體內(nèi)藥物分析方法建立和驗(yàn)證

1、關(guān)于體內(nèi)藥物分析方法的建立與驗(yàn)證1第一張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2第一節(jié) 分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 在建立分析方法之前，應(yīng)充分利用現(xiàn)代科技成就和前人的研究成果，系統(tǒng)檢索國(guó)內(nèi)外的科技文獻(xiàn)，對(duì)藥物在生物體內(nèi)的存在狀況、藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)、分析檢測(cè)方法等相關(guān)資料加以分析和研究，以供借鑒。對(duì)于尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道的藥物，亦可參考同類藥物的相關(guān)文獻(xiàn)。 檢索文獻(xiàn)，可在最短時(shí)間、最小的花費(fèi)（磨刀不誤砍柴工）建立一個(gè)好的分析方法！這是試驗(yàn)前要做的第一件事！大四的同學(xué)們，你們查過(guò)文獻(xiàn)嗎？第二張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3血藥濃度 94-2008 5122篇第三張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4第

2、四張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5第五張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月61992年創(chuàng)刊的中國(guó)臨床藥學(xué)雜志 2001年第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院主辦的藥學(xué)服務(wù)與研究?jī)煽?004年同時(shí)成為中國(guó)科技核心期刊 臨床藥學(xué)專業(yè)性的學(xué)術(shù)期刊有：第六張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月7不想當(dāng)將軍的士兵不是好士兵 容量大的U盤：中國(guó)臨床藥學(xué)雜志、藥學(xué)服務(wù)與研究中大量的相關(guān)文獻(xiàn)拷貝下來(lái) 另外以 “臨床藥學(xué)”、“臨床藥師”、“合理用藥”、“藥學(xué)監(jiān)護(hù)”、“血藥濃度”等為關(guān)鍵詞，查找相關(guān)的文獻(xiàn)，copy !看文獻(xiàn) 寫論文 提職稱第七張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月8這門課有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，要求大家

3、以論文的形式寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告！實(shí)驗(yàn)一 改進(jìn)的柱前衍生-HPLC法測(cè)定丙戊酸鈉的血藥濃度 由老師提供文獻(xiàn)?？赐晡墨I(xiàn)后，考慮一個(gè)問(wèn)題：該如何設(shè)計(jì)、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件？實(shí)驗(yàn)二 姜黃素-PVP固體分散體在兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 大家到圖書(shū)館電子閱覽室查閱文獻(xiàn)！ 關(guān)鍵詞：姜黃素，血藥濃度 或：姜黃素 ，（藥代）動(dòng)力學(xué) 要看PDF 文檔，電腦要安裝 ADOBE READER軟件 第八張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月9一、待測(cè)藥物的理化性質(zhì)及體內(nèi)存在狀況 準(zhǔn)確測(cè)定生物樣品中的藥物或其特定代謝物通過(guò)一定的生物樣品預(yù)處理使待測(cè)物從結(jié)合物或綴合物中釋放出來(lái)。故此，應(yīng)首先考慮樣品預(yù)處理方法待測(cè)藥物的理化性質(zhì)藥物在

4、生物體內(nèi)的存在狀況藥物在生物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化(代謝)途徑建立分析檢測(cè)方法的主要依據(jù)有：第九張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月10(一)待測(cè)藥物的理化性質(zhì) 藥物的pKa值、親脂性、溶解度、分配系數(shù)等決定預(yù)處理方法及萃取方法具有親脂性在適當(dāng)?shù)膒H值下用溶劑萃取具有強(qiáng)極性或親水性沉淀蛋白、固相萃取、離子對(duì)萃取或衍生化后萃取等具有揮發(fā)性GC測(cè)定法具有光譜或電化學(xué)特性分析檢測(cè)方法藥物的穩(wěn)定性萃取濃縮技術(shù)對(duì)酸堿不穩(wěn)定避免使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性溶劑 對(duì)熱不穩(wěn)定避免高溫蒸發(fā)溶劑-一個(gè)例子第十張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月11另一個(gè)“兩彈一星”：拯救5億人的“中國(guó)神藥” -青蒿素 瘧疾是危害人類最大的疾

5、病之一。全球每年瘧疾病人超過(guò)5億，死亡100萬(wàn)人以上。屠呦呦：古醫(yī)書(shū)中有青蒿治療瘧疾的記錄。起初青蒿的有機(jī)溶劑提取物對(duì)瘧疾的抑制率很低，不甘愿，又翻出古醫(yī)書(shū)： “青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之?！?和中藥常用的煎熬法不同？原來(lái)里面用的是青蒿鮮汁！ 改用沸點(diǎn)較低的乙醚提取，抑制率達(dá)100% 溫度！第十一張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月12(二)待測(cè)藥物的體內(nèi)存在狀態(tài)與血漿蛋白結(jié)合的強(qiáng)弱及結(jié)合率的高低決定分離萃取方法 指標(biāo)：提取回收率蛋白結(jié)合較強(qiáng)（非極性強(qiáng)）不宜直接采用溶劑萃取 ？有機(jī)溶劑沒(méi)選對(duì)？吲噠帕胺、偽麻黃堿！體內(nèi)濃度高低、代謝過(guò)程及其代謝產(chǎn)物決定分析檢測(cè)技術(shù)濃度較低（尤其有代

6、謝產(chǎn)物共存）代謝產(chǎn)物的干擾與特定代謝產(chǎn)物的同時(shí)測(cè)定采用HPLC或LC-MS等分析檢測(cè)技術(shù) 第十二張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月13二、分析測(cè)定的目的與要求 體內(nèi)藥物分析的目的影響分析方法的應(yīng)用藥代動(dòng)力學(xué)研究藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過(guò)程血漿濃度隨時(shí)間的變化過(guò)程；代謝途徑及代謝產(chǎn)物要求同時(shí)測(cè)定原形藥物和代謝產(chǎn)物 檢測(cè)寬線性范圍(CmaxCmax的1/20，4-5半衰期)、高靈敏度(10-9g/ml)和高專屬性(分離能力)(原形藥物及其代謝產(chǎn)物的分離)方法不必強(qiáng)調(diào)方法的簡(jiǎn)便、快速，按SOP，大多采用色譜及其脫線或在線聯(lián)用技術(shù)，如HPLC、LC-MS建立分析檢測(cè)方法的主要依據(jù)有：第十

7、三張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月14二、分析測(cè)定的目的與要求 臨床治療藥物監(jiān)測(cè) 藥物濃度通常在有效治療濃度范圍附近方法盡量簡(jiǎn)便、易行；適用于長(zhǎng)期、批量樣品的測(cè)定，大多采用UV、RIA或EIA等。？中毒患者的臨床搶救 藥物濃度極高方法不必強(qiáng)調(diào)方法的靈敏度，強(qiáng)調(diào)方法的特異性和分析速度大多采用色譜及其聯(lián)用技術(shù)GC、GC-MS、RIA或EIA ？第十四張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月15三、生物樣品的類型與預(yù)處理方法生物樣品的類型與預(yù)處理方法決定分析方法的應(yīng)用以血漿或血清為分析樣品采用蛋白沉淀、溶劑萃取預(yù)處理技術(shù)分析樣品較為“干凈”，可用HPLC檢測(cè)用RIA分析 ？FPIA法樣品的預(yù)

8、處理方法可較為粗放經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的蛋白沉淀或不經(jīng)任何預(yù)處理直接測(cè)定第十五張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月16四、實(shí)驗(yàn)室條件 在設(shè)計(jì)體內(nèi)藥物分析方法時(shí)，還應(yīng)充分考慮到實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的或有可能在其它實(shí)驗(yàn)室使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。 此外，還應(yīng)從方法的可行性、每個(gè)樣品測(cè)定耗時(shí)多少（10 min）、操作的難易及技術(shù)要求及儀器、設(shè)備要求、費(fèi)用多少等等方面加以考慮。第十六張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月17 在阿齊霉素制劑生物等效性研究過(guò)程中，血樣中阿齊霉素的濃度范圍為5 ng/ ml1g/ ml ，其檢測(cè)方法可采用HPLC 法、LC-MS 法和微生物法等數(shù)種方法。若用HPLC 法來(lái)檢

9、測(cè)該樣品，由于阿齊霉素的紫外吸收較弱，必須對(duì)樣品進(jìn)行富集濃縮，則樣品的前處理方法采用液-液萃取法為佳；若用LC-MS 法來(lái)檢測(cè)該樣品，則由于LC-MS 儀器的靈敏度足以檢測(cè)濃度為1ng/ml 以上的樣品，故樣品的前處理只需采用蛋白沉淀法即可；若用微生物法來(lái)檢測(cè)該樣品，則樣品連蛋白也不需沉淀，直接上樣即可。 例子 1第十七張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月18 當(dāng)然，用LC-MS 法來(lái)檢測(cè)阿齊霉素時(shí)，有些分析上作者采用了液-液萃取法，也有另一些分析工作者采用了固相萃取法來(lái)處理血樣，這些做法雖然行得通，但顯然它們不但增加了樣品處理的所需時(shí)間和工作量，而且增加了樣品處理的成本，因此阿齊霉素的血

10、樣處理最好采用蛋白沉淀法。第十八張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月19 蛋白沉淀法中，高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但從樣品的穩(wěn)定性角度考慮，阿齊霉素遇酸不穩(wěn)定，故只能采用甲醇沉淀法或乙腈沉淀法，考慮到乙腈沉淀蛋白效果優(yōu)于甲醇，且該方法阿齊霉素的回收率較高，故阿齊霉素血漿樣品的前處理方法以乙腈沉淀蛋白法為最佳。第十九張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月20 如果測(cè)定的是血清中頭孢拉定的濃度，頭孢拉定為-內(nèi)酰胺類抗生素，對(duì)酸穩(wěn)定，且酸有利于頭孢拉定的提取。蛋白沉淀法的選擇就要采用高氯酸沉淀法了。-具體問(wèn)題具體分析 -信息，查文獻(xiàn)例子 2第二十張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)

11、作于2022年6月21第二節(jié) 分析方法建立的一般步驟 一、分析方法的選擇二、分析方法的建立(一)檢測(cè)條件的篩選(二) 分離條件的篩選第二十一張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月22一、分析方法的選擇體內(nèi)藥物分析方法的設(shè)計(jì)受多種因素影響生物樣品中的藥物濃度決定分析方法的首要要因素生物樣品中藥物或其特定代謝產(chǎn)物的濃度低、樣品量少難以通過(guò)增加取樣量提高方法靈敏度通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄟm應(yīng)樣品分析需求。常用分析方法的檢測(cè)限度及分離能力見(jiàn)表4-1第二十二張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月23摘自:化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則 二五年三月 SFDA頒布（一）常用分析方法（1）色譜法：氣

12、相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS、LC-MS-MS，GC-MS，GC-MS-MS）等，可用于大多數(shù)藥物的檢測(cè)；（2）免疫學(xué)方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、熒光免疫分析法等，多用于蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)檢測(cè)；（3）微生物學(xué)方法，可用于抗生素藥物的測(cè)定。 從目前發(fā)展看，生物樣品的分析一般首選色譜法，如HPLC、GC法或LCMS、GCMS法，這類方法靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性一般都能適應(yīng)臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的需要，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室也具備條件，因此應(yīng)用最廣，大約90%的藥物濃度測(cè)定可以用色譜法來(lái)完成。具體選用何種分析方法應(yīng)根據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、儀器條件以及借鑒文獻(xiàn)方法多

13、方面因素來(lái)考慮確定。第二十三張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月24二、分析方法的建立初步擬定分析方法后進(jìn)行一系列試驗(yàn)工作，以選擇最佳分析條件同時(shí)驗(yàn)證分析方法的可行性，以確認(rèn)是否適用于實(shí)際生物樣品分析方法的建立步驟第一步：檢測(cè)條件的篩選第二步：分離條件的篩選第二十四張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月25(一)檢測(cè)條件的篩選 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 照擬定的分析方法(不包括生物基質(zhì)的預(yù)處理)測(cè)定 確定最佳分析檢測(cè)條件(如色譜條件)和檢測(cè)靈敏度HPLC 調(diào)整檢測(cè)器(類型、條件) 、色譜柱(型號(hào)、牌號(hào)、填料性狀與粒經(jīng)、柱長(zhǎng)度)、流動(dòng)相(組分及其配比)及其流速、柱溫、進(jìn)樣量、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度及其加入量等 使

14、各物質(zhì)具有足夠的方法靈敏度(LOQ ) 良好的色譜參數(shù)(n、R、T) 適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間(tR)第二十五張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月26(二)分離條件的篩選在進(jìn)行分離條件篩選時(shí)，應(yīng)考察生物基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物對(duì)分離與檢測(cè)的干擾，步驟如下：1空白溶劑試驗(yàn) 溶劑(方法特異性)2空白生物基質(zhì)試驗(yàn) (方法特異性)3模擬生物樣品試驗(yàn) 方法效能指標(biāo)4實(shí)際生物樣品測(cè)試 代謝產(chǎn)物(方法特異性)第二十六張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月271空白溶劑試驗(yàn)待測(cè)藥物的非生物基質(zhì)溶液（通常為水溶液）采用擬定的分析方法進(jìn)行衍生化反應(yīng)、萃取分離等 樣品預(yù)處理（反應(yīng)試劑、衍生化試劑、萃取溶劑等）測(cè)定響

15、應(yīng)信號(hào)（如HPLC峰面積或峰高）考察目標(biāo)方法的特異性空白值應(yīng)盡可能小，并能有效校正第二十七張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月28對(duì)色譜分析法而言可通過(guò)改變反應(yīng)條件、萃取方法或萃取條件（萃取溶劑的極性、混合溶劑的配比，固相萃取填料性質(zhì)、沖洗劑與洗脫劑及其用量等），甚至檢測(cè)器類型空白試劑信號(hào)應(yīng)不干擾藥物的測(cè)定（如R1.5） 本步驟主要考察需經(jīng)化學(xué)反應(yīng)的預(yù)處理過(guò)程，若預(yù)處理過(guò)程僅為生物樣品的提取分離，則可不進(jìn)行該步驟，直接進(jìn)行空白生物基質(zhì)試驗(yàn) 第二十八張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月292. 空白生物基質(zhì)試驗(yàn)空白生物基質(zhì) (blank biological matrix)如空白血漿按

16、“空白溶劑試驗(yàn)” 項(xiàng)下方法操作考察目標(biāo)生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾（方法特異性）在待測(cè)藥物(或特定的活性代謝物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)等)的“信號(hào)窗” 內(nèi)不應(yīng)出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)信號(hào)第二十九張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月30celecoxib塞來(lái)考昔第三十張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月313. 模擬生物樣品試驗(yàn) 模擬生物樣品空白生物基質(zhì)中加入待測(cè)藥物，照 “空白溶劑試驗(yàn)” 項(xiàng)下方法操作考察目標(biāo)：方法的線性范圍、精密度與準(zhǔn)確度、靈敏度、藥物的萃取回收率等各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo) 同時(shí)進(jìn)一步檢驗(yàn)生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)以及可能共同使用的其他藥物對(duì)測(cè)定的干擾程度，即方法特異性第三十一張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2

17、022年6月32對(duì)色譜分析法而言進(jìn)一步考察待測(cè)藥物、內(nèi)標(biāo)物與內(nèi)源性物質(zhì)(或其它藥物)的分離情況如色譜峰的 tR、n 和 T 是否與水溶液的一致 色譜峰是否為單一成分（如何確定？） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距是否顯著偏離零點(diǎn)等均可說(shuō)明內(nèi)源性物質(zhì)是否對(duì)待測(cè)藥物或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)構(gòu)成干擾第三十二張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月334. 實(shí)際生物樣品的測(cè)試 空白生物基質(zhì)和模擬生物樣品試驗(yàn)確定的分析方法及其條件不能完全確認(rèn)是否適合于實(shí)際生物樣品的測(cè)定藥物在體內(nèi)可能與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合(如血漿蛋白結(jié)合物)或代謝生成數(shù)個(gè)代謝產(chǎn)物及其進(jìn)一步的結(jié)合物(或綴合物)實(shí)際生物樣品確立分析方法后，尚需進(jìn)行實(shí)際生物樣品的測(cè)試考察目標(biāo)：代

18、謝產(chǎn)物對(duì)藥物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的干擾情況進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可行性 ？第三十三張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月34空白血漿空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液志愿者實(shí)際樣品空白溶劑試驗(yàn) 多余？第三十四張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月35第三節(jié) 分析方法驗(yàn)證的內(nèi)容與要求 基于以下原因需要對(duì)建立的分析方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證：1、生物樣品量少2、藥物或活性代謝產(chǎn)物濃度低3、內(nèi)源性物質(zhì)的干擾4、生物的個(gè)體差異較大第三十五張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月36（二）方法學(xué)確證建立可靠的和可重復(fù)的定量分析方法是進(jìn)行臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的關(guān)鍵之一。為了保證分析方法可靠，必須對(duì)方法進(jìn)行充分確證，一般應(yīng)進(jìn)行以下幾方面的考察：

19、1、特異性(Specificity)2、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍（Calibration Curve）3、定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ）4、精密度與準(zhǔn)確度（Precision and Accuracy）5、樣品穩(wěn)定性(Stability)6、提取回收率7、微生物學(xué)和免疫學(xué)方法確證8、方法學(xué)質(zhì)控摘自:化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則 第三十六張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月37 用于實(shí)際生物樣品分析之前： 需要驗(yàn)證 (validation) 分析方法的可行性與可靠性方法驗(yàn)證時(shí)應(yīng)考慮影響分析方法的所有可變因素： 取樣、樣品制備、色譜分離、檢測(cè)與

20、數(shù)據(jù)評(píng)價(jià) 使用的樣品通常采用模擬生物樣品和用藥后的實(shí)際生物樣 驗(yàn)證的技術(shù)指標(biāo)效能指標(biāo)第三十七張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月38驗(yàn)證步驟首先為分析方法的驗(yàn)證特異性、精密度與準(zhǔn)確度、回收率、定量限與檢測(cè)限、穩(wěn)定性等其次為生物基質(zhì)中待測(cè)藥物穩(wěn)定性的驗(yàn)證室溫放置、冷凍（或冷藏）、凍-融循環(huán) Freeze-and-thaw cycle第三十八張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月39驗(yàn)證的效能指標(biāo)與基本要求1特異性（專屬性）避免干擾2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍覆蓋所有濃度范圍3準(zhǔn)確度與實(shí)際狀況相符4精密度結(jié)果可重現(xiàn)5定量限達(dá)到峰濃度的1/101/206穩(wěn)定性確保所有樣品準(zhǔn)確測(cè)定7提取回收率確保檢測(cè)的

21、靈敏度第三十九張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月40一、方法特異性(專屬性或選擇性) 方法的特異性(specificity)又稱專屬性或?qū)Ｒ恍裕ǔＥc選擇性(selectivity)互用系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時(shí)，方法準(zhǔn)確測(cè)定待測(cè)物質(zhì)的能力，通常表示所檢測(cè)的信號(hào)(響應(yīng))系屬于待測(cè)藥物所特有選擇性包括將待測(cè)物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分(分離)的能力特異性函蓋二者，以驗(yàn)證所測(cè)定的物質(zhì)與待測(cè)藥物的同一性 特異性用于考察方法的抗干擾程度。如果特異性不佳，方法的準(zhǔn)確度、精密度、線性都將受到影響。因此確保特異性是建立和驗(yàn)證一個(gè)分析方法的第一步。第四十張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4

22、11. 內(nèi)源性物質(zhì)的干擾比較待測(cè)藥物或其活性代謝產(chǎn)物的對(duì)照品 （或標(biāo)準(zhǔn)品） 空白生物基質(zhì) 模擬生物樣品（空白生物基質(zhì)中添加對(duì)照品）的檢測(cè)信號(hào)如HPLC色譜峰的 tR、n 和拖尾因子（T） 是否一致，以及與內(nèi)源性物質(zhì)色譜峰的分離度（R）確證內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)分析方法有無(wú)干擾考察一個(gè)分析方法是否具有特異性，應(yīng)著重考慮以下幾點(diǎn)：第四十一張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月422. 代謝產(chǎn)物的干擾 比較模擬生物樣品和用藥后的實(shí)際生物樣品的檢測(cè)信號(hào)如HPLC中藥物色譜峰的 tR、n 和 T 是否一致，或改變色譜條件(色譜柱)再比較，以及與代謝產(chǎn)物的R，來(lái)確證代謝產(chǎn)物對(duì)分析方法有無(wú)干擾。結(jié)構(gòu)已知的特定活性代

23、謝物的測(cè)定通過(guò)HPLC-DAD和LC-MS確證色譜峰的單純性和同一性對(duì)于結(jié)構(gòu)未知的代謝產(chǎn)物的測(cè)定采用LC-LC-NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)的初步推測(cè)后，考察其干擾情況。第四十二張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月43 對(duì)于色譜法至少要考察6個(gè)不同個(gè)體的空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對(duì)照物質(zhì)色譜圖（注明濃度）及用藥后的生物樣品色譜圖，以反映分析方法的特異性。對(duì)于以軟電離質(zhì)譜為基礎(chǔ)的檢測(cè)法（LC-MS、LC-MS-MS）應(yīng)注意考察分析過(guò)程中的介質(zhì)效應(yīng)，如離子抑制等。摘自:化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則 第四十三張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月443. 伍用藥物的干擾TDM時(shí) 還要考慮

24、患者可能同時(shí)服用藥物的干擾 通過(guò)比較待測(cè)藥物及可能同時(shí)服用藥物的模擬生物樣品的檢測(cè)信號(hào)如HPLC色譜峰的 tR、n 和 T 是否一致來(lái)確證同時(shí)服用藥物對(duì)分析方法的干擾情況第四十四張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月454. 與參比方法的相關(guān)性 除上述方法外，有時(shí)還可使用參比方法對(duì)照法。參比方法一般選用特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、線性關(guān)系良好的色譜法。如在TDM中使用UV(或RIA)時(shí), 可以HPLC(或GC)為參比 參比方法測(cè)定結(jié)果為橫坐標(biāo)(X); 擬定方法結(jié)果為縱坐標(biāo)(Y)用最小二乘法計(jì)算回歸方程 YabX (坐標(biāo)標(biāo)度相等)、相關(guān)系數(shù)(r)表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性，若 r 1，表示擬定方法為

25、非線性，如 RIA 中抗血清滴度選擇不當(dāng)?shù)谒氖鍙?，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月464. 與參比方法的相關(guān)性YabX 截距(a) 表示擬定方法受到恒定干擾的程度內(nèi)源性物質(zhì)(UV)斜率(b) 表示擬定方法受到比例干擾的程度標(biāo)記抗原不純(RIA) 與參比方法的相關(guān)性比較，除顯示分析方法的特異性外，還反映分析方法的準(zhǔn)確度。斜率b表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性若參比方法準(zhǔn)確度良好，且截距a0, 則擬定方法的準(zhǔn)確度(回收率)為100b(%)第四十六張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月47二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線（standard curve） 校正（calibration curve）

26、or 工作 （working curve）指生物樣品中所測(cè)定藥物濃度與響應(yīng)（峰面積或峰高）的相關(guān)性（呈比例的程度）通常用回歸分析方法所得的回歸方程來(lái)評(píng)價(jià)除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標(biāo)準(zhǔn)曲線通常為線性模式常用的回歸分析法為最小二乘法（least squares）或加權(quán)最小二乘法（weighted least squares）線性范圍（linear rang）標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高與最低濃度的區(qū)間在此線性范圍內(nèi)，模擬生物樣品的測(cè)定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度和準(zhǔn)確度第四十七張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月48二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍(續(xù))標(biāo)準(zhǔn)曲線用模擬生物樣品建立線性范圍(不包括零點(diǎn))應(yīng)能覆蓋全部生物

27、樣品中的藥物濃度不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線所使用的模擬生物樣品應(yīng)使用與待測(cè)的含藥生物樣品相同的生物基質(zhì)制備第四十八張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月49標(biāo)準(zhǔn)曲線的一般建立過(guò)程： 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備內(nèi)標(biāo)溶液的制備 標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備、測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制加權(quán)最小二乘法限度要求第四十九張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月50標(biāo)準(zhǔn)曲線的一般建立方法 1. 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照品、標(biāo)準(zhǔn)品溶劑水或甲醇（或其他適當(dāng)溶劑）濃度模擬生物樣品中藥物濃度的50倍以上加入量為生物樣品總體積的2%以下避免標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品與實(shí)際樣品存在較大差異。難溶性藥物，濃

28、度較低應(yīng)除去溶劑后再加入生物基質(zhì) 結(jié)晶？否則,在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)應(yīng)加入等體積的溶劑并渦旋混勻 第五十張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月51至少含58個(gè)濃度點(diǎn)(不包括零點(diǎn)，即空白)可覆蓋全部待測(cè)生物樣品中的藥物濃度如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式比例常數(shù)約為 2)若體內(nèi)平均達(dá)峰濃度為50，其1/20為2.5設(shè)定最高濃度為100，最低濃度為1 (個(gè)體差異)第五十一張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月522、內(nèi)標(biāo)溶液的制備內(nèi)標(biāo)物質(zhì)對(duì)照品、標(biāo)準(zhǔn)品或化學(xué)試劑適宜的溶劑甲醇、水、乙腈或混合溶劑濃度與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的中間濃度相當(dāng)如：某標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、20、40、80、160、3

29、20 g/ml，則內(nèi)標(biāo)的濃度應(yīng)配制成40 g/ml 在這里，加內(nèi)標(biāo)溶液時(shí)并沒(méi)有象標(biāo)準(zhǔn)溶液那樣要求加入量為生物樣品總體積的2%以下，為什么？第五十二張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月533. 標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備 空白生物基質(zhì)(如血漿)加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液適量，渦旋混勻 標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品的最高濃度應(yīng)高于生物體用藥后的達(dá)峰濃度，最低濃度應(yīng)低于Cmax的105。 目的涵蓋為防止在標(biāo)準(zhǔn)溶液加入及渦旋混合時(shí)造成的損失 ？先加入標(biāo)準(zhǔn)溶液 再加入空白生物基質(zhì)渦旋混勻 第五十三張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月544. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以待測(cè)藥物的檢測(cè)響應(yīng)(如色譜峰面積或峰高) 或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)

30、響應(yīng)的比值(內(nèi)標(biāo)法)(因變量, y )對(duì)模擬血藥濃度 (自變量,x)求得回歸方程( yabx )及其相關(guān)系數(shù)( )在一組由至少7個(gè)濃度(不包括零點(diǎn))構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，至多可有2個(gè)濃度點(diǎn)數(shù)據(jù)，可予剔除。但應(yīng)有確切原因，如：（1）樣品處理有損失；（2）色譜圖有問(wèn)題；（3）顯著偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線其余應(yīng)有至少5個(gè)濃度點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上第五十四張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月555. 加權(quán)最小二乘法 普通最小二乘法每個(gè)濃度點(diǎn)絕對(duì)誤差(yiyi)賦予同等的重要性 若標(biāo)準(zhǔn)曲線上的高低濃度相差懸殊(范圍達(dá)102)低濃度區(qū)的計(jì)算值相對(duì)誤差過(guò)大，難以滿足規(guī)定要求。加權(quán)最小二乘法回歸計(jì)算時(shí)增加一個(gè)權(quán)重因子(w)各濃度

31、的響應(yīng)值與回歸值的相對(duì)離差平方和達(dá)到最小 式中，wi為標(biāo)準(zhǔn)曲線上第i個(gè)濃度點(diǎn)的權(quán)重因子第五十五張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月561）回歸方程(y = a + b x)參數(shù)的計(jì)算現(xiàn)在有專業(yè)軟件第五十六張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月572）權(quán)重因子的選擇選擇加權(quán)因子時(shí)兼顧考慮曲線上高、中、低各濃度點(diǎn)的準(zhǔn)確度，賦予低濃度點(diǎn)以更大的權(quán)重在實(shí)際工作中的一般方法（1）當(dāng)wi=1/(yi)2時(shí)，則（2）而yi與xi成正比（3）所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2 當(dāng)高濃度點(diǎn)測(cè)量值的準(zhǔn)確度下降過(guò)大低濃度點(diǎn)權(quán)重過(guò)大，降低低濃度點(diǎn)的權(quán)重，wi=k/xi第五十七張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2

32、022年6月58標(biāo)準(zhǔn)曲線的限度要求標(biāo)準(zhǔn)曲線至少包括5個(gè)濃度(通常為58個(gè)濃度,不包括零點(diǎn))最高濃度應(yīng)高于用藥后生物體內(nèi)藥物的達(dá)峰濃度(Cmax)，最低濃度應(yīng)為方法的LOQ(非LOD)，并應(yīng)低于Cmax的105（1/10-1/20）若標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍較寬，可分為高低兩個(gè)濃度區(qū)間(每個(gè)區(qū)間不少于5個(gè)濃度)，分別加權(quán)回歸如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200相關(guān)系數(shù)要求 0.99(色譜法)或0.98(生物學(xué)方法)回歸方程的截距應(yīng)接近于零，b1使之具有較高的靈敏度-與坐標(biāo)的標(biāo)度選擇有關(guān)在藥代動(dòng)力學(xué)或生物利用度研究中：第五十八張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月59三、準(zhǔn)確度 方

33、法準(zhǔn)確度(accuracy)系指用該方法測(cè)得的生物樣品中待測(cè)藥物的濃度與其真實(shí)濃度的接近程度理論上應(yīng)使用實(shí)際生物樣品測(cè)定，但實(shí)際生物樣品的濃度是未知的。所以，通常使用模擬生物樣品測(cè)定，以測(cè)得的濃度與添加的理論濃度比較計(jì)算求得。一般用相對(duì)回收率(relative recovery，RR) 或 相對(duì)誤差(relative error，RE)表示第五十九張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月601. 測(cè)定法 取空白生物基質(zhì)（如血漿）數(shù)份，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作，在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)制備質(zhì)控(quality control，QC)樣品高(接近上限)、中、低(接近LOQ) 3個(gè)濃度每一濃度至少5個(gè)樣本與隨

34、行的標(biāo)準(zhǔn)曲線同法測(cè)定、計(jì)算，每個(gè)樣品分析測(cè)定1次 ，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)得的濃度第六十張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月612. 結(jié)果計(jì)算與限度要求 計(jì)算測(cè)定值M(measured)的平均值與理論濃度(加入值)A(added)比值相對(duì)回收率相對(duì)誤差限度要求相對(duì)回收率應(yīng)在85%115% (LOQ附近80%120%)RE在15% (LOQ附近為20%)第六十一張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月62四、精密度 方法精密度(precision )系指每次測(cè)定結(jié)果與多次測(cè)定的平均值的偏離程度表示該分析方法的可重復(fù)性(reproducibility)反映分析方法的可操作性，是方法驗(yàn)證的基本要點(diǎn)之一

35、理論上，精密度應(yīng)使用實(shí)際生物樣品測(cè)定。但實(shí)際上生物樣品的量有限(如血漿，一般為0.52ml)使用模擬生物樣品測(cè)定，且通常與方法準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)同時(shí)進(jìn)行，如日內(nèi)精密度即可使用方法準(zhǔn)確度的測(cè)定數(shù)據(jù)計(jì)算。第六十二張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月631. 表示方法方法精密度一般用標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，SD)或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)表示 SD=RSD= =在體內(nèi)藥物分析中，方法精密度一般用RSD表示。第六十三張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月64 批內(nèi)(within-run或intra-assay)RSD 系指在同

36、一分析批內(nèi)測(cè)定結(jié)果之間的RSD。一個(gè)分析批通常在一個(gè)工作日內(nèi)完成，又稱為日內(nèi)(within-day)RSD。 無(wú)論是藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)或治療藥物監(jiān)測(cè)監(jiān)測(cè)，通常在一個(gè)工作日內(nèi)難以完成全部樣品的分析。在不同工作日之間的實(shí)驗(yàn)條件有可能發(fā)生微小變化，對(duì)分析結(jié)果有可能產(chǎn)生影響。所以，方法精密度除要考察批內(nèi)RSD 外，同時(shí)還有考察批間RSD。 批間(between-run或inter-assay)RSD 系指在不同分析批的測(cè)定結(jié)果之間的RSD。因不同分析批通常是在不同的工作日內(nèi)完成，又稱為日間(between-day，day-to-day)RSD。第六十四張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月652. 測(cè)定

37、法分別測(cè)定法()取空白生物基質(zhì)(如血漿)數(shù)份，照準(zhǔn)確度項(xiàng)下方法，分別在同一批內(nèi)和不同批間制備高、中、低 3個(gè)濃度的QC樣品，并分析測(cè)定批內(nèi)RSD：一個(gè)工作日內(nèi)完成，隨行制備一條標(biāo)準(zhǔn)曲線和每一濃度56個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)定1次，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算3個(gè)濃度的RSD批間RSD：在至少5個(gè)工作日內(nèi)完成，每一工作日內(nèi)完成一個(gè)分析批的測(cè)定。每一分析批內(nèi)制備一條標(biāo)準(zhǔn)曲線和每一濃度1個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)定1次；用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3個(gè)濃度(每一濃度56個(gè)分析批數(shù)據(jù))的RSD第六十五張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月662. 測(cè)定法若實(shí)際樣品測(cè)定所用的分析批次少于5批，也可進(jìn)行3個(gè)批次的連續(xù)分析(每1濃度的

38、每1批次為56個(gè)樣本)采用多次分析的方差分析法 批間RSD =批內(nèi)RSD = =批內(nèi)與批間RSD第六十六張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月673. 限度要求在藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度研究中對(duì)g/ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng)10%ng/ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng)15%在LOQ附近RSD應(yīng)20%。 第六十七張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月68五、定量限方法定量限(limit of quantitation，LOQ)系指在保證具有一定可靠性(準(zhǔn)確度與精密度符合要求)的前提下，能測(cè)定出生物樣品中藥物的最低濃度，又稱為方法靈敏度(sensitivity)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)(最低濃度點(diǎn)LOQ)要

39、求應(yīng)能滿足測(cè)定35個(gè)消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度或Cmax的105準(zhǔn)確度在80%120%(或RE在20%的范圍內(nèi))RSD20%第六十八張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月69最低檢測(cè)限（limit of detection LOD）：是指可在噪音水平下識(shí)別生物樣品中藥物的最低濃度，一般認(rèn)為信噪比（S/N）3，信號(hào)可被檢測(cè)，故以S/N3時(shí)的樣品濃度作為L(zhǎng)OD。 LOQ的檢測(cè)信號(hào)至少是LOD的2倍以上，以（S/N）10 作為 LOQ 的估計(jì)值。第六十九張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月70LOD TestS/N3第七十張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月71六、穩(wěn)定性 生物樣品量

40、較大時(shí)，在一個(gè)工作日內(nèi)難以完成全部樣品的分析；有時(shí)樣品需進(jìn)行復(fù)測(cè)。因此生物樣品及其預(yù)處理后的殘?jiān)蛉芤旱姆€(wěn)定性就顯得尤為重要。需要對(duì)樣品的存放條件和時(shí)間進(jìn)行考察，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠 方法穩(wěn)定性 生物樣品的穩(wěn)定性穩(wěn)定性第七十一張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月72（一）方法穩(wěn)定性：首先考察待測(cè)藥物的標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)標(biāo)、衍生化試劑）或其分析溶液在實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度、光照及暴露空氣等條件下的穩(wěn)定性； 在分析方法的建立時(shí)要考慮模擬生物樣品的預(yù)處理過(guò)程（提取、凈化及相轉(zhuǎn)移）及待測(cè)物（蒸干后的殘?jiān)捌淙芤海┰谑覝鼗虮渲写娣诺姆€(wěn)定性。第七十二張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月73短期穩(wěn)定性：

41、主要考察模擬生物樣品在室溫、4或20以及凍融循環(huán)條件下的穩(wěn)定性（二）生物樣品的穩(wěn)定性長(zhǎng)期穩(wěn)定性：主要考察生物樣品長(zhǎng)期冰凍（20 或80）后的穩(wěn)定性，考察期限從生物樣品的采集到分析完畢的整個(gè)時(shí)間區(qū)間。第七十三張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月74測(cè)定方法與要求1、取高、中、低三個(gè)濃度的QC樣品，在不同條件下存放不同時(shí)間后，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，平均值應(yīng)為零時(shí)測(cè)定的5以內(nèi)（經(jīng)衍生化處理15以內(nèi)）。若考察時(shí)間大于1天，則應(yīng)與新制QC樣品比較，若考察時(shí)間很長(zhǎng)，可與在液氮中保存的樣品在相同條件下的測(cè)定值比較2、穩(wěn)定性期限要求室溫下存放一般僅考察1個(gè)工作日（如1、2、4、8、24h）冰箱中數(shù)個(gè)工作日

42、（或數(shù)星期、數(shù)月）第七十四張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月75七、萃取回收率（Extaction recovvvery） 從生物樣品基質(zhì)中回收得到分析物質(zhì)的響應(yīng)值與加入的標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值的百分比即為分析物的萃取回收率。也可以說(shuō)是將供試生物樣品中分析物萃取出來(lái)供分析的比例。 應(yīng)考察高、中、低 3 個(gè)濃度的萃取回收率，其結(jié)果應(yīng)當(dāng)精密和可重現(xiàn)第七十五張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月761. 測(cè)定法取空白生物基質(zhì)(如血漿)，制備高、中、低3個(gè)濃度的QC樣品(每一濃度至少5個(gè)樣品)，每個(gè)樣品分析測(cè)定1次另取等量的相同3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用溶解模擬生物樣品經(jīng)提取處理后的殘?jiān)娜軇┫♂屩镣w積

43、，同法測(cè)定AT經(jīng)萃取后的QC樣品的檢測(cè)信號(hào)或比值(內(nèi)標(biāo)法)AS未經(jīng)萃取的標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)信號(hào)或比值(內(nèi)標(biāo)法)第七十六張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月77實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)1、要考察是內(nèi)源性物質(zhì)還是提取方法對(duì)提取回收率產(chǎn)生影響2、測(cè)定回收率時(shí)，如采用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)應(yīng)在提取之后，溶劑蒸發(fā)之前加入3、采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，應(yīng)同時(shí)測(cè)定內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的提取回收率，只需配制一個(gè)中間濃度的QC樣品5份，同法測(cè)定。第七十七張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月782. 限度要求在生物利用度或 TDM 時(shí)高、中、低濃度樣品的萃取回收率一般應(yīng)70%高、中濃度的RSD應(yīng)15%低濃度的RSD應(yīng)20%內(nèi)標(biāo)法中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的提

44、取回收率應(yīng)50%（RSD 15%) 第七十八張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月79（1）方法準(zhǔn)確度(或相對(duì)回收率，relative recovery) （2）萃取回收率(絕對(duì)回收率，absolute recovery) 萃取回收率與相對(duì)回收率的比較：（1）萃取回收率主要考察生物樣品預(yù)處理過(guò)程造成的藥物的程度損失（2）相對(duì)回收率主要用來(lái)考察測(cè)定方法的準(zhǔn)確度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確計(jì)算生物樣品中藥物濃度第七十九張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月80有時(shí)，低濃度的回收率大大低于高濃度的回收率，其原因可能是疏水性藥物易被玻璃器皿或聚乙烯管表面吸附。 解決辦法：表面硅烷化處理或加入可降低吸附的試

45、劑如異丙醇、異戊醇、乙二胺等。第八十張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月81八、質(zhì)量控制1、質(zhì)控樣品（Quality control QC）：是指將已知量的待測(cè)藥物加入到空白生物基質(zhì)中配制的模擬生物樣品，用于整個(gè)分析過(guò)程中的質(zhì)量控制，一般配制高、中、低三個(gè)濃度的樣品 分析方法建立并通過(guò)驗(yàn)證后，方可進(jìn)行實(shí)際生物樣品的測(cè)定，此時(shí)仍需對(duì)分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控！ 質(zhì)控樣品池由不負(fù)責(zé)生物樣品測(cè)試的人員（推薦由獨(dú)立的人員）在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)制備，并與實(shí)際生物樣品在相同條件下儲(chǔ)存第八十一張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月822、質(zhì)量控制（1）測(cè)定法：在測(cè)定過(guò)程中，每批生物樣品都應(yīng)建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并隨

46、行間隔以高低或低高測(cè)定高、中、低至少3個(gè)濃度的6個(gè)QC樣品（2）限度要求：6個(gè)QC樣品中至少4個(gè)的測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度在各自正常濃度80120，RSD 20%，允許有2個(gè)QC樣品超出各自的20第八十二張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月83 由于生物基質(zhì)中存在內(nèi)源性的該物質(zhì)，難以測(cè)定方法的LOQ和準(zhǔn)確度，此時(shí)可通過(guò)以下方法制備空白生物基質(zhì)：1、對(duì)生物基質(zhì)進(jìn)行處理-活性炭濾過(guò)、透析2、使用不含內(nèi)源性物質(zhì)的生物基質(zhì)周期性變化的內(nèi)源性物質(zhì)如某些激素。3、使用替代基質(zhì)如兔血漿、人血清蛋白、緩沖液九、生物樣品測(cè)定中其它情況（一）作為外源性藥物使用的內(nèi)源性物質(zhì)的測(cè)定第八十三張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于202

47、2年6月84出現(xiàn)以下情況時(shí)，分析方法需進(jìn)行再評(píng)價(jià)或交互驗(yàn)證：1、改變色譜條件或生物樣品的處理方法樣品的前處理方法改變后需要對(duì)效能指標(biāo)進(jìn)行重新考察2、改變生物基質(zhì) 不同物種的同種生物基質(zhì)（大鼠血漿 人血漿）、同一物種的不同生物基質(zhì)（血漿 血清）、甚至使用相同基質(zhì)而使用不同抗凝劑等。（二）方法的再評(píng)價(jià)或交互驗(yàn)證：第八十四張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月85（三）實(shí)際濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的處理：1、濃度高于定量上限取樣品用空白基質(zhì)稀釋，同時(shí)制備高于定量上限的QC樣品，同法稀釋后測(cè)定，以確認(rèn)稀釋的有效性。2、濃度低于LOQ增加生物樣品的體積，使測(cè)定液的濃度高于LOQ。應(yīng)在相同條件下制備QC樣品和增

48、加體積后的空白生物基質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，以確認(rèn)方法的準(zhǔn)確度、精密度和特異性符合要求。第八十五張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月86第四節(jié) 體內(nèi)藥物分析方法應(yīng)用示例第三代喹諾酮類廣譜抗菌藥鹽酸環(huán)丙沙星片人體生物等效性研究一、文獻(xiàn)調(diào)研在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中極微溶解，在氯仿中幾乎不溶，在氫氧化鈉試液中易溶；環(huán)丙沙星游離體在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中極微溶解，在稀醋酸中溶解。 第八十六張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月87藥動(dòng)學(xué)參數(shù)吸收過(guò)程空腹口服后吸收迅速、人體生物利用度約為49%70%Cmax 口服500mg后平均Cmax為2.42.6mg/LTmax 12hT1/2 血中T1/

49、2約為4h，腎功能減退時(shí)稍有延長(zhǎng)至6h蛋白結(jié)合率20%40%代謝口服給藥24h內(nèi)，40%50%原形、15%代謝物經(jīng)腎排出第八十七張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月88體內(nèi)分析方法RP-HPLC色譜柱ODS色譜柱流動(dòng)相甲醇(乙腈)-磷酸(枸櫞酸)緩沖液(三乙胺調(diào)節(jié)pH2.33.5)，或離子對(duì)色譜: 溴化十六烷基三甲基銨(氫氧化四丁基銨)檢測(cè)紫外或熒光檢測(cè)生物樣品預(yù)處理蛋白沉淀法甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接進(jìn)樣溶劑萃取法二氯甲烷-異丙醇、氯仿-異丙醇混合溶劑蛋白沉淀-溶劑萃取乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-異丙醇提取 第八十八張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月89二、分析方法設(shè)計(jì)1分析方法

50、血漿蛋白結(jié)合率低(20%40%)、以原形從腎排泄生物等效性研究測(cè)定血漿中環(huán)丙沙星原形藥物的濃度-時(shí)間曲線。初步擬定：采用RP-HPLC法2檢測(cè)方法紫外靈敏度1ng，若取血漿0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100l進(jìn)樣，則要求血漿中環(huán)丙沙星濃度在50ng/ml以上，當(dāng)Cmax在2g/ml以上(口服500mg)時(shí)基本可滿足生物等效性研究要求熒光靈敏度0.1ng，能滿足本試驗(yàn)要求 第八十九張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月903樣品制備方法初步擬定采用簡(jiǎn)便、快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接進(jìn)樣分析預(yù)試含75%乙腈的提取液100l進(jìn)樣后，色譜峰理論板數(shù)、對(duì)稱性下降(前沿峰)，進(jìn)而導(dǎo)致

51、檢測(cè)靈敏度降低(峰高降低)經(jīng)進(jìn)一步試驗(yàn)，確定為：血漿0.5ml乙腈1ml沉淀蛋白二氯甲烷-異丙醇(95:5)5ml萃取60氮?dú)饬鞔蹈闪鲃?dòng)相200l溶解20l進(jìn)樣靈敏度可達(dá)2ng/ml(血漿濃度)，符合要求(Cmax2g/ml) 第九十張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月91三、實(shí)驗(yàn)方案1給藥方案 20名受試者隨機(jī)分為兩組，每組10人第1次試驗(yàn)第一組口服受試制劑(相當(dāng)于環(huán)丙沙星500mg)，第二組口服相同劑量的參比制劑第2次試驗(yàn)第1次服藥后第7天（有足夠長(zhǎng)的清洗期）開(kāi)始，兩組交換給藥第九十一張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月922血樣的采集與處理分別口服給藥前和給藥后0.25、0.5、

52、1.0、1.5(tmax)、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0和24.0(57個(gè)t1/2)小時(shí)由肘正中靜脈取血 4 ml立即移入經(jīng)肝素處理的離心試管中，靜置5分鐘后，離心15分鐘(3000rpm)，分離血漿，-20冰箱中保存待測(cè)第九十二張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月933血樣分析法色譜條件高效液相色譜儀(包括LC-10ATvp泵，RF-530熒光檢測(cè)器)；色譜柱為Kromasil ODS-AP(200mm4.6 mm，5m)流動(dòng)相為乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(86:14)，流速1.0ml/min激發(fā)波長(zhǎng)為ex=277nm，發(fā)射em=445nm柱溫為40。 第九十

53、三張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月943血樣分析法血漿樣品的預(yù)處理取血漿0.5ml，加內(nèi)標(biāo)溶液(10g/ml諾氟沙星甲醇溶液）50 l、乙腈1.0ml，渦旋混合30s，離心5min，取上清液1ml，加二氯甲烷-異丙醇(95:5)混合溶劑5ml，渦旋振蕩1min，離心5min，棄去上層水相，吸取下層有機(jī)相，60下氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)恿鲃?dòng)相200l，渦旋溶解30s，離心5min，取上清液20l進(jìn)樣 第九十四張，PPT共一百頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月95四、分析方法驗(yàn)證1方法特異性環(huán)丙沙星峰tR=12.4min，諾氟沙星(內(nèi)標(biāo)物質(zhì))tR=10.9min，各峰均獲得完全分離，內(nèi)源性物質(zhì)峰(與空白血漿樣品一致)tR=8.6min對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。志愿者用藥后的血漿樣品色譜圖中環(huán)丙沙星與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰與模擬血漿樣品中環(huán)丙沙星與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的tR、T、n和R均一致，峰形相同。故