動物細(xì)胞工程和重要理論

1、動物細(xì)胞工程和重要理論植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交回顧：植物細(xì)胞工程常用的技術(shù)手段有哪些？植物組織培養(yǎng)技術(shù)的原理是什么？細(xì)胞的全能性專題2細(xì)胞工程動物細(xì)胞工程課題2動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞融合單克隆抗體技術(shù)核移植動物細(xì)胞工程常用技術(shù)其它動物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)一、動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用和概念：1、概念：動物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動物有機(jī)體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個細(xì)胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長和增殖.2、原理：細(xì)胞增殖動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)無限傳代單個細(xì)胞加培養(yǎng)液原代培養(yǎng)胰蛋白酶剪碎細(xì)胞株細(xì)胞系遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)已改變3、過程（1）細(xì)胞貼壁： 懸

2、液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上（單層）。要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。（2）接觸抑制： 當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時，細(xì)胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。動物細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn)：貼壁生長、接觸抑制解答概念細(xì)胞貼壁過程培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：表面光滑、無毒、易于帖附。(3)原代培養(yǎng) (primary culture)定義：指將要培養(yǎng)的動物細(xì)胞取出后，先用胰蛋白酶等使組織分散成單個細(xì)胞，然后配制成一定濃度的細(xì)胞懸液，再將該懸液放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。過程：從動物機(jī)體中取出組織 剪碎 加胰蛋白酶 細(xì)胞游離 制成細(xì)胞懸液 將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶內(nèi) 培養(yǎng)（1-2天換一次培養(yǎng)液）

3、細(xì)胞貼壁生長 長成單層細(xì)胞定義：當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長停止，這時如果要使細(xì)胞繼續(xù)生長，就要及時用胰蛋白酶等，使細(xì)胞從瓶壁上解離下來，然后加入新的培養(yǎng)液，將細(xì)胞分離稀釋，并從原培養(yǎng)瓶內(nèi)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，這個過程稱傳代培養(yǎng)(4)傳代培養(yǎng) (subculture)細(xì)胞株：傳代細(xì)胞一般能傳到40-50代，遺傳物質(zhì)一般不會發(fā)生改變，叫細(xì)胞株。強(qiáng)調(diào)：細(xì)胞系、細(xì)胞株（了解即可，老課本體系）細(xì)胞系：傳代50代以后不能再傳下去，部分細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，能連續(xù)傳代，獲得不死性，叫細(xì)胞系。細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別： 細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)50代細(xì)胞

4、無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞株細(xì)胞系知識點(diǎn)小結(jié)：各個新名詞之間的聯(lián)系多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長和分裂。隨細(xì)胞增多，細(xì)胞就會停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變1、無菌、無毒的環(huán)境 （添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液）2、營養(yǎng) （葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素、動物血清、微量元素等）3、溫度和PH 溫度+度，4、氣體環(huán)境 O2和CO2（95%空氣和5% CO2 ）4、動物細(xì)胞培養(yǎng)條件保證細(xì)胞順利的生長增殖離體培養(yǎng)的細(xì)胞對微生物和有毒物質(zhì)沒有防御能力能否用胃蛋白酶代替胰蛋白酶？無菌操作培養(yǎng)箱問題3：為什么用胰蛋白酶處理？問題1：、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細(xì)胞培養(yǎng)材料？因?yàn)槠浼?xì)胞生命力旺

5、盛，分裂能力強(qiáng)，分化程度低。問題2、為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個細(xì)胞？擴(kuò)大細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面積，利與細(xì)胞吸收營養(yǎng)。動物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，胰蛋白酶處理動物組織，可以使動物組織細(xì)胞間的蛋白質(zhì)和細(xì)胞外的其他成分酶解，獲得單個細(xì)胞。 問題4：為什么用胰蛋白酶處理而不用胃蛋白酶？動物細(xì)胞培養(yǎng)的最適PH值為，胰蛋白酶作用的適宜PH為，胃蛋白酶適宜PH為2.胃蛋白酶在PH為的動物細(xì)胞培養(yǎng)中無活性。問題5：用胰蛋白酶處理不會把所培養(yǎng)的細(xì)胞消化掉嗎？控制好時間！長時間處理當(dāng)然會損傷細(xì)胞。問題6、動物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？問題7、動物細(xì)胞培養(yǎng)能

6、否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、無機(jī)鹽）、維生素和動物血清等。獨(dú)特之處有：1、液體培養(yǎng)基 2、成分中有動物血清等不能，動物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體問題8、動物細(xì)胞培養(yǎng)的原理：細(xì)胞增殖。問題9、目前使用的或冷凍保存的正常細(xì)胞通常在10代以內(nèi)，為什么？10代以內(nèi)的細(xì)胞遺傳物質(zhì)不改變，保持正常二倍體核型。5.動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用:1.蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn) 如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體2.應(yīng)用于基因工程 主要用于作為受體細(xì)胞3.檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性 4.細(xì)胞的生理、藥理、病理研究 如用于篩選抗癌藥物 6、植物組織培

7、養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較：比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng) 原理細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖培養(yǎng)基性質(zhì)固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基特有成分蔗糖 植物激素葡萄糖 促- - 動物血清培養(yǎng)結(jié)果植物體細(xì)胞株、細(xì)胞系培養(yǎng)目的快速繁殖、培育無病毒植株獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白取材植物幼嫩部分或花藥胚胎或幼齡動物的器官或組織其他條件無菌無毒，適宜條件無菌無毒，適宜條件復(fù)習(xí)回顧1、動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程、特點(diǎn)及原理？2、植物組織培養(yǎng)與動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較？卵細(xì)胞C母綿羊子宮母綿羊母綿羊乳腺細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵細(xì)胞細(xì)胞拆合技術(shù)妊娠多莉羊的培育過程無性生殖二、動物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動物

8、1、定義： 動物核移植是將動物的一個細(xì)胞的細(xì)胞核,移入一個已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中.使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎,這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體.3、分類： 胚胎核移植、體細(xì)胞核移植。胚胎細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)其全能性相對容易。動物體細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)其全能性十分困難2、原理： 動物細(xì)胞核具有全能性4、體細(xì)胞核移植過程-示動物克隆-無性繁殖1.）克隆羊多利培育過程：黑面綿羊去核卵母細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核細(xì)胞核移植重組細(xì)胞電脈沖刺激早期重組胚胎胚胎移植另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利特別注意：克隆動物性狀與供體動物完全一樣嗎？不可能！因?yàn)椋阂?、供體動物只提供細(xì)胞核，而細(xì)胞質(zhì)中的遺傳物質(zhì)（如

9、線粒體DNA）來自于受體卵母細(xì)胞.二、生物的性狀不僅與遺傳物質(zhì)有關(guān)，還受環(huán)境的影響。供體受體代孕受體 取供體細(xì)胞傳代培養(yǎng)10代以內(nèi)的細(xì)胞.為什么？用的是去核的減數(shù)第二次分裂中期細(xì)胞（M中期）為什么？激活方法：激活目的：促融方法：電刺激胚胎移植至代孕受體內(nèi) 妊娠、分娩2.）核移植流程供體：優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛受體：普通奶牛（卵母細(xì)胞的采集與培養(yǎng)） 1.體積大，易操作。2.含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。有人說它三個母親，對嗎？供體細(xì)胞（供核）細(xì)胞培養(yǎng)體細(xì)胞卵巢卵母細(xì)胞（M中期：供質(zhì)）去核無核卵母細(xì)胞注入細(xì)胞融合重組細(xì)胞構(gòu)建重組胚胎胚胎移植代孕母體生出與供體奶牛遺傳基礎(chǔ)相同的犢牛歸納:1.共分成

10、兩大階段：核移植和胚胎移植2.取卵細(xì)胞作受體細(xì)胞的原因是:它是最大的細(xì)胞,易操作,它發(fā)育可直接表達(dá)性狀3.嚴(yán)格來說新個體有卵巢母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)所以有兩個親本的性狀小結(jié)：核移植過程5.體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景克隆動物的研究意義1.克隆動物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白2.加速改良動物品種 3.治療人類疾病提供供體（器官、細(xì)胞、組織）4.保護(hù)瀕危動物體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題1.許多克隆動物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過大，異常肥胖，發(fā)育困難，免疫失調(diào)等。2.成功率非常低3.克隆動物食品的安全性問題。2-2 動物細(xì)胞融合與單克隆抗體一、動物細(xì)胞融合（細(xì)胞雜交）1、概念：指兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一

11、個細(xì)胞的過程。2、結(jié)果:形成單核的雜交細(xì)胞3、原理：細(xì)胞膜的流動性4、誘導(dǎo)方式：物理法：離心、振動、電激化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)生物法：滅活的病毒 細(xì)胞融合是正常的生命活動兩個細(xì)胞正在融合 受精作用誘導(dǎo)融合的方式生物法：滅活的病毒誘導(dǎo)融合.(利用滅活仙臺病毒是動物細(xì)胞融合所特有的。 這是由于病毒的磷脂外衣與動物細(xì)胞的膜十分相似的緣故。病毒外殼上的某些糖蛋白可能還有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能。) 化學(xué)法：聚乙二醇PEG誘導(dǎo)融合. 物理法：電激融合病毒顆粒黏 附細(xì)胞表面細(xì)胞膜連接細(xì)胞膜被 病毒顆粒穿通細(xì)胞融合、形成雜種細(xì)胞5、過程：動物細(xì)胞A動物細(xì)胞B誘導(dǎo)，融合1個完整的雜交細(xì)胞AB（膜融合、質(zhì)融合）（

12、核融合）細(xì)胞融合完成的標(biāo)志:細(xì)胞核融合成一個核6、意義： 突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為可能。7、應(yīng)用： 成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。最有價值的應(yīng)用制備單克隆抗體動物細(xì)胞融合雜種細(xì)胞愈傷組織雜種植株植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B 原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B植物體細(xì)胞雜交去壁原生質(zhì)體融合植物組織培養(yǎng)物理法化學(xué)法生物法：滅活的病毒動物細(xì)胞A動物細(xì)胞B雜種細(xì)胞常用方法主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合細(xì)胞

13、融合的方法細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞膜的流動性、植物細(xì)胞全能性原理動物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交、動物細(xì)胞融合的比較 1.動物細(xì)胞培養(yǎng)與植物細(xì)胞培養(yǎng)的重要區(qū)別在于-（ ） A.培養(yǎng)基不同； B.動物細(xì)胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進(jìn)行； C.動物細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細(xì)胞不能； D.動物細(xì)胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細(xì)胞只能培 養(yǎng)成植株。A課堂練習(xí)： 2、在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的細(xì)胞是 -（ ） A細(xì)胞系 B細(xì)胞株 C原代細(xì)胞 D傳代細(xì)胞3、動物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)是 -（） A.動物細(xì)胞融合 B.單克隆抗體 C.胚胎移植 D.動物細(xì)胞培養(yǎng)AD4、用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的組織和細(xì)胞大都取

14、自胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織，其主要原因是這樣的組織細(xì)胞 （ ） A.容易產(chǎn)生各種變異 B具有更強(qiáng)的全能性 C.取材十分方便 D分裂增殖的能力強(qiáng)D5.下圖是動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程示意圖。請據(jù)此回答：（1）容器A中放置的是動物器官或組織。它一般取自 _。（2）容器A中的動物器官或組織首先要進(jìn)行的處理是 ，然后用 酶處理，這是為了使細(xì)胞分散開來，這樣做的目的是 （3）培養(yǎng)首先在B瓶中進(jìn)行，瓶中的培養(yǎng)基成分有 _等。幼齡動物或胚胎的組織或器官剪碎組織 胰蛋白 使細(xì)胞與培養(yǎng)液充分接觸 葡萄糖、氨基酸、水、無機(jī)鹽、促生長因子與微量元素和動物血清 在此瓶中培養(yǎng)一段時間后，有許多細(xì)胞衰老死亡，這是

15、培養(yǎng)到第 代，到這時的培養(yǎng)稱為_。為了把B瓶中的細(xì)胞分裝到C瓶中，用 處理然后配置成 ，再分裝。在C瓶中正常培養(yǎng)了一段時間后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全部死亡，原因是 10 原代培養(yǎng) 胰蛋白酶 細(xì)胞懸液 細(xì)胞沒有發(fā)生癌變 （2008寧夏）6.生物選修3現(xiàn)代生物科技專題（15分）回答下列有關(guān)動物細(xì)胞培養(yǎng)的問題：(1)在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到細(xì)胞表面 時，細(xì)胞會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的 。此時，瓶壁上形成的細(xì)胞層數(shù)是 。要使貼壁細(xì)胞從瓶壁上分離下來，需要用酶處理，可用的酶是 。 (2)隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增多，絕大部分細(xì)胞分裂停止，進(jìn)而出現(xiàn) 的現(xiàn)象；但極少數(shù)細(xì)胞可以連續(xù)增殖，其中有些細(xì)胞會

16、因遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而變成 細(xì)胞，該種細(xì)胞的黏著性 ，細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)（糖蛋白）的量 ?！皾h水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2012年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。相互接觸 接觸抑制 單層（或一層） 胰蛋白酶 衰老甚至死亡 不死性 降低 減少 （2007寧夏）7 B生物選修3現(xiàn)代生物科技專題現(xiàn)有A和B兩個肉牛品種，A品種牛的細(xì)胞組成可表示為A細(xì)胞核、A細(xì)胞質(zhì)，B品種牛則為B細(xì)胞核、B細(xì)胞質(zhì)。（1）如果要獲得一頭克隆牛，使其細(xì)胞由A細(xì)胞核和B細(xì)胞質(zhì)組成，基本步驟是，從A品種牛體內(nèi)取出體細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)。然后再從培養(yǎng)

17、細(xì)胞中取出_注入B品種牛的_卵母細(xì)胞，經(jīng)過某處刺激和培養(yǎng)后，可形成胚胎，該胚胎被稱為_ _，將該胚胎移入代孕母牛的_中，通過培育可達(dá)到目的?！皾h水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2012年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。子宮細(xì)胞核重組胚胎去核二、單克隆抗體什么是抗體？由何種細(xì)胞產(chǎn)生？主要分布在哪里？起何作用？效應(yīng)B細(xì)胞血清特異性免疫作用抗體：機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的，并且能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。 克隆概念：是指從一個共同的祖先，通過無性繁殖的方法產(chǎn)生出來的一群遺傳特性相同的DN

18、A分子、細(xì)胞或個體不同層次的克?。篴.分子水平：如DNA的復(fù)制b.細(xì)胞水平：動物細(xì)胞的培養(yǎng)c.個體水平：“多莉”羊的產(chǎn)生接受抗原刺激后，能分泌針對該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。B淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一段時間后便會死亡短命細(xì)胞B淋巴細(xì)胞 所以B淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)時不能無限增殖，而癌細(xì)胞是可以無限增殖的。骨髓瘤細(xì)胞 惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn)分裂和存活長命細(xì)胞。經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細(xì)胞株沒有抗體分泌物。 因此可以利用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與之融合，就可獲得既能無限增殖又能產(chǎn)生單一抗體的細(xì)胞。單克隆抗體的制備極富創(chuàng)造性的方案

19、將能夠產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞和具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合在一起，形成雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一的特異性抗體。這種單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。米爾斯坦(阿根廷)和科勒(德國)因此在1984年獲諾貝爾獎。特點(diǎn)：產(chǎn)量低、特異性差、純度低、反應(yīng)不夠靈敏1、常規(guī)抗體制備一個B淋巴細(xì)胞：只分泌一種特異性抗體2、單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞 小鼠骨髓瘤細(xì)胞：能無限增殖融合 單克隆抗體 培養(yǎng) 向動物體內(nèi)反復(fù)注射抗原，使動物產(chǎn)生抗體，然后從血清中分離所需抗體。優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，可大量制備。B淋巴細(xì)胞注射特定抗原蛋白骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)骨髓瘤

20、細(xì)胞融合多種雜交細(xì)胞在具有篩選作用的培養(yǎng)基上培養(yǎng)專一抗體檢驗(yàn)陽性克隆上述雜交細(xì)胞分開不同雜交細(xì)胞，克隆專一抗體，檢驗(yàn)陽性細(xì)胞單克隆抗體注射到小鼠體內(nèi)體外培養(yǎng)3、單克隆抗體的制備過程第1次篩選目的：得到雜交瘤細(xì)胞（多種）。第2次篩選目的：在雜交瘤細(xì)胞中篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。 該細(xì)胞繼承雙親細(xì)胞的遺傳特性，既能產(chǎn)生專一抗體又能無限增殖。雜交瘤細(xì)胞有何特點(diǎn)？特異性強(qiáng)，靈敏度高原理：雜交瘤細(xì)胞具有兩個親本的特性，即能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生足夠數(shù)量的單一抗體。過程B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合B-B細(xì)胞B-瘤細(xì)胞瘤-瘤細(xì)胞選擇培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞（ B-瘤細(xì)胞）克隆化培養(yǎng)抗體檢測雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)小鼠腹腔內(nèi)增殖單克隆抗體（1）為什么用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合？思考： 因?yàn)锽淋巴細(xì)胞具有分泌特異性抗體的能力