生物化學(xué)DAPKC信號傳遞途徑教學(xué)課件

1、2.2.1 DAG的生成 CAs 1R Gq PLC EGF EGFR(RTPK) PLC DAGCH2-OOC-R1 CH2-OOC-R1 CH2-00C-R1CH OOC-R2 CH-OOC-R2 CH-OOC-R2 CH2-O-P-o-CH2CH2-N+-(CH3)3 CH2-O-P CH2OHPP PC-PLDP磷脂酰膽堿(PC) 磷脂酸(PL) DAG (參與長期應(yīng)答) PIP22.2 DAG-PKC信號傳遞途徑(參與短期應(yīng)答)2.2.2 DAG 激活蛋白激酶C PKC 的種類與結(jié)構(gòu) 單鏈多肽，586 737aa, 6783KD, 12種亞型分為三大組： 典型PKC 新型PKC 非典

2、型PKC絞鏈區(qū)PKC從功能上分： 4個保守區(qū)（C1C4）被5個可變區(qū)(V1V5)間隔開C1區(qū)：富含Cys，是DAG和PS的結(jié)合部位，同時含有假底物序列；C2區(qū)：是Ca2+結(jié)合部位；C3區(qū)：是ATP結(jié)合部位；C4區(qū)：是底物結(jié)合部位及酶活性區(qū)，可催化底物發(fā)生磷酸化 由于各類PKC肽鏈N端調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)構(gòu)差異大，因而具有不同 的活化機(jī)制。（2） PKC 的活化過程 cPKC cPKC cPKC-Ca2+ cPKC-Ca2+-DAG 活性酶 nPKC nPKC nPKCDAG 活性酶 aPKC aPKCPS 活性酶 Ca2+DAG絞鏈區(qū)斷裂 DAG誘導(dǎo)PS輔助 蛋白酶 DAG 絞鏈區(qū)斷裂 PS輔助 蛋白酶

3、絞鏈區(qū)斷裂 蛋白酶 “引爆復(fù)合物”2.2.3 PKC的調(diào)節(jié)作用（1） 參與代謝的調(diào)節(jié) 糖原合酶磷酸化而失活糖原合成； HMG-CoA還原酶磷酸化而失活膽固醇合成。（2） 參與Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié) PKC使質(zhì)膜上的鈣泵磷酸化而活化Ca2+外流（3）參與膜受體功能的調(diào)節(jié) PKC使RTPK胞內(nèi)側(cè)Ser/Thr發(fā)生磷酸化修飾，使受體鈍化（4） 調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄TPA反應(yīng)元件(TRE)NF-B轉(zhuǎn)錄因子血清反應(yīng)因子(SRF) TPA反應(yīng)元件（TRE）途徑 受DAG-PKC調(diào)控的一段DNA堿基序列TGAGTCA被稱為TPA反應(yīng)元件。 TPA佛波醇酯，具有與DAG相似的性質(zhì)，可以代替DAG激活PKC,作用于TGA

4、GTCA，影響基因表達(dá)。 在DAG-PKC途徑中， 生長因子RTPKPLCDAGPKC進(jìn)入核使核內(nèi)蛋白磷酸酶（PP）磷酸化而活化活化PP可使核內(nèi)激活蛋白1（AP-1）脫磷酸而活化活化AP-1與TPA反應(yīng)元件（TRE）結(jié)合 基因表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖、遷移。TPA(CDK2、Rb、P21、P27、膜蛋白) NF-B 反應(yīng)途徑 在細(xì)胞內(nèi)保持低水平的持續(xù) 活性。這對于維持免疫細(xì)胞的生長、發(fā)育，調(diào) 節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子、黏附因子、生長因子、 氧化應(yīng)激相關(guān)酶蛋白、急性時相蛋白等基因的表 達(dá)，免疫功能的正常發(fā)揮具有重要生理意義。 在機(jī)體受到創(chuàng)傷性、感染性 等刺激后，可使NF-B 活性異常增高，導(dǎo)致大量 慢

5、性炎癥因子（如IL-6、IL-8、GM-CSF、IL-1、 TNF-等）過度釋放，引起系統(tǒng)性反應(yīng)綜合癥， 嚴(yán)重時，全身多器官功能衰竭。NF-B組成型轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子 急性肺損傷、急慢性炎癥反應(yīng)、腫瘤形成與發(fā)展、心血管疾病的發(fā)病、動脈粥樣硬化的形成、艾滋病病毒基因的活化等都與NF-B 的過度活化有關(guān)。 在病理狀態(tài)下，如果能抑制NF-B 的過度活化，則有可能緩解甚至治愈這些疾病，這已成為當(dāng)前臨床治療學(xué)研究的熱點課題。 NF-B家族中，由P50、P65兩個亞基構(gòu)成的異二聚體，稱為NF-B（p50-p65）。 P65亞基: N端-核移位信號序列（NLS） 含有DNA結(jié)合域 基礎(chǔ)狀態(tài)下， NF-B

6、異二聚體與I- B結(jié)合形成無活性的異三聚體 , 使分子中的NLS被I- B掩蓋，只能停留在胞質(zhì)中。 NF-B I- B 當(dāng)細(xì)胞受到LPS、 IL-1、 TNF-、TPA等刺激時，可使I- B磷酸化激酶（IKK）迅速激活， IKK使I- B發(fā)生磷酸化修飾（ I- BSer-P ）， I- BSer-P 被泛素化（ubiquitin）,進(jìn)而受到蛋白酶小體作用，使I- B降解而與NF-B分離， NF-B由此而活化，進(jìn)入核，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。 IKK可以受到多種激酶活化，如MAPKK、PKC等，還受PP-2A抑制。 細(xì)胞因子（TNF-） 膜受體（RTPK） PLC DAG PKC IKK-P NF-BI-

7、 B-PubiquitinNF-BI- B-P- ubiquitin 蛋白酶NF-B游離而活化 使I-B降解活化NF-B進(jìn)入核與靶基因B序列“GGGACTTTCC-”特異結(jié)合上調(diào)多種炎癥相關(guān)因子的基因表達(dá)引起多種急慢性炎癥反應(yīng) 活化NF-B還可激活Bcl2家族成員A1/BF1-1抑制TNF引起的細(xì)胞凋亡使腫瘤細(xì)胞成活。 NF-B在一系列由細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)引起的疾病發(fā)生過程中起著非常重要的作用；除此外， NF-B的激活還參與了心血管病、腫瘤及多種病毒感染的發(fā)病過程。 目前，人們試圖從NF-B激活通路的多個環(huán)節(jié) 抑制 I- B的降解、減少NF-B的合成、產(chǎn)生I- B突變體以抵抗蛋白酶的降解、P6

8、5的反義RNA等，設(shè)法阻斷NF-B從靜息態(tài)向激活態(tài)轉(zhuǎn)變。 SRF反應(yīng)途徑 細(xì)胞接受EGF信號刺激后 RTPK活化PLC DAG PKC SRF-P而活化活化SRF進(jìn)入核 作用于DNA中的SRF反應(yīng)元件“CCAT6GG”促進(jìn) 基因轉(zhuǎn)錄。 其他受PKC磷酸化的蛋白 肌鈣蛋白、微管蛋白、CDK2、Rb蛋白、p21、p27等 膜受體酪氨酸蛋白激酶途徑 Grb2 Ras-MAPK途徑 PLC DAG-PKC途徑 insulin-IR-PI3K-PKB途徑 FasL-Fas/CD95 細(xì)胞凋亡途徑 TGF-Smad途徑 GFRTPK 3.1 Ras-MAPK途徑 Ras蛋白是癌基因ras表達(dá)產(chǎn)物，包括一大

9、族小G蛋白。 與前述的異三聚體G蛋白比較，小G蛋白有下列特性： 1）單體 2）分子量小，2030KD 3）其活性以結(jié)合GDP或GTP兩種形式變換， Ras-GTP(有活性) Ras-GDP(無活性) 4）兩種形式轉(zhuǎn)換受GAP、GEF和GDI的調(diào)節(jié) 5）不直接與膜受體（RTPK）連接。 Ras-GDP Ras-GTP GEF GDI內(nèi)源性GTP酶 GAPGTPGDP+ - （無活性）（有活性） 在GEF和GAP的交替作用下，使Ras蛋白活性受到激活或失活的調(diào)節(jié)。Pi將信號下傳 基礎(chǔ)狀態(tài)的Ras-GDP需要Grb2與GEF（SOS）形成的復(fù)合物（ Grb2GEF ）作為銜接蛋白（接頭分子），才能與

10、膜受體RTPK相連接。 RTPK - CH2 - Grb2 - CH3 GEF Ras-GDP Ras-GTP有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）系統(tǒng) 將信號傳入核 調(diào)節(jié)基因表達(dá)。MAPK系統(tǒng)：存在于胞質(zhì)的一組蛋白Ser/Thr激酶兼底物分子。MAPK（ mitogen activated protein kinase） ，又稱ERK， 有絲分裂原蛋白激酶，或稱胞外信號調(diào)節(jié)激酶， 是將信號從胞質(zhì)傳入胞核的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)蛋白MAPKK: MAPK激酶，又稱MEK, 催化MAPK磷酸化修飾MAPKKK: MAPKK激酶，又稱Raf, 催化MAPKK磷酸化， 而其活性又受上游Ras-GTP激活 Ras-G

11、TPMPKKKMAPKKMAPK進(jìn)入核催化多種轉(zhuǎn)錄因子（TF）發(fā)生磷酸化修飾調(diào)控基因表達(dá) Ras-MAPK途徑 MAPK-p可以激活一大類轉(zhuǎn)錄因子， 如Jun、Fos、CBP 等核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Rsk: 核糖體S6激酶， 在核內(nèi)催化TF磷酸化 ；MKP: MAPK磷酸酶，使MAPK-P去磷酸而失活。 許多生長因子，如EGF、PDGF、FGF、NGF等可以通過Ras-MAPK途徑傳遞信息，以促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖。 該途徑是維持細(xì)胞正常生長必不可少的。但當(dāng)該途徑被異常激活時，可導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要原因。 ras家族包括H-ras、K-ras和N-ras 3個成員。許多人類腫瘤

12、中發(fā)現(xiàn)有這3個基因的突變。其中K-ras的突變最普遍。ras基因突變 Ras蛋白活性被永久性激活，可引發(fā)多種腫瘤。 如肺癌、結(jié)腸直腸癌及膀胱癌ras突變檢測率為3066； 胰腺癌為75100； 侵襲性人類腫瘤可達(dá)90。3.2 PLC-DAG-PKC傳遞途徑胰島素IR IRS-1PI3K PIP3PDKPKB/AktGlc-T4 肌肉、脂肪細(xì)胞攝取G GSK-3- GS 糖原合成 血糖 PKB PFK2 FBP2 促進(jìn)葡萄糖分解P敲除PTP-1B基因小鼠高脂飲食胰島素抵抗3.3 胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑3.4 FasL-Fas/CD95細(xì)胞凋亡通路細(xì)胞凋亡（Apoptosis）： 又稱為細(xì)胞程序性死亡

13、（PCD） 是指細(xì)胞為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡。 從20世紀(jì)60年代初期，開始探索程序性細(xì)胞死亡的奧秘。 布雷內(nèi)： 選擇線蟲作為對象研究基因與細(xì)胞分裂、分化、器官發(fā)育的關(guān)系； 霍維茨： 發(fā)現(xiàn)了線蟲中控制細(xì)胞死亡的關(guān)鍵基因及其作用；并且證實了相應(yīng)的基因也存在于人體中。 蘇爾斯頓： 則描述了基因在程序性細(xì)胞死亡過程中的變化。 Sydney Brenner H. Robert Horvitz John E. Sulston 悉尼布雷內(nèi) 羅伯特霍維茨 約翰蘇爾斯頓 榮獲2002年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎成就：發(fā)現(xiàn)了在器官發(fā)育和程序性細(xì)胞死亡 過程中的基因規(guī)則 細(xì)胞凋亡的主要特征：（1）

14、形態(tài)學(xué)變化： 凋亡小體（2）生物化學(xué)變化：DNA片段化（180200bp長度） 細(xì)胞凋亡的基本過程： 接受凋亡信號凋亡調(diào)控分子的相互作用蛋白水解酶（Caspase）的活化進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過程。 參與細(xì)胞凋亡的主要成員： 死亡受體途徑：FasL-Fas/CD95 , TNF-TNFR2. 蛋白水解酶（Caspase 1-14，3050KD酶原形式） caspase：cysteine aspartate-specific protease 天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶 線粒體途徑：Cyt.c， Bcl-2蛋白家族, Apaf-1, DNA內(nèi)切核酸酶 Caspase分兩大類（人類有11種）：（一） 參與

15、炎癥反應(yīng) 包括：Caspase-1、4、5、11、12和14；（二） 參與細(xì)胞凋亡 凋亡起動酶Caspase-8和9； 凋亡效應(yīng)酶Caspase-3、6和7. Bcl-2蛋白家族（分以下三類）：抗凋亡促凋亡細(xì)胞凋亡的主要途徑：（一）死亡受體途徑 FasL-Fas/CD95-Caspase-8 或TNF-TNFR-Caspase-8 （二）線粒體途徑 由Bax-Cyt.C-Apaf-1 -Caspase-9死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑PI3KPKB使Bad和Caspase-9發(fā)生磷酸化而失活使細(xì)胞存活死亡受體途徑： FasL-CD95 連接FADD 激活Caspase-8 激活Ca

16、spase-3、6、7 細(xì)胞凋亡 線粒體途徑： Bax或Bak 線粒體釋放Cyt.c 與Apaf-1形成凋亡體 激活Caspase-9 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡與醫(yī)學(xué) 1）參與調(diào)節(jié)胸腺細(xì)胞的成熟；2）HIV感染后，使CD4+細(xì)胞遭到特異性破壞，導(dǎo)致 免疫功能缺陷；3）腫瘤細(xì)胞的凋亡受抑，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；4）識別自身抗原的免疫活性細(xì)胞凋亡受抑，引起淋巴細(xì)胞 增殖性的自身免疫性疾?。?）神經(jīng)細(xì)胞凋亡過度，導(dǎo)致AD的發(fā)病3.5 TGF-Smad傳遞途徑 該途徑主要有兩大類成員：TGF受體-Smad家族 TGF受體是橫跨細(xì)胞膜1次的Ser/Thr激酶型受體，主要有兩個亞型 ： TGFR（479aa）和TGF

17、R(565aa)， 人類Smad蛋白家族主要有Smad1Smad8個成員， Smad蛋白家族分為三類： 受體調(diào)節(jié)SmadR-Smad 共配體SmadCo-Smad 抑制性SmadI-Smad R-Smad: (Smad1、2、3、5、8)Co-Smad: （Smad4）I-Smad: (Smad6、7)TGF-Smad傳遞途徑 TGF 是一種多功能細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)、造血調(diào)控、炎癥反應(yīng)等多個領(lǐng)域都起著十分重要的作用。 TGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤發(fā)生中呈多功能性： 癌癥早期： TGF抑制腫瘤細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)其凋亡，起腫 瘤抑制因子作用； 腫瘤進(jìn)展期： TGF對腫瘤細(xì)胞的抑制作用消失，使腫瘤 細(xì)胞呈現(xiàn)優(yōu)勢生長；腫瘤發(fā)展晚期：TGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改變（發(fā)生免疫抑制、血 管新生、細(xì)胞外基質(zhì)分泌等），從而利于腫瘤 細(xì)胞生長、浸潤及轉(zhuǎn)移，起腫瘤刺激因子作用。主要原因： 1）TGF-R發(fā)生突變： 型受體突變胃腸道癌； 型受體突變宮頸癌、淋巴癌、乳腺癌轉(zhuǎn)移等； 2） Smad突變： Smad4缺失胰腺癌； Smad4突變結(jié)腸直腸癌，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌；3）TGF調(diào)控的靶基因