混合系列蛋白激酶樣結構域MLKL通過磷酸化RIP引發(fā)壞死性的膜破裂

1、混合系列蛋白激酶樣結構域MLKL被RIP3磷酸化可引發(fā)(yn f)壞死性的膜破裂 Huayi Wang,1 Liming Sun,1 Lijing Su,2 Josep Rizo,2 Lei Liu,1 Li-Feng Wang,3 Fu-Sheng Wang,3 and Xiaodong Wang1 王華翌、孫麗明、Lijing Su、Josep Rizo、劉磊、王立峰、王福生（北京(bi jn)302醫(yī)院）、王曉東（Molecular Cell，2014）匯報人：付瑋瑋共三十六頁一、前言(qin yn)程序性細胞死亡在多細胞個體的成長發(fā)育過程中扮有重要作用，主要分為兩種途徑凋亡和壞死，它們

2、有著不同的形態(tài)學和生物化學變化。凋亡主要表現(xiàn)為細胞體積縮小、核膜破裂、DNA降解為約180-200bp的整數(shù)倍、并最終形成胞膜包被的凋亡小體，很快被巨噬細胞和鄰近細胞所吞噬。這些凋亡過程中形態(tài)學和生物化學的變化主要由一類半胱氨酸蛋白酶caspases執(zhí)行。這些蛋白酶通過外在的死亡誘導信號激活，如腫瘤壞死因子受體或Bcl-2家族蛋白，它們可使原來位于線粒體膜間隙的蛋白質釋放到胞漿，其中一種釋放細胞色素(s s)C，與胞漿中的Apaf-1結合后激活caspases。共三十六頁腫瘤壞死因子（TNF）還可誘導細胞壞死，表現(xiàn)為細胞腫脹、胞內(nèi)細胞器變形或腫大、細胞ATP含量減少、細胞膜破裂。這種形式的壞死

3、,又稱為necroptosis，需要受體互作的蛋白激酶RIP1、RIP3的激活。研究采用RIP3敲除的小鼠證實這種形式的細胞死亡對于應答微生物感染和炎癥介導的組織損傷具有重要(zhngyo)意義。RIP3如何引發(fā)細胞壞死以及該途徑是否自然運行在人類組織中是我們理解細胞壞死面臨的兩大難題。RIP1, RIP3以及MLKL相互結合形成一個信號復合體，被稱作“necrosome”。 且MLKL激酶結構域的357位的蘇氨酸和358位的絲氨酸（人源）在細胞程序性壞死被啟動后被RIP3磷酸化。MLKL是擁有激酶結構域（與RIP3結合）但無激酶功能的假激酶。MLKL敲除的小鼠被證實與RIP3敲除的小鼠對細胞

4、壞死具有相似的抵抗能力。但MLKL磷酸化導致細胞壞死的機制目前尚不清楚。共三十六頁在當前研究中，我們開發(fā)了特異性檢測人類MLKL蛋白在細胞壞死途徑中第357位蘇氨酸和358位絲氨酸磷酸化的單克隆抗體(kngt)。通過一系列的生化試驗，我們發(fā)現(xiàn)necrosome從胞漿向質膜和細胞器膜上轉位，這種轉變使MLKL在磷酸化驅使的聚合后獲得與脂質直接結合的能力。一旦這些變化發(fā)生在膜上，聚合的MLKL將形成膜通透性孔道，破壞膜的完整性，引起細胞壞死。共三十六頁二、文章(wnzhng)的總體模式圖 RIP1, RIP3以及MLKL相互結合形成一個細胞壞死復合體 “necrosome”；MLKL激酶結構域的T

5、357/S358位被RIP3磷酸化；磷酸化的MLKL從單體狀態(tài)向寡聚體狀態(tài)轉化；寡聚化的MLKL結合磷酸肌醇和心肌磷脂(ln zh),整個復合體從細胞質轉移到細胞膜和細胞器膜上，并在這些膜結構上形成通透性孔道，破壞膜的完整性，引起細胞壞死。共三十六頁三、文章(wnzhng)的亮點RIP3 激酶對MLKL T357/S358 位的磷酸化驅使MLKL形成寡聚物；MLKL 寡聚物從胞漿易位到 細胞器膜和質膜上；MLKL 寡聚物在細胞壞死過程(guchng)中直接破壞細胞膜的完整性；MLKL 磷酸化發(fā)生在藥物引起的肝損傷病人活檢組織中。共三十六頁1. MLKL磷酸化是細胞壞死的標志；2. 磷酸化的ML

6、KL在細胞壞死過程中易位到膜部分；3. Necrosomes復合體在細胞壞死過程中轉移到質膜和細胞器膜上；4. MLKL在細胞壞死過程中形成寡聚體；5. MLKL結合磷脂和脂質體；6. MLKL通過在膜上形成通透性孔道引起(ynq)膜泄漏和細胞壞死；7.藥物引起的肝損傷病人活檢組織中檢測到MLKL磷酸化信號。四、文章結構框架(kun ji)流程圖(主要通過7幅圖展開)共三十六頁圖1、MLKL磷酸化是細胞(xbo)壞死的標志 共三十六頁圖A：采用MLKL磷酸特異性抗體檢測MLKL在細胞壞死過程中的磷酸化情況（HT-29細胞處理8h）；1-7孔道為細胞壞死誘導物，D：二甲基亞砜；T：TNF-；S：

7、Smac 類似物；Z：Z-VAD-fmk；文獻表明 Smac 類似物可以刺激(cj)細胞自分泌TNF-。下圖為HT-29細胞采用不同的細胞壞死誘導物處理(chl)12h后的細胞存活率；使用的為 CellTiter-Glo kit試劑盒，ATP是活細胞新陳代謝的一個指標，通過對ATP定量測定可以檢測培養(yǎng)物中的活細胞數(shù)目；磷酸化的MLKL與細胞死亡具有一定的相關性。共三十六頁圖B 進一步驗證了MLKL磷酸化與細胞死亡相關(xinggun)；從圖可以看出HT-29細胞在TSZ共同處理下不同時間的p-MLKL、ATP水平和膜泄漏情況（通過測定胞質蛋白酶的活性得到，CytoTox-Glo kit）；6小

8、時后三個信號同時出現(xiàn)變化。共三十六頁圖C-D：細胞(xbo)壞死抑制劑對MLKL磷酸化的不同影響；（Nec-1：RIP1抑制劑；NSA：MLKL抑制劑）；磷酸化的MLKL信號可以被Nec-1阻止，但不能被NSA阻止，表明MLKL在細胞壞死中功能位于RIP1/RIP3的下游；圖E：Knocking down RIP3的表達可以阻止MLKL的磷酸化；敲除任一蛋白均可阻止細胞壞死或減弱MLKL磷酸化信號（4、6道），但敲除MLKL不能阻止RIP3對其的磷酸化（2、6道）；共三十六頁 補充圖中又對另一種人類(rnli)細胞系（白血病細胞株U937）進行了類似的研究，發(fā)現(xiàn)MLKL磷酸化信號和細胞壞死的相

9、關性同樣出現(xiàn)在U937細胞系中。共三十六頁圖2、磷酸化的MLKL在細胞壞死(hui s)過程中易位到膜部分 共三十六頁圖2A：采用Trion X-114分離內(nèi)在膜蛋白的示意圖；圖2B：HT-29在TSZ處理的不同時間點細胞(xbo)提取物的western blotting情況；細胞壞死誘導6小時后，磷酸化的MLKL在水相出現(xiàn)，且非磷酸化的MLKL逐漸減少；同時，磷酸化的MLKL此時出現(xiàn)在膜相；暗示MLKL在被RIP3磷酸化后從溶膠轉移到膜部分。共三十六頁圖2C：NSA（MLKL抑制劑）先前驗證出不能阻止MLKL發(fā)生磷酸化，但可以阻止細胞壞死，現(xiàn)在驗證NSA可以阻止p-MLKL轉移到膜上；分別對

10、比2、6和4、8，在沒加壞死抑制劑時，p-MLKL主要集中在膜上，加抑制劑后，則主要在水相，暗示NSA雖然不影響MLKL的磷酸化，但p-MLKL不轉移到膜上；圖2D：MLKL磷酸化位點突變后在細胞壞死過程(guchng)中不會轉移到膜上。共三十六頁圖3、Necrosomes復合體在細胞壞死(hui s)過程中轉移到質膜和細胞器膜上共三十六頁 圖3A：差速離心分離細胞器的基本步驟；圖3B：細胞器特異性標記（質膜和核內(nèi)體：EGFR；線粒體：Tom20；溶酶體和核內(nèi)體: Lamp1 ；內(nèi)質網(wǎng)：ERp72）；左圖顯示僅用TNF處理，不出現(xiàn)p-MLKL，且MLKL、RIP3、RIP1主要存在(cnzi)

11、于S100，即上清液水相中；RIP1在水相和膜上都比較多，暗示其可結合TNF受體。右圖顯示在TSZ處理后，p-MLKL出現(xiàn)在各種細胞器膜上。共三十六頁圖3C： 前三行紅色點和綠色(l s)點的重疊百分比為14%-23%；細胞膜的p-MLKL信號為22%。線粒體內(nèi)質網(wǎng)的正常駐留(zh li)蛋白溶酶體和核內(nèi)體微分干涉圖像質膜共三十六頁 補充(bchng)圖共三十六頁圖4、MLKL在細胞壞死(hui s)過程中形成寡聚體共三十六頁 圖4A：P-MLKL在非還原凝膠中有寡聚體存在，在還原凝膠則沒有；寡聚體靠二硫鍵連接；圖4B：采用凝膠過濾（Superdex 200）分析純化的重組蛋白MLKL；洗脫位

12、置表明了分子大小(dxio)（見標尺，甲狀腺球蛋白,670 kDa;鐵蛋白,440 kDa;BSA,67 kDa;卵清蛋白,44 kDa;核糖核酸酶A,14 kDa）；非還原(hun yun)凝膠還原凝膠共三十六頁圖4C：使用化學交聯(lián)劑檢測MLKL蛋白的自組裝；左邊不含交聯(lián)劑的MLKL蛋白全為單體；右邊加入交聯(lián)劑后蛋白出現(xiàn)(chxin)寡聚體；但357A/358A突變不能磷酸化故而仍為單體；圖4D：MLKL磷酸化對于細胞壞死過程中寡聚體的形成是必須的（非還原狀態(tài)）；左邊正常型可以發(fā)生磷酸化，因此既有單體又有寡聚體，右邊突變后不能磷酸化因而只有單體形式；共三十六頁圖5、MLKL結合(jih)磷脂

13、和脂質體 共三十六頁 圖5A：（TAG：甘油三酯；DAG：甘油二酯；PA：磷脂酸；PS：磷酯酰絲氨酸；PE：磷脂酰乙醇胺；PC：卵磷脂；PG：磷脂酰甘油；Cardiolipin:心磷脂；PI：磷脂酰肌醇；Cholesterol：膽固醇）；15種膜脂的布局圖；圖5B：MLKL-FL(full-length，1471 aa); MLKL-CC(coiled-coil domain,1178 aa); MLKL-KL( kinase-like domain，179471 aa)；使用Anti-N-terminal or C-terminal MLKL antibodies 檢測 MLKL signa

14、l。4種磷脂-心磷脂、PI4P、PI(4,5)P2、PI(3,4,5)P3結合(jih)最多；KL結構域不結合任何脂質。共三十六頁圖5C：MLKL結合包含磷脂的脂質體；S：上清；P：沉淀物；只有PI(4)P和PI(4,5)P2招募到了MLKL蛋白，且PI(4,5)P2對MLKL有更高的親和力；絕大多數(shù)的MLKL蛋白與包含15%心磷脂的脂質體（與線粒體水平接近）結合，而只有少量蛋白與包含5%心磷脂的脂質體結合；圖5D：通過比較(bjio)正常型和突變型MLKL蛋白對脂質體親和力的區(qū)別，進一步驗證MLKL對脂質體結合的特異性。共三十六頁圖6、MLKL通過(tnggu)在膜上形成通透性孔道引起膜泄漏

15、和細胞壞死共三十六頁圖6A-C：先讓Tb3+離子和脂質體結合，然后和帶有DPA的MLKL蛋白孵育，Tb3+有弱熒光活性，當從脂質體中釋放與DPA結合時，Tb3+/DPA螯合物使熒光活性增加104倍，從而給出脂質體破裂的信號；圖6A為三種形式的MLKL蛋白膜破裂情況(qngkung)；圖6B為脂質體中包含不同脂類時膜破裂的情況；圖6C為添加NSA后可以抑制膜的破裂；共三十六頁圖6D：MLKL全長或N端卷曲結構域可以使膜破裂；而C端激酶結構域不起作用；圖6E：采用人類骨肉瘤細胞系U2OS，其中MLKL-FKBPV融合蛋白受doxycycline（多西環(huán)素）誘導的啟動子控制，U2OS不表達RIP3，

16、因此正常情況下不經(jīng)歷(jngl)細胞壞死；僅當Dox存在時可表達融合蛋白，但有30%的細胞死亡，添加AP20187后，細胞死亡率增加到60%；添加z-VAD和Nec-1時沒有顯著變化，但添加NSA時細胞死亡率下降，暗示細胞死亡是由MLKL介導的。共三十六頁圖6F：U2OS在Dox誘導且AP20187處理后細胞壞死情況；SYTOX專染死細胞，它能輕松透過質膜受損的細胞，但不能穿過(chun u)活細胞膜，用綠光區(qū)別。共三十六頁圖7、藥物引起(ynq)的肝損傷病人活檢組織中檢測到MLKL磷酸化信號共三十六頁圖7A：藥物引起的肝損傷病人活檢組織染色（圖中顯示病變部位三個臨近的區(qū)域）；a為蘇木(s m

17、)精將細胞核染成藍紫色，phospho-MLKL抗體將病變部位復染為紅色；b為沒有采用第一抗體染色的陰性對照；c為蘇木精和phospho-MLKL抗體復染的肝損傷嚴重的部位；共三十六頁圖7B：兩個健康器官移植捐贈者的肝活檢組織(zzh)樣本的免疫組織(zzh)化學染色；共三十六頁圖7C-D：藥物引起(ynq)的肝損傷病人活檢組織在高倍顯微鏡下的染色情況； phospho-MLKL染色位于肝細胞內(nèi)，且出現(xiàn)在細胞壞死的不同階段；陽性細胞呈現(xiàn)棕色，白色箭頭所指的炎癥細胞浸潤受傷區(qū)域，隨之發(fā)生細胞壞死。共三十六頁圖7D-E：13個健康人和14個病人phospho-MLKL信號(xnho)的差異；兩種方法均顯示phospho-MLKL陽性染色與該疾病有顯著相關；共三十六頁Thank you共三十六頁內(nèi)容摘要混合系列蛋白激酶樣結構域MLKL被RIP3磷酸化可引發(fā)