第1部分蛋白質(zhì)

1、第1部分蛋白質(zhì)三、蛋白質(zhì)的特征元素-氮 含氮量較恒定，一般在16%左右 蛋白質(zhì)系數(shù)6.25 蛋白質(zhì)含量 = 樣品含氮量6.25百分率（%）百分率（%）Fe00.8S0.232.4Cu IZn P00.8Mn第二節(jié) 蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位-氨基酸COOH|H2N C H|R非蛋白氨基酸（二百余種）氨基酸蛋白氨基酸基本氨基酸稀有氨基酸一、結(jié)構(gòu)特點與分類1. 結(jié)構(gòu)特點：所有20 種基本氨基酸的結(jié)構(gòu)通式特點：-氨基酸 (脯氨酸除外) L-氨基酸（甘氨酸除外）中文：如 丙氨酸；英文：三字母符號（Ala）和單字母符號（A） 2. 分類 根據(jù)各氨基酸R基的帶電性 將20種氨基酸共分為四組： 非極性R基氨基酸

2、極性不帶電荷R基氨基酸 帶負電荷R基氨基酸 （酸性氨基酸） 帶正電荷R基氨基酸（堿性氨基酸）表示：3. 稀有氨基酸：蛋白質(zhì)合成后經(jīng)加工修飾而生成的氨基酸。4羥基脯氨酸賴氨酸5羥基賴氨酸二、必需氨基酸（8種）： 人體不能自我合成，必須從外界中攝取的氨基酸賴氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、色氨酸氨基酸丙氨酸纈氨酸亮氨酸異亮氨酸苯丙氨酸色氨酸甲硫氨酸脯氨酸三字母 符號 Ala Val Leu Ile Phe Trp Met Pro單字母符號 A V L I F W M P非 極 性 R 基 氨 基 酸 結(jié)構(gòu)式NH2COCH2CH2CHCOO|NH3HCHCOO|NH3HO

3、CH2CHCOO|NH3 |CH3HOCHCHCOO|NH3HSCH2CHCOO|NH3CH2HOCHCOO|NH3NH2COCH2CHCOO|NH3結(jié)構(gòu)式氨基酸甘氨酸絲氨酸蘇氨酸半胱氨酸酪氨酸天冬酰胺谷氨酰胺三字母 符號 Gly Ser Thr Gys Tyr Asn Gln單字母 符號 G S T C Y N Q 極 性 不 帶 電 荷 R 基 氨 基 酸 NH3CH2CH2CH2CH2CHCOO|NH3NH2CNHCH2CH2CH2CHCOO|NH3NH2|HNNH+CH2CHCOO|NH3OOCCH2CH2CHCOO|NH3OOCCH2CHCOO|NH3氨基酸天冬氨酸谷氨酸三字母 符號

4、 Asp Glu單字母 符號 D E K R H Lys Arg HIs賴氨酸精氨酸組氨酸酸 性 R 基 氨 基 酸 堿性R 基氨基酸 結(jié)構(gòu)式三、氨基酸的理化性質(zhì)1.一般性質(zhì)：溶解度：可溶于水、稀酸、稀堿中 旋光性：丙氨酸 +1.8、半胱氨酸 -16.5、 脯氨酸 -86.0 熔點：大部分在200以上，丙氨酸297、絲氨酸2802.兩性解離和等電點：氨基酸由酸性基團和堿性基團，可以發(fā)生兩性解離：R+RR酸 堿 等電點定義：某一氨基酸的凈電荷等于零時的溶液pH值為該氨基酸的等電點不同的氨基酸有不同的等電點等電點時的特點：溶解度下降用途：可根據(jù)氨基酸的等電點來分離不同氨基酸，如味精生產(chǎn)時將pH值調(diào)

5、到3.22，谷氨酸沉淀下來。pI 計算法： pI=（pK左+pK右 ）/2 pK左 : pI處左側(cè)pK 值， pK右 :pI處右側(cè)pK 值。 如：甘氨酸的兩性解離為：酸 堿 pK1 =2.34 pk2 =9.60 pI=(2.34+9.60)/2=5.97賴氨酸的兩性解離為：與等電點有關(guān)的pK值為：pK2 =8.95 pK3 =10.53 pI=9.74 一、二、三組氨基酸：pI=（pK1+pK2 ）/2 第四組氨基酸：pI=（pK2 +pK3 ）/2吸收光譜 所有20種基本氨基酸在可見光區(qū)都無光吸收，在近紫外區(qū)三種芳香氨基酸具有紫外吸收，即： 苯丙氨酸257nm 酪氨酸275nm 色氨酸28

6、0nm氨基酸表觀解離常數(shù)和等電點 用途：可用于氨基酸的定性和定量測定 脯氨酸是亞氨基酸，只有一步反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物為黃色。水合茚三酮還原茚三酮氨基酸產(chǎn)物（藍紫色,m = 570nm ）4. 氨基酸的重要化學(xué)反應(yīng) （1）茚三酮反應(yīng)（2）Sanger反應(yīng) 氨基酸與二硝基氟苯（DNFB）反應(yīng)，生成二硝基苯代氨基酸（DNP氨基酸）二硝基氟苯氨基酸DNP氨基酸(黃色)室溫用途：測定肽鏈N-端氨基酸（3）Edman反應(yīng) 異硫氰酸苯酯與氨基酸反應(yīng)生成PTH氨基酸異硫氰酸苯脂（PITC）弱堿PTC氨基酸PTH氨基酸用途：蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)序列測定樣品1樣品2被交換離子洗脫液+離子交換劑配對離子氨基酸平衡離子 5. 氨

7、基酸的分離方法 離子交換層析第三節(jié) 肽 一、概念二、書寫方式 左右，N C，可用英文或中文簡寫，中間用一短杠相連，氨基端加“H”，羧基端加“OH”，每一個氨基酸要叫氨基酸殘基。 例： H-丙-甘-谷-精苯丙-組-OH H-Ala-Gly-Glu-ArgPhe-His-OH 主肽鏈 多肽鏈中由共價鍵連接成的連續(xù)的鏈狀結(jié)構(gòu) 肽單位 主肽鏈中的重復(fù)單位N 端C 端肽單位肽單位由于有巰基，所以有氧化還原反應(yīng) GSH + GSH GSSG + 2H+ +2e-谷胱甘肽是生物體內(nèi)重要的氧化還原物質(zhì)，對細胞起到了保護作用，另外，還是其他細胞保護劑的還原劑三、重要的寡肽及其作用 谷胱甘肽（GSH）：谷氨酸半胱

8、氨酸甘氨酸第四節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一、一級結(jié)構(gòu)：定義：蛋白質(zhì)的多肽鏈中氨基酸的排列順序，包括二硫鍵位置 特點：基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定結(jié)構(gòu) 牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)（局部）：牛胰島素由A、B兩條肽鏈組成，A鏈20個氨基酸殘基，B鏈30個氨基酸殘基 二、二級結(jié)構(gòu)：（1）概念：二級結(jié)構(gòu)定義在規(guī)則氫鍵指導(dǎo)下局部多肽鏈在空間的排列方式 由于單鍵可以自由旋轉(zhuǎn)，所以從理論上說肽鏈有無數(shù)種構(gòu)象，但實際上，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)只有少數(shù)幾種，這是由于肽鏈在形成空間結(jié)構(gòu)時要受到多種因素的限制，這些因素有：SSH-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser- AH-Phe-Val-Asn-

9、Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val- BSS肽鍵平面由于肽鍵的雙鍵性質(zhì)，使得形成肽鍵的N、C原子以及它們相連的四個原子形成一個平面，這個平面就叫肽鍵平面。形成的原因：p共軛，肽鍵不能自由旋轉(zhuǎn) 結(jié)果：形成剛性平面二面角 和兩個構(gòu)象角稱為二面角NNOOCCCCCHH 要點：單鏈右旋一圈3.6殘基上升0.54nm形成51氫鍵且全部平行R基指向外側(cè)（2）種類（4類）a螺旋：折疊：要點： 肽鏈伸展，形成鏈間氫鍵（成為片層），R-基處于片層上下反平行b折疊平行b折疊折疊有平行和反平行兩種 轉(zhuǎn)角（回折）：肽鏈180旋轉(zhuǎn)，氫鍵連接；無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)角卵溶菌酶無規(guī)則卷曲三、超二級

10、結(jié)構(gòu)：概念：相鄰二級結(jié)構(gòu)單元 相互作用形成的聚合體DE 種類：（A） X(B、C) 曲折（D） 回形拓撲結(jié)構(gòu)(E)四、結(jié)構(gòu)域乳酸脫氫酶結(jié)構(gòu)域刀豆蛋白結(jié)構(gòu)域彈性蛋白酶三級結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白G如：卵溶菌酶 一條肽鏈，124個氨基酸殘基，分子量為14600五、三級結(jié)構(gòu)：定義：蛋白質(zhì)分子中所有原子的空間排列 肌紅蛋白 是肌肉中運輸氧的蛋白質(zhì)，一條肽鏈，153個氨基酸殘基，分子量為16700，含一個血紅素輔基，氧分子就結(jié)合在它的鐵上。整個分子有8個-螺旋，并且有-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，但是無-折疊 。三級結(jié)構(gòu)特征： 高低不平IgG的結(jié)構(gòu)疏密不一近似球狀醛糖脫氫酶 外親內(nèi)疏如：血紅蛋白含有四個亞基，為22

11、，每個亞基含一個血紅素，每個血紅素可結(jié)合一個氧分子。亞基含141個氨基酸殘基，亞基含146個氨基酸殘基。-亞基-亞基 -亞基 -亞基血紅素血紅素Fe2+Fe2+六、四級結(jié)構(gòu)：概念：蛋白質(zhì)分子中亞基在空間的排列Hemoglobin空間結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)特點-對稱性四級結(jié)構(gòu)的優(yōu)越性： 氫鍵、鹽鍵、疏水作用力、二硫鍵、配位鍵、范德華引力 氫鍵鹽鍵疏水作用力二硫鍵配位鍵范德華引力二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)七、維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的作用力一、 一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系：一級結(jié)構(gòu)與功能有密切的關(guān)系1. 氨基酸對功能的重要性 如果改變的氨基酸是蛋白質(zhì)執(zhí)行功能所必需的，則這種氨基酸的改變對功能的影響極大，如果改變的氨

12、基酸對功能無貢獻，則它們的改變基本不影響蛋白質(zhì)的功能。 如RNA酶，如果將其N-端的三個氨基酸去掉，酶的功能基本不變，但是，如果將組12改變，則酶失去活性。 第五節(jié) 結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系鐮刀狀貧血?。壕褪怯捎谘t蛋白-鏈上第六位的谷氨酸被纈氨酸代替，使得血紅蛋白分子在氧分壓低的情況下容易聚合，形成桿狀多聚體，致使紅細胞由正常的圓盤狀成為鐮刀狀，血液流動受到阻礙。同源蛋白：不同生物中具有同一功能的蛋白質(zhì)。它們的特點是其一級結(jié)構(gòu)中，與功能直接相關(guān)的殘基相同，而其它殘基有差異，這些殘基是可以改變的，這種變化往往與生物進化有關(guān)。例：Cytc與進化生 物 殘基改變數(shù) 生 物 殘基改變數(shù) 生 物 殘基改變數(shù)黑

13、猩猩 0 狗 11 狗魚 23恒河猴 1 騾 11 蛾 31兔 9 馬 12 小麥 35袋鼠 10 雞、火雞 13 面包霉 43鯨 10 響尾蛇 14 酵母 44牛、豬、羊 10 韌齒龜 152. 種屬差異與分子進化一定的結(jié)構(gòu)，一定的功能結(jié)構(gòu)變化，功能變化結(jié)構(gòu)破壞，功能破壞二、空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第六節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 一、兩性解離與等電點：概念：蛋白質(zhì)凈電荷等于零時的環(huán)境pH值。不同蛋白質(zhì)其等電點不同：胃蛋白酶：1.02.5；胰島素：5.35.35；血紅蛋白：7.07；魚精蛋白：12.012.4特點：溶解度降低，可用于蛋白質(zhì)的分離電泳：大分子化合物在電場中運動的過程。原理：不同蛋白的電荷正

14、負和數(shù)量不同，分子量不同，形狀不同，因此在電場中的運動速度不同。方向與速度的鑒別：pI pH，正負為方向，數(shù)值為速度。 用途：分離鑒定蛋白質(zhì)等大分子化合物NH3+COOHP+NH3+COOPNH2COOP-點樣處蛋白蛋白蛋白1蛋白清蛋白根據(jù)載體的不同，電泳有膜電泳、凝膠電泳等如：人血清蛋白的醋酸纖維膜電泳圖譜?，F(xiàn)有一混合蛋白質(zhì)樣品，內(nèi)含A、B、C、D三種蛋白，其等電點分別為：A 10.8 B 7.5 C 5.6 D 3.2，指出在pH7.5的緩沖液中電泳時，它們各自的位置。根據(jù)pI pH，結(jié)果為：A 10.8 7.5 = 3.3 B 7.5 7.5 = 0 C5.6 7.5 = 1.9 D 3

15、.2 7.5 = 4.3它們電泳后的位置為：點樣處ABCD+凝膠電泳例題 蛋白質(zhì)分子量小的幾萬，大的可達幾百萬，其大小為1100nm，已經(jīng)達到膠體質(zhì)點的范圍，同時，蛋白質(zhì)分子外表為親水表面，所以，蛋白質(zhì)屬于親水膠體，并且是穩(wěn)定的膠體。穩(wěn)定因素：水化膜，同種電荷+二、膠體性質(zhì)+酸堿加脫水劑 但是穩(wěn)定是相對的，如果改變條件其穩(wěn)定性就會發(fā)生變化，如加入有機溶劑則會脫去水化膜，改變p就會改變其電荷。透析：大分子化合物不能通過半透膜的性，可用于蛋白質(zhì)脫鹽 沉降：在強離心場中，大分子化合物向離心力方向移動的現(xiàn)象沉降系數(shù)（s）：單位離心場強單位時間內(nèi)蛋白質(zhì)的沉降距離，其單位是S（注意s與S的區(qū)別），如某蛋白

16、的沉降系數(shù)為70，則表示為70S。 蛋白質(zhì)S值的大小可以近似表示蛋白質(zhì)分子量的相對大小。三、變性概念：物理化學(xué)因素影響，空間結(jié)構(gòu)破壞，性質(zhì)改變，功能喪失核糖核酸酶的變性過程因素：物理：熱、高能射線，振動；化學(xué)：強酸、強堿、變性劑。原因：空間結(jié)構(gòu)破壞。性質(zhì)改變：溶解度下降，反應(yīng)活性改變。標志：生物活性喪失 鹽析：高濃度中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀的現(xiàn)象原因：破壞了穩(wěn)定膠體的兩個因素四、沉淀：NH4+SO42-NH4+SO42-SO42-NH4+NH4+SO42-+NH4+NH4+SO42-NH4+SO42-NH4+SO42-SO42-+SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-SO42-靜電荷為零

17、優(yōu)點：不影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，常用于蛋白質(zhì)分離常用的鹽類：硫酸銨和氯化鈉鹽溶：低濃度中性鹽使蛋白質(zhì)溶解度增加的現(xiàn)象變性沉淀；沉淀劑沉淀：有機溶劑、重金屬鹽、某些酸類，如苦味酸、三氯乙酸；相互沉淀 280nm，由于有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸,可用于蛋白質(zhì)含量的測定六 呈色反應(yīng)：茚三酮反應(yīng) 雙縮脲反應(yīng)：可用于蛋白質(zhì)含量的測定（540nm）五 紫外吸收：一、蛋白質(zhì)分離純化的依據(jù) 大?。ù笮膸装俚揭话偃f。一般10,000150,000）形狀（球型、雪茄型蛋白在電泳、梯度離心、層析時摩擦阻力、擴散速度不同）電荷（天冬氨酸、谷氨酸占優(yōu)勢， pH=7時帶負電荷，為酸性蛋白； 賴氨酸、和精氨酸殘基占優(yōu)勢，p

18、H=7時帶正電荷，為堿性蛋白）等電點（蛋白質(zhì)等電點一般為之間）電荷分布（荷電殘基不均勻分布或成簇分布時往往能以適當?shù)膹姸扰c陰陽兩種離子交換樹脂作用 ）第七節(jié) 蛋白質(zhì)的分離純化疏水性（多數(shù)疏水性氨基酸蠶基藏在蛋白內(nèi)部，但也有一些見于表面。鹽濃度增大時往往露出疏水表面）溶解度（溶解度從基本不溶300mg/ml, pH、離子強度、離子的性質(zhì)、溫度、溶液極性等影響溶解度）密度（富含磷酸鹽蛋白高密度1.8mg/ml，脂質(zhì)部分密度1.03，可梯度離心）配體結(jié)合能力(酶與底物、效應(yīng)分子、輔助因子、和DNA模板結(jié)合)金屬結(jié)合能力(胱氨酸、組氨酸殘基與Cu2+、Zn2+、Ca2+、Co2+、Ni2+二價金屬離子結(jié)合)可逆性締合(蛋白二聚體、三聚體等的可逆變化)翻譯后修飾(翻譯后加入糖基、?；?、磷酸基團等。糖基與外源凝集素柱子結(jié)合，磷蛋白在某些糖基存在下與二價Fe離子)特異性序列或結(jié)構(gòu)(氨基酸殘基在蛋白質(zhì)表面上的精確的幾何表象可用來作為分離方法的基礎(chǔ)。如免疫親和層析)基因工程構(gòu)建的純化標志(改變cDNA而在被表達的蛋白氨基端或羧基端加幾個額外的氨基酸，如6個組氨酸與Ni2+螯合)其它非尋常性質(zhì)(某些蛋白質(zhì)還有一些不同尋常的性質(zhì)，如熱穩(wěn)定性、抗蛋白酶解等，結(jié)合二者用來純化酶等。因大多數(shù)蛋白95C時解折疊