgvwill!whn(100i0ri|of占IIcountedStorMtEate：OQtDfm$CDDteili:Fill訂申bAlJbFil*|i欣11*2）找個(gè)檔案匣準(zhǔn)備儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，本機(jī)所有數(shù)據(jù)都貯存在D盤data盤中，按實(shí)驗(yàn)日期編排。從Acquire菜單中選擇ParameterDescription,出現(xiàn)Par

19、ameterDescription對(duì)話方框。點(diǎn)擊Folder，并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框，選擇YourFolder或新建活頁夾，點(diǎn)擊此對(duì)話方框的SelectYourFolder（般用實(shí)驗(yàn)日期來命名Folder）。DirectDiy；加佃iJM.GtfhinSamii=-O:Operrtor:OSXrRDA甲PteFoidor:jLomnerts:0O肉Browser:untitled=AcquishionIAnalsspAjOCfusrtionCMlGraks3）命名即將儲(chǔ)存之文件名：點(diǎn)擊ParameterDescription對(duì)話方框的File，出現(xiàn)文件名編輯窗口，輸入文件名（根據(jù)實(shí)驗(yàn)來決定），

20、點(diǎn)擊此對(duì)話方框的0K。4）Optional：如有需要，可選擇或在P1-P5后的空格中輸入相關(guān)參數(shù)名。如P1：Size,P2：Granularity,P3：CD3FITC。輸入?yún)?shù)名會(huì)存入實(shí)驗(yàn)檔案中，顯示在圖譜上。5）計(jì)數(shù)器Counters:從Acquire菜單中選擇Counters.窗口會(huì)顯示樣品分析速率、與總數(shù)進(jìn)度口嵌嵌嵌肚庶卅:Counters：TotalEvents-3825Events/Second：150ResettlEpsed1ime：U:U:6）開始收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。LOWRUN（根據(jù)Counters來調(diào)節(jié)速度，一般保持在700-800/Second）,將第一管樣品放到檢測區(qū)，在AcquisitionControl窗口中，將岡S