醫(yī)學(xué)CHAPTER5聚合酶鏈式反應(yīng)體外擴增DNA課件

1、Chapter 5 聚合酶鏈式反應(yīng)體外擴增DNA第1頁，共64頁。美國Mullis教授 開汽車時的聯(lián)想Chapter 5 聚合酶鏈式反應(yīng)體外擴增DNA第2頁，共64頁。聚合酶鏈式反應(yīng)示意圖第3頁，共64頁。PCR儀PCR反應(yīng)體系示意圖Chapter 5 聚合酶鏈式反應(yīng)體外擴增DNA第4頁，共64頁。Chapter 5 聚合酶鏈式反應(yīng)體外擴增DNA聚合酶鏈式反應(yīng)制備克隆用PCR產(chǎn)物的純化克隆化的PCR產(chǎn)物連入T載體通過PCR擴增在擴增DNA產(chǎn)物末端引入酶切位點應(yīng)用mRNA反轉(zhuǎn)錄擴增cDNA（RT-PCR）克隆在原核載體的DNA片段的快速鑒定長距離PCR反向PCR實時熒光定量PCR第5頁，共64頁

2、。1. 聚合酶鏈式反應(yīng)PCR反應(yīng)的基本成分：一種熱穩(wěn)定DNA聚合酶一對引導(dǎo)DNA合成的寡核苷酸引物脫氧核苷三磷酸二價陽離子，通常是Mg2+維持pH值的緩沖液一價陽離子（緩沖液中含50mmol/L KCl）模板DNA第6頁，共64頁。（1）DNA聚合酶1. 大腸桿菌聚合酶的Klenow片段，不耐熱，每次循環(huán)需重加酶。2. Taq酶（1988年）：是從溫泉耐高溫細菌中提取的耐熱性DNA聚合酶，其活性需要Mg2+ 。 但Taq-DNA聚合酶有一定錯配率（無35外切酶活性，有53外切酶活性），為0.1%-0.25%（30次cycle）；若要細胞克隆PCR擴增的產(chǎn)物，進行表達，擴增后必須測序證實才可使用

3、。 3. Tth、Pfu、Vent聚合酶：具有校讀功能。第7頁，共64頁。（2）寡核苷酸引物1. 長度：16-30bp ，一對引物。 過短非特異性擴增增加，竟爭并抑制特異擴增， 從而降低擴增的靈敏性； 過長易形成穩(wěn)定的雜合體或鏈內(nèi)互補，使引物的延伸溫度超過Taq酶的最適溫度，同時還使檢測成本增加。 2. G+C含量：占40-60%，Tm值在55 以上。3. 堿基的隨機分布：不要有連續(xù)3個以上的相同嘌呤或嘧啶存在。第8頁，共64頁。（2）寡核苷酸引物4. 引物自身不存在互補堿基（連續(xù)互補至少小于3bp)，防止二聚體的形成。5. 一對引物間不應(yīng)互補（連續(xù)互補至少小于4bp），尤其是它們的3端不應(yīng)互

4、補。6. 引物的純度要高。7. 引物與非特異靶區(qū)之間的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源，否則導(dǎo)致非特異性擴增。第9頁，共64頁。（2）寡核苷酸引物8. 引物的3端一定要與模板配對（引物的特異性，引發(fā)延伸的點），以引物3端A影響最大；末端最佳選擇為G 和C；引物3端也不要是編碼密碼子的第三個堿基，以免因為密碼子第三位的簡并性而影響擴增特異性。9. 引物的5端可以修飾：包括加酶切位點，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛等標記，引入酶切位點，引入啟動子序列，引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列等。10. 引物的設(shè)計最好以電腦軟件進行指導(dǎo)。第10頁，共64頁。（3） 脫氧核苷三磷酸四種等摩爾濃度的脫氧核苷三磷

5、酸：即dATP、dTTP、dCTP、dGTP一般濃度在200-250mol/L。高濃度dNTP對擴增反應(yīng)起抑制作用，可能因為dNTP與Mg2+螯合引起的效應(yīng)。若擴增片段在約1kb，每種dNTP濃度控制在20 mol/L至0.5-1.0 pmol/L，效果較好。第11頁，共64頁。（4）二價陽離子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶要求有二價陽離子激活，通常是Mg2+。由于dNTP與寡核苷酸結(jié)合Mg2+ ，陽離子的摩爾濃度必須超過dNTP與引物來源的磷酸鹽基團的摩爾濃度。一般在0.5-5.0 mmol/L。第12頁，共64頁。（5）維持pH值的緩沖液一般用Tris-Cl在室溫將PCR緩沖液的pH調(diào)至8.3-8.

6、8之間，標準PCR緩沖液中Tris-Cl濃度在10 mmol/L。在72溫育時（即PCR延伸階段的溫度），反應(yīng)體系的pH值會下降一個單位，導(dǎo)致緩沖液的pH接近7.2。第13頁，共64頁。（6）一價陽離子標準PCR緩沖液中含50 mmol/L KCl，它對于擴增大于500 bp長度的DNA片段是有益的。提高KCl 濃度到70-100 mmol/L范圍內(nèi)，對改善擴增較短的DNA片段產(chǎn)物是有利的。第14頁，共64頁。（7）模板DNA可以單鏈或雙鏈形式加入到PCR反應(yīng)液中。閉環(huán)DNA模板的擴增效率略低于線性DNA分子。盡管模板DNA的長短不是PCR擴增的關(guān)鍵因素，但是使用高分子量的DNA（10kb以上

7、）作模板時，如果用限制性內(nèi)切酶先消化，則擴增效果更好。第15頁，共64頁。聚合酶鏈式反應(yīng)的設(shè)計包括三個步驟，即變性、退火、延伸。1. 變性：一般在94-95 30s，根據(jù)G+C含量 。2. 退火（復(fù)性）：溫度太高，難以復(fù)性，擴增效率降低；溫度過低，非特異性復(fù)性，擴增出非特異性片段。通常比理論計算的引物和模板的熔接溫度降低3-5，一般30s。計算公式：Tm=2（A+T）+4（G+C）Tm=81.5+16.6(lgK+)+0.41(%G+C)-(675/n)第16頁，共64頁。3. 延伸：與DNA聚合酶的活性有關(guān)。一般Taq DNA聚合酶的最適溫度為72-78，延伸時間由擴增產(chǎn)物的長度決定，一般1

8、kb用1分鐘來保證充足的時間。4. 循環(huán)數(shù)：由反應(yīng)體系中起始的模板拷貝數(shù)以及引物延伸和擴增的效率。一旦PCR反應(yīng)進入幾何級數(shù)增長期，反應(yīng)會一直持續(xù)下去，直至某一成分成為限制因素。一般30-35個循環(huán)。聚合酶鏈式反應(yīng)的設(shè)計第17頁，共64頁。循環(huán)數(shù)主要取決于最初靶分子的濃度。如： 3x105、 1.5x104、 1x103 2530、 3035、 3540過多的循環(huán)次數(shù)會增加非特異性產(chǎn)物量及堿基錯配數(shù)；平臺效應(yīng)：PCR反應(yīng)后期，擴增產(chǎn)物并不成指數(shù)方式的增加；產(chǎn)生原因：dNTP與引物濃度降低，酶對模板的比例相對降低，酶活力降低，產(chǎn)物濃度增高后變性不完全而影響引物延伸。聚合酶鏈式反應(yīng)的設(shè)計第18頁，

9、共64頁。1. 按以下次序，在0.5ml無菌離心管加入： 10PCR緩沖液 5l 20mmol/L 4種dNTP混合液 1l 20mol/L 正向引物 2.5 l 20mol/L 反向引物 2.5 l 1-5U/ l 熱穩(wěn)定DNA聚合酶 1-2單位 模板 5-10l 用ddH2O 補足到50 lPCR反應(yīng)具體操作方法第19頁，共64頁。2. 設(shè)置反應(yīng)、循環(huán)條件 預(yù)變性：94 3-5min 變性 30-40 cycles 退火 延伸 延伸 72 10min 保存 4 PCR反應(yīng)具體操作方法第20頁，共64頁。3. 結(jié)果檢測吸取5l反應(yīng)后的溶液，用瓊脂糖凝膠電泳來檢測擴增結(jié)果，用DNA marke

10、r來判斷擴增片段的大小。擴增條帶與預(yù)期大小要一致?？梢杂肈NA序列分析，Southern雜交等方法鑒定。PCR反應(yīng)具體操作方法第21頁，共64頁。PCR結(jié)果疑難問題分析1. 目的條帶呈不清晰的成片條帶，條帶在凝膠中擴散到比期望分子量更小的DNA分子量的區(qū)域內(nèi)。原因：無效引導(dǎo)或無效延伸對策：（1）建立兩個引物不同濃度的PCR系列試驗，找出兩個引物的最適濃度和最佳鎂離子濃度。（2）應(yīng)用盡可能的退火溫度。（3）考慮添加佐劑，如牛白蛋白（0.2-0.6mg/ml），二甲基亞砜（5%）或甘油（5%）。第22頁，共64頁。PCR結(jié)果疑難問題分析2. 目的產(chǎn)物條帶在陽性對照2（不含旁觀者DNA和模板DNA）

11、與試驗管內(nèi)呈現(xiàn)非常模糊的帶型，而在陽性對照1（含旁觀者DNA，不含模板DNA）中有很強的條帶。原因：模板DNA不純對策：重新純化模板DNA，用酚氯仿抽提兩次，乙醇沉淀回收，純化后的DNA樣品溶解于水中（不含EDTA）。第23頁，共64頁。PCR結(jié)果疑難問題分析3. 在陰性對照中擴增出目的條帶。原因：盛模板DNA的器具或溶解模板DNA的溶液污染所致。對策：（1）重新清潔所用器具。（2）重新提取模板DNA，溶解模板DNA的溶液不能有污染。（3）重做整個PCR試驗。第24頁，共64頁。PCR結(jié)果疑難問題分析4. 擴增產(chǎn)物呈明顯的分子質(zhì)量錯誤的條帶。 原因：根據(jù)一條或兩條引物的非特異性引導(dǎo)。 對策：（

12、1）縮短復(fù)性時間或增加復(fù)性溫度。5. 擴增目的產(chǎn)物DNA呈現(xiàn)模糊的廣泛的成片條帶。 原因：引物二聚體所致或模板DNA過量。 對策：檢查引物是否均一、模板DNA序列內(nèi)是否存在高度重復(fù)序列，優(yōu)化每條獨立引物的濃度。應(yīng)用降落PCR或熱啟動PCR降低模板的量。第25頁，共64頁。PCR結(jié)果疑難問題分析第26頁，共64頁。PCR結(jié)果疑難問題分析第27頁，共64頁。PCR結(jié)果疑難問題分析第28頁，共64頁。2. 制備克隆用PCR產(chǎn)物的純化問題：PCR擴增片段經(jīng)酶切后不能順利地克隆到由相同酶切的載體上。原因：PCR產(chǎn)物經(jīng)酚氯仿抽提、乙醇沉淀及其他一些常用方法純化后，DNA樣品中還殘留一些具有酶活性的TaqD

13、NA聚合酶或其它熱穩(wěn)定的DNA聚合酶以及一些dNTP。DNA聚合酶會填平由限制酶消解產(chǎn)生的3凹端。第29頁，共64頁。制備克隆用PCR產(chǎn)物的純化方法1. 集中8支PCR反應(yīng)管的反應(yīng)液約400l，內(nèi)含目的基因擴增片段1g。2. 加0.2倍體積的5蛋白酶K緩沖液和終濃度至50g/ml的蛋白酶K。溫育反應(yīng)混合液在37水浴60min。3. 用75水浴20min加熱滅活蛋白酶K。4. 反應(yīng)混合液用酚氯仿與氯仿各抽提一次。5. 用乙醇沉淀法回收DNA擴增產(chǎn)物。第30頁，共64頁。制備克隆用PCR產(chǎn)物的純化方法6. 用微量離心機于4高速離心5min，回收沉淀下來的DNA，小心棄去上清，用1ml 70%乙醇于

14、室溫洗滌沉淀的樣品，再次離心樣品，棄去上清，使乙醇揮發(fā)殆盡。7. 將沉淀下來的DNA樣品溶于TE，一般推測擴增DNA樣品的回收率在50%-80%。8. 可取純化后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，計算DNA樣品的實際含量。第31頁，共64頁。3. 克隆化的PCR產(chǎn)物連入T載體T載體有與A堿基互補的未配對3T堿基。T載體可用以下三種方法構(gòu)建：1. 可用限制性內(nèi)切核酸酶如XcmI、HphI與MboII酶切產(chǎn)生3末端未配對T堿基。2. 應(yīng)用末端轉(zhuǎn)移酶與雙脫氧TTP加入一個突出的T殘基到線性化載體的3末端。3. 應(yīng)用不依賴于模板的Taq DNA聚合酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性在線性化載體的3末端處的羥基基團上催化

15、連接上一個T堿基。第32頁，共64頁?？寺』腜CR產(chǎn)物連入T載體的方法1. 在一只微量離心管內(nèi)，依次加入下列連接混合液 PCR擴增的目的DNA 3 l T載體 0.5l 10 連接緩沖液 1 l 噬菌體T4DNA連接酶 1 l 用H2O補足至 10 l2. 將連接混合液在14溫育4h。3. 取連接反應(yīng)后的混合液適量，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。第33頁，共64頁?？寺』腜CR產(chǎn)物連入T載體的方法4. 將轉(zhuǎn)化的細胞涂布在含有抗生素、IPTG和X-gal的固體培養(yǎng)平板上。5. 過夜培養(yǎng)后，挑取白色菌落，進行培養(yǎng)。6. 提取質(zhì)粒DNA。7. 用相應(yīng)的限制性內(nèi)切核酸酶進行酶切鑒定，或用PCR進行鑒定。

16、8. 通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定克隆DNA片段的大小。9. 通過測序來分析PCR擴增片段的正確性。第34頁，共64頁。4. 通過PCR擴增在擴增DNA末端引入限制性內(nèi)切酶酶切位點用于PCR擴增的寡核苷酸引物的5末端常被設(shè)計加入相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切位點。擴增產(chǎn)生的目的片段的雙末端被引入新的酶切位點經(jīng)酶切消化后的擴增片段能定向克隆至相應(yīng)的載體。用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化純化后的擴增片段與載體連接，將連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，即可完成克隆。第35頁，共64頁。通過PCR擴增在擴增DNA末端引入限制性內(nèi)切酶酶切位點第36頁，共64頁。通過PCR擴增在擴增DNA末端引入限制性內(nèi)切酶酶切位點1. 設(shè)計帶有限制性酶切位點的正向和

17、反向引物，進行PCR擴增。2. 電泳檢查PCR擴增結(jié)果。如果PCR產(chǎn)物電泳檢查有多條帶，可通過低熔點瓊脂糖純化目的條帶，純化產(chǎn)物溶于TE。3. 取約100ng 純化后的PCR產(chǎn)物，在20l酶切體系中加入適量限制性內(nèi)切核酸酶進行酶切消化。第37頁，共64頁。通過PCR擴增在擴增DNA末端引入限制性內(nèi)切酶酶切位點4. 消化結(jié)束后，用酚氯仿和氯仿各抽提一次。5. 轉(zhuǎn)移反應(yīng)液上層水相至一個新的離心管中，加入3 mol/L 乙酸鈉至終濃度為0.3 mol/L，加入2倍體積的乙醇，在-20貯存30min。6. 4 高速離心5min，使DNA沉淀，棄上清，然后用70%乙醇洗滌沉淀，溶液再離心，棄上清，將DN

18、A沉淀在空氣中晾干數(shù)分鐘。7. 將DNA樣品溶于10 水中。第38頁，共64頁。通過PCR擴增在擴增DNA末端引入限制性內(nèi)切酶酶切位點8. 在一只微量離心管內(nèi)，依次加入下列試劑： PCR擴增的目的DNA 3 l 質(zhì)粒DNA 1l 10 連接緩沖液 1 l T4DNA連接酶 1 l 用H2O補足至 10 l9. 將上述連接反應(yīng)混合液在16溫育4h。10. 取連接反應(yīng)后的混合液適量，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。第39頁，共64頁。11. 將轉(zhuǎn)化的細胞涂布在含有抗生素、IPTG和X-gal的固體培養(yǎng)平板上。12. 過夜培養(yǎng)后，挑取白色菌落，進行培養(yǎng)。13. 提取質(zhì)粒DNA。14. 用相應(yīng)的限制性內(nèi)切核酸

19、酶進行酶切鑒定，或用PCR進行鑒定。15. 通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定克隆DNA片段的大小。16. 通過測序來分析PCR擴增片段的正確性。通過PCR擴增在擴增DNA末端引入限制性內(nèi)切酶酶切位點第40頁，共64頁。5. 應(yīng)用mRNA反轉(zhuǎn)錄擴增cDNA（RT-PCR）RT-PCR是一種從RNA擴增cDNA拷貝的方法?？梢詷?gòu)建cDNA文庫，也可以測定基因表達的強度。第一步為酶促催化使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。一條寡核苷酸引物先與mRNA雜交，然后由RNA依賴的DNA聚合酶催化合成互補的cDNA，后者能進一步用于PCR擴增。第41頁，共64頁。應(yīng)用mRNA反轉(zhuǎn)錄擴增cDNA（RT-PCR）單鏈cDNA

20、第一鏈合成的引物可用基因特異性引物（GSP）、Oligo(dT)和一種隨機六核苷酸序列進行引導(dǎo)。1. Oligo(dT)能與哺乳動物mRNA的內(nèi)源polyA尾相結(jié)合，能用于常規(guī)的第一鏈cDNA合成。2. GSP可與靶RNA或mRNA的某個區(qū)域相雜交。3. 應(yīng)用隨機六核苷酸引物能夠沿著RNA模板的許多位點引導(dǎo)cDNA合成，并產(chǎn)生RNA分子總體中的許多片段的拷貝。第42頁，共64頁。應(yīng)用mRNA反轉(zhuǎn)錄擴增cDNA（RT-PCR）1. 轉(zhuǎn)移適量mRNA（1pg-100ng）或總RNA（10pg-1g）到一只新的離心管。用水調(diào)整體積至10l，將RNA樣品在75變性5min，將離心管迅速放入冰上冷卻。2

21、. 再依次加入（用水補足至20 l）37 溫育60min 10擴增緩沖液 2 l 20 mmol/L 4種dNTP混合液 1 l 引物 1 l 約20單位/l胎盤RNase抑制劑 1 l 50mmol/L MgCl2 1 l 100-200單位/l反轉(zhuǎn)錄酶 1 l 第43頁，共64頁。應(yīng)用mRNA反轉(zhuǎn)錄擴增cDNA（RT-PCR）引物加入的量：推薦20l反應(yīng)體系中加入： 與靶RNA互補的寡核苷酸 5-20 pmol/L Oligo(dT)12-18 0.1-0.5 g 隨機六核苷酸 1-5 g設(shè)置3個陰性對照：1：不加模板，其它均加入2：不加反轉(zhuǎn)錄酶，其它均加入3：不加引物，其它均加入第44頁

22、，共64頁。應(yīng)用mRNA反轉(zhuǎn)錄擴增cDNA（RT-PCR）3. 將反應(yīng)管在95加熱5min，使反轉(zhuǎn)錄酶失活和RNA-cDNA雜合物變性。4. 調(diào)整反應(yīng)混合液體積以便使正義和反義引物濃度在20 pmol/L。5. 離心管內(nèi)加入以下反應(yīng)試劑： 1擴增緩沖液和1-2單位熱穩(wěn)定DNA聚合酶。6. 按照PCR方法設(shè)定PCR程序。7. 電泳檢測PCR擴增結(jié)果。第45頁，共64頁。6.克隆在原核載體的DNA片段的快速鑒定已轉(zhuǎn)化的重組載體的細菌細胞或噬菌體顆粒可通過直接從培養(yǎng)皿上挑取菌落或噬菌斑獲得，然后直接加入到PCR混合液中。PCR混合液中含有除熱穩(wěn)定DNA聚合酶外的所有試劑，其中引物要與所需鑒定的已克隆

23、的DNA片段互補。先將PCR混合液加熱煮沸幾分鐘，使DNA模板從細菌細胞或噬菌體顆粒中釋放出。再加入熱穩(wěn)定DNA聚合酶進行標準的PCR反應(yīng)。第46頁，共64頁。7.長距離PCR對于大片段基因，標準PCR有時達不到要求：1. PCR高溫條件使緩沖液失去對正常pH范圍的緩沖能力，從而損壞模板和產(chǎn)物DNA。2. 變性存在困難3. DNA聚合酶難以與模板DNA接近、結(jié)合，致使DNA聚合酶不能發(fā)揮催化功能。4. Taq DNA聚合酶缺乏校正功能，具有較高頻率的錯誤堿基的摻入。生長鏈3末端的不匹配堿基的摻入會導(dǎo)致DNA聚合酶的失靈，從而限制PCR產(chǎn)物的長度。第47頁，共64頁。如何解決標準PCR難以擴增長片段DNA的問題？適當調(diào)整反應(yīng)條件。應(yīng)用兩種不同的熱穩(wěn)定DNA聚合酶一起催化PCR擴增反應(yīng)，消除生長鏈3末端的不匹配堿基的摻入的難題。其中一種DNA聚合酶可以催化擴增反應(yīng)高度有效、生長鏈延伸很長但易發(fā)生不配對堿基摻入的聚合酶；另外一種聚合酶提供3-5核酸外切酶功能，能及時切除不匹配堿基的摻入（Pfu酶）。第48頁，共64頁。8.反向PCR反向PCR（inverse PCR）：擴增與已知DNA序列某一個末端相鄰的側(cè)翼的未知DNA序列，這種未知序列沒有引物可以利用。一般步驟：1. 對含有已知序列以及側(cè)翼區(qū)域的基因組DNA樣品用一種在靶序列中無切點的限制性內(nèi)切酶消化，形成多種