枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究

1、. 畢業(yè)設(shè)計(論文)課 題 名 稱枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究 2014 年 5 月 15 日. 目 錄TOC o 1-3 h u HYPERLINK l _Toc10481 摘 要2 HYPERLINK l _Toc10481 Abstract3 HYPERLINK l _Toc26464 1 前言4 HYPERLINK l _Toc13219 2 材料與方法7 HYPERLINK l _Toc2 2.1實驗試劑與材料7 HYPERLINK l _Toc2 2.2主要儀器與設(shè)備7 HYPERLINK l _Toc2 2.3試驗方法8 HYPERLINK l _Toc17111 3 結(jié)果與分

2、析8 3.1枯草芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲9 HYPERLINK l _Toc4833 3.2單因素試驗結(jié)果10 HYPERLINK l _Toc24454 3.3正交試驗結(jié)果分析 PAGEREF _Toc24454 13 HYPERLINK l _Toc17111 4 結(jié)論和討論155 HYPERLINK l _Toc17111 參考文獻(xiàn)166 HYPERLINK l _Toc17111 致17. 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究摘 要本文通過單因素實驗和正交試驗研究枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的發(fā)酵條件PH、溫度、時間、接種量對枯草芽孢桿菌生長量的影響。本實驗的枯草芽孢桿菌在BP

3、G液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過單因?qū)嶒灱罢辉囼灥玫阶钫_的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：初始pH 7.0；溫度35；時間20h；接種量為5%。在此培養(yǎng)條件下的活菌液量為3.785107CFU/ml，相比在LB培養(yǎng)基下培養(yǎng)時的活菌液量3.2106CFU/ml提高了10倍左右。關(guān)鍵字：枯草芽孢桿菌；正交試驗；生長量Optimization study of bacillus subtilis culture conditionsAbstractIn this paper, we study Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) fermentation conditions (

4、PH, temperature, time, quantity of) the impact on the growth of Bacillus subtilis. The e*periment of bacillus subtilis in bined cultivated in liquid medium, is obtained by single for e*periment and the orthogonal e*periment the best fermentation culture conditions as follows: the initial PH 7.0. Tem

5、perature 35 ; Time 20 h; Inoculation quantity was 5%. Under the condition of the cultivation of the best amount of bacterium fluid is 3.785 * 107 cfu/ml, pared to when cultured in LB medium under the microbial quantity: 3.231 * 107 cfu/ml by about 10 times.Key words: Bacillussubtilis; Culture condit

6、ions; increment1前言枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種好氧性產(chǎn)芽孢桿狀細(xì)菌(G+)1，其根本特征：桿菌：一般 0.7-0.82.0-3.0 m，電子顯微鏡測量為 0.5-0.61.1-3.5 m，著色均勻，無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落外表粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。 由于枯草芽孢桿菌是需氧菌在水質(zhì)凈化2、工業(yè)發(fā)酵中發(fā)揮著重要的作用，人們開場致力于研究枯草芽孢桿菌應(yīng)用于這些方面的研究。關(guān)于枯草芽孢桿菌的研究與應(yīng)用已有100

7、多年的歷史，早期大局部工作集中在形態(tài)觀察、分類鑒定、生理機制、功能開掘及防治等方面。近年來，對枯草芽孢桿菌的研究漸進(jìn)到遺傳學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，研究容表達(dá)在特定功能基因的尋找并克隆到需要的物種中或者通過誘變、基因工程等手段對枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌進(jìn)展遺傳改造等。但目前對該菌種的研究仍然處于實驗室的初始階段的水平。但是枯草研報桿菌有一系列的優(yōu)良性狀吸引這一些的科學(xué)家的目光，他們相信隨著經(jīng)濟的開展，枯草芽抱桿菌資源對在工、農(nóng)、醫(yī)等方面有重大應(yīng)用價值，開發(fā)利用更具有重要意義?？莶菅挎邨U菌是一類廣泛分布于各種不同生活環(huán)境中的革蘭氏陽性桿狀好養(yǎng)型細(xì)菌，可以產(chǎn)生生芽孢，耐熱抗逆性強3，在土壤和植物的外表普遍存在

8、，同時還是植物體常見的一種生菌，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境。由于枯草芽孢桿菌生長速度快，營養(yǎng)需求簡單，易于存活，定殖與繁殖，無致病性，并可以分泌多種酶和抗生素4,5，而且還具有良好的發(fā)酵根底，用途十分廣泛，國外有眾多研究單位和學(xué)者對此菌進(jìn)展了大量研究，也積累了豐富的研究資料。通過對枯草芽孢桿菌系列的研究，一方積累枯草芽孢桿菌規(guī)律信息為以后開發(fā)提供依據(jù)；另一方面也可了解芽孢桿菌與生態(tài)環(huán)境間的相互關(guān)系，為芽孢桿菌資源的利用奠定根底6 ?，F(xiàn)在對于枯草芽孢桿菌的主要運用方面：1在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛開展和集約化經(jīng)營程度的不斷提高，養(yǎng)殖水體污染日趨嚴(yán)重，許多養(yǎng)殖池中有害藻類及病菌大量繁殖

9、，水質(zhì)條件不斷惡化，其后果影響到了水產(chǎn)品平安和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)開展7。利用常規(guī)藥物防治方法，不但易加重水質(zhì)惡化程度，本錢也較高，而利用微生物制劑改善養(yǎng)殖水體環(huán)境受到人們越來越多的關(guān)注?？莶菅挎邨U菌是一種好氧的革蘭氏陽性菌，在自然界廣泛存在，生命力極強，代旺盛，對人畜無害，不污染環(huán)境，具有廣譜的抗菌活性和極強的抗逆能力8?？莶菅挎邨U菌能有效的降解水體中的氨氮、亞硝酸鹽和硫化物，到達(dá)凈化水質(zhì)的目的。因此，枯草芽孢桿菌在養(yǎng)殖水體的生物修復(fù)方面得到了廣泛的應(yīng)用9,10。在水體或飼料中添加枯草芽孢桿菌制劑，可以有效抑制或殺滅水體中或養(yǎng)殖生物體的*些有害致病菌，并且能增強有益菌的群落，而到達(dá)防治水產(chǎn)疾病的目的

10、；芽孢桿菌可以降低水體中硝酸鹽、亞硝酸鹽的含量，從而起到改善水質(zhì)的作用11；芽孢桿菌還可以通過消滅病原體或減少病原體的影響來改善水質(zhì)；枯草芽孢桿菌對水產(chǎn)中的弧菌、大腸桿菌和桿狀病毒等有害微生物有很強的抑制作用，有效預(yù)防水產(chǎn)動物腸炎，爛鰓等疾病。同時枯草芽孢桿菌也可以分泌大量幾丁質(zhì)酶的功能。幾丁質(zhì)酶可分解病原真菌的細(xì)胞壁而抑制真菌病害，分解養(yǎng)殖池中的有毒有害物質(zhì)，凈化水質(zhì)12-14；也可以分解池中殘餌、糞便、有機物等，具有很強的清理水中垃圾小顆粒的作用?？莶菅挎邨U菌還可以改善有害藍(lán)藻泛溢造成的水質(zhì)渾濁問題，水質(zhì)由渾變清，具有很強的凈化水質(zhì)功能。其在水量繁殖時分泌的胞外酶可分解、吸收水及底泥中的蛋

11、白質(zhì)、淀粉、脂肪等有機物，有降低水體富營養(yǎng)化和去除底泥的作用。在作用過程中，能夠促進(jìn)飼料中營養(yǎng)素降解，有機營養(yǎng)一局部轉(zhuǎn)化為細(xì)胞物質(zhì)，大局部轉(zhuǎn)化為細(xì)菌活動的能量。在其轉(zhuǎn)化過程中，氨氣、氮氣就從水中逸散到大氣用這種方法，水中氨氮和硝基氮可除去 。另一局部有機營養(yǎng)轉(zhuǎn)化為優(yōu)勢的有益菌體，此法廣泛應(yīng)用于河蟹、育苗、蝦、甲魚養(yǎng)殖15。 2在食品工業(yè)上的應(yīng)用血栓性疾病嚴(yán)重威脅著人類的生命與安康，其發(fā)病率和死亡率居各種疾病之首。大量的研究說明，飲食習(xí)慣與動脈硬化和血栓等疾病有密切的關(guān)系，納豆是日本的傳統(tǒng)食品，已經(jīng)有2000多年的歷史。納豆是由納豆芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌發(fā)酵大豆而成。日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)在枯草桿菌發(fā)現(xiàn)的

12、傳統(tǒng)納豆(Natto)食品中含有一種具有溶解血栓功能的納豆激酶(Nattokinase)是一種枯草桿菌蛋白激酶16，可簡稱為枯激酶(Bacillokinase)。該酶在體除可溶解血栓外，明顯地縮短優(yōu)球蛋白的溶解時間(ELT)，以及激活體的血管皮細(xì)胞產(chǎn)生t-PA，由此可見，可探索開發(fā)一種新的溶栓藥品。納豆是日本的傳統(tǒng)食品，已經(jīng)有2000多年的歷史。由于納豆中含有能溶解血栓的納豆激酶17，因此很適合作為一種保健食品每天食用。研究說明，每天食用150 g新鮮納豆可起到預(yù)防血栓類疾病的作用。另外，常吃納豆對癌癥、糖尿病、高血壓、動脈硬化、肥胖病等均可起到預(yù)防和緩解及治療作用.納豆枯草芽孢桿菌能在腸道生

13、長，分泌各種酶和維生素，促進(jìn)小腸黏膜細(xì)胞的增殖18-19，促進(jìn)胃腸道各種消化酶活性，并具有抑制腸道有害菌的作用，能夠?qū)⑷祟惣捌渌麆游镫y以消化吸收的大豆蛋白發(fā)酵形成大豆多肽和小分子物質(zhì)的混合物；同時此菌在不利環(huán)境中形成芽胞，能耐高溫高壓，經(jīng)受飼料加工工藝要求，易貯存。目前很多研究均顯示，枯草芽胞桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)20抑制病原菌的繁殖并且對生物體本身無害，可提高養(yǎng)殖動物的產(chǎn)品質(zhì)量，是一種應(yīng)用非常廣泛的益生菌。因此，近年來枯草芽胞桿菌在飼料開發(fā)和生物防治等領(lǐng)域的應(yīng)用成為研究熱點。 3在醫(yī)藥方面的應(yīng)用枯草芽孢桿菌的活菌制劑可以作為口服液用于治療腸炎、支氣管炎和腹瀉等多種疾病，也用來預(yù)防和治療燒傷

14、面的感染?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)從枯草芽孢桿菌提取到的淀粉酶、纖維素酶能夠補充體消化酶的缺乏，恢復(fù)正常消化機能；蛋白酶能夠分解發(fā)炎部位纖維蛋白的凝結(jié)物，消除傷口周圍的壞疽腐肉和碎屑。枯草芽孢桿菌能夠分泌多種酶，其中能夠應(yīng)用到醫(yī)藥領(lǐng)域的酶主要有絲氨酸纖溶性蛋白酶 ( 納豆激酶) 和脂肪酶兩種21。日本人日常生活中食用的納豆就是利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的，納豆中含有的納豆激酶對心血管疾病有很好的預(yù)防和治療作用。近年來，我國也掀起對納豆激酶的研究和開發(fā)熱潮，納豆激酶的藥用價值日益突出，在我國傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品豆豉中發(fā)現(xiàn)了類似納豆激酶的高活力的纖溶酶，將其產(chǎn)生菌株鑒定為枯草芽孢桿菌，并將豆豉纖溶酶基因克隆到了畢赤酵母中

15、。同樣由枯草芽孢桿菌合成的聚谷氨酸也可用作藥物緩釋材料和醫(yī)用高分子纖維材料等 。隨著人們對枯草芽孢桿菌性質(zhì)的深入，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌具有穩(wěn)定性好、抗性強、耐高溫、耐酸堿1、抑制病原菌繁殖、 產(chǎn)生多種酶類、提高動物消化酶活性、分解有機污染物、凈化水質(zhì)等優(yōu)點，而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中；于此同時枯草芽孢桿菌又可以產(chǎn)生微生物源性抗菌蛋白2；從而國外研究者掀起對拮抗菌株的篩選、鑒定以及其抗菌物質(zhì)理化特點等方面進(jìn)展了大量研究工作的熱潮，雖然在實際的應(yīng)用中，大多停留在實驗室等機構(gòu)試驗階段，但它所展現(xiàn)的應(yīng)用前景卻十分廣闊?？莶菅挎邨U菌在培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)條件掌握不好，常出現(xiàn)活菌數(shù)量低、芽孢形成率低等問題，所以

16、本課題嘗試通過改變BPG培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件來提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)量，期望解決在現(xiàn)階段的工業(yè)化生產(chǎn)中存在著的菌數(shù)量低、本錢高的問題。本課題是針對菌株適宜培養(yǎng)基的發(fā)酵條件進(jìn)展研究。針對發(fā)酵液培養(yǎng)基中不同溫度、pH、菌種接種量、時間分別進(jìn)展單因素水平的試驗，確定三個較好的水平，在進(jìn)展四因素三水平正交試驗以確定枯草芽孢桿菌的最正確條件。對此我們對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)展優(yōu)化試驗，以提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)量并降低生產(chǎn)本錢。研究的目的是通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件，提高芽孢桿菌菌株發(fā)酵液的含菌量，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定根底，有助于降低生產(chǎn)本錢。2 材料與方法2.1 實驗試劑與材料2.2.1材料枯草芽孢桿菌師大學(xué)微生物實

17、驗室提供2.2.2實驗試劑 牛肉膏；蛋白胨；葡萄糖；可溶性淀粉；氯化鈉；磷酸氫二鉀；硫酸錳；瓊脂；去離子水2.2主要儀器與設(shè)備 超凈工作臺；滅菌鍋；培養(yǎng)皿假設(shè)干；電子天平；250ml錐形瓶假設(shè)干；玻璃棒；酒精燈；試管；移液管；移液槍；分光光度計2.3 試驗方法2.3 實驗過程 曲線制備 單因素測定 正交試驗培養(yǎng)基及根底條件確定培養(yǎng)基 BPG培養(yǎng)基22：牛肉膏3.3、蛋白胨3.3、葡萄糖3.3、淀粉3.3、Nacl 3.3、KH2PO4 3.3、MnSO47H2O 0.2，加純化水定容至1 000ml，調(diào)PH值為7.0初始培養(yǎng)條件：接種量：5-10%；pH：7.0-7.2；溫度：30-35；時間

18、：16-20 h。2.3.2 比濁法測定細(xì)菌濃度比濁法原理是在一定圍，菌懸液中細(xì)胞的濃度與混濁度成正比，即與光密成正比，菌越多，光密度越大。因此用分光光度計在一定波長420nm下，測定菌懸液的以光密度即OD值表示菌量?？莶菅挎邨U菌標(biāo)準(zhǔn)生長曲線確實定在BPG液體培養(yǎng)基上接種枯草芽孢桿菌原菌液，按優(yōu)化條件培養(yǎng)，并每隔3h取樣測定OD值和平板菌落計菌數(shù)。3 結(jié)果與分析3.1 枯草芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)生長曲線在確定的培養(yǎng)基的根底上，每隔3小時取樣測定OD值，并且通過平板菌落計菌數(shù)如下表一。時間h03691215182124OD0.0080.0340.0850.1120.1530.2110.2780.2460

19、.245活菌數(shù)(107CFU/ml)0.100.501.301.802.603.103.603.303.10OD值與活菌數(shù)的關(guān)系如下列圖1。從圖1可以看出OD值與活菌數(shù)呈現(xiàn)的關(guān)系，得到的關(guān)系式Y(jié)=1.3108*+1.6106 R2=0.9706。在OD值在小于0.278時OD值和活菌數(shù)呈現(xiàn)線性的關(guān)系。3.2單因素試驗結(jié)果 桿菌外在確定BPG液體培養(yǎng)基的根本組成成分0.34g牛肉膏、0.34g蛋白胨、0.34g葡萄糖、0.33g磷酸二氫鉀、0.33g氯化鈉、0.33g淀粉、0.02g硫酸錳、pH7.0、100ml水的前提下，通過四個單因素實驗確定葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氫鉀的最適含量。實驗

20、結(jié)果如下。溫度對枯草芽孢桿菌生長量的影響本實驗選取25、30、35、40、45 5個溫度為培養(yǎng)溫度的變化來研究溫度對枯草芽孢桿菌的生長量的影響。培養(yǎng)基的接種量為5%、初始pH 7.0，培養(yǎng)18 h，的其他因素的變量不變的條件下，測定OD420值，根據(jù)最大生長量，選出最適溫度。實驗結(jié)果如表二及圖2。表二 不同溫度對枯草芽孢桿菌的OD420值影響 溫度 OD420值2530354045A10.2010.2400.2700.2190.199A20.2030.2410.2710.2210.199A30.2050.2420.2720.2230.199平均值0.2030.2410.2710.2210.19

21、9 圖2溫度對枯草芽孢桿菌生長量的影響圖2顯示，當(dāng)溫度的變化分別為25、30 、35 、40 以及45時，到的活菌數(shù)107CFU/ml分別為2.799、3.293 、3.683、 3.033以及2.747。所以有圖2分析可知，起初隨著溫度的升高，活菌數(shù)目會增加，當(dāng)溫度為35時，枯草芽孢桿菌的數(shù)量到達(dá)最多；隨后繼續(xù)升高溫度，反而枯草芽孢桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢。由于溫度對微生物生長的影響是影響在生物體所進(jìn)展的許多生化反響，到達(dá)影響微生物的生長。在一定溫度圍，生化反響速率隨溫度上升而加快；超過一定限度，則細(xì)胞功能下降以至死亡。故此溫度的選擇為35 適宜。 pH值對枯草芽孢桿菌生長量的影響 本實驗選取

22、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 5個PH為培養(yǎng)時PH的變化來研究PH對枯草芽孢桿菌的生長量的影響。培養(yǎng)基的接種量為5%、初始溫度35，培養(yǎng)18 h，的其他因素的變量不變的條件下，測定OD420值，根據(jù)最大生長量，選出最適PH。實驗結(jié)果見表三及圖3。表三不同pH對枯草芽孢桿菌的OD420值影響pH值 OD420值5.06.07.08.09.0A10.1790.2130.2550.2010.178A20.1780.2130.2560.2020.176A30.1770.2130.2570.2000.177平均值0.1780.2130.2560.2010.177 圖3PH對枯草芽孢桿菌生長量的

23、影響 從圖3顯示，當(dāng)PH變化分別為5、6、7、8以及9時，得到的活菌數(shù)為：107CFU/ml分別為2.474、2.929、3.488、2.773以及2.461。所以從圖3直觀分析可知：開場隨著PH的增加，活菌數(shù)量呈現(xiàn)增加，當(dāng)PH為7.0時枯草芽孢桿菌的數(shù)量到達(dá)最多；隨后繼續(xù)PH增加，反而枯草芽孢桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢。由于不同微生物對pH條件的要求各不一樣它們只能在一定的pH圍生長，對pH條件的不同要求在一定程度上反映出微生物對環(huán)境的適應(yīng)能力。本實驗的枯草芽孢桿菌在PH6到PH8之間的生長時的活菌數(shù)相對變化差距不大，從而可知在中性環(huán)境下相對適合枯草芽孢桿菌的生長；在PH9下的活菌數(shù)相比擬少，可

24、知在過酸和過堿的環(huán)境相對不適應(yīng)枯草芽孢桿菌的生長，故此最適PH為7.0。3.2.3 接種量對枯草芽孢桿菌生長量的影響本實驗選取1%、3%、5%、7%、9% 5個接種量為培養(yǎng)時接種量的變化來研究接種量對枯草芽孢桿菌的生長量的影響。培養(yǎng)基的初始PH為7.0、初始溫度35，培養(yǎng)18 h，的其他因素的變量不變的條件下，測定OD420值，根據(jù)最大生長量，選出最適PH。實驗結(jié)果如表四及圖4。表四不同接種量對枯草芽孢桿菌的OD420值影響 接種量 OD420值 1% 3% 5% 7%9%A10.1440.1770.2340.2100.188A20.1450.1780.2340.2120.189A30.146

25、0.1790.2340.2110.190平均值0.1450.1780.2340.2110.189圖4接種量對枯草芽孢桿菌生長量的影響 從圖4顯示，當(dāng)接種量變化分別為1%、3%、5%、7%以及9%時，得到的活菌數(shù)為107CFU/ml：2.045、2.474、3.202、2.903以及2.617。所以從圖4直觀分析可知：接種量從1%到5%之間增加接種量，活菌數(shù)隨著接種量的增加而增多，當(dāng)接種量5%活菌數(shù)到達(dá)最多；大于5%時隨著接種量的增加反而活菌數(shù)減少，反到不利于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌。應(yīng)選擇最正確的接種量為5%。時間對枯草芽孢桿菌生長量的影響本實驗選取14h、16h、18h、20h、22h 5個時間為培

26、養(yǎng)時時間的變化來研究時間對枯草芽孢桿菌的生長量的影響。培養(yǎng)基的初始PH為7.0、初始溫度35，接種量為5%，的其他因素的變量不變的條件下，測定OD420值，根據(jù)最大生長量，選出最適PH。實驗結(jié)果如表五及圖5。表五不同培養(yǎng)時間對枯草芽孢桿菌的OD420值影響 時間 OD420值 14h16h18h20h22hA10.1610.2200.2760.2750.245A20.1610.2210.2770.2750.246A30.1610.2220.2780.2750.247平均值0.1610.2210.2770.2750.246圖5時間對枯草芽孢桿菌生長量的影響圖5顯示，當(dāng)時間的變化分別為14h、16

27、h 、18h、20h以及22h時，到的活菌數(shù)107CFU/ml分別為2.253、3.033 、3.761、 3.735以及3.258。所以有圖5分析可知，起初隨著時間的推移，活菌數(shù)目會增加，當(dāng)時間為18h時，枯草芽孢桿菌的數(shù)量到達(dá)最多；隨后繼續(xù)增加培養(yǎng)時間，反而枯草芽孢桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢。由于時間主要影響枯草芽孢桿菌的生長周期，培養(yǎng)的時間過長反而使得其處于衰退期不利于枯草芽孢桿菌的生長，影響它的數(shù)量。故時間的選擇為18h適宜。3.3正交試驗結(jié)果分析 參照單因素實驗結(jié)果，確定了BPG培養(yǎng)基牛肉膏3.3、蛋白胨3.3、葡萄糖3.3、淀粉3.3、Nacl3.3、KH2PO4 3.3、MnSO47

28、H2O 0.2、水1000ml以影響枯草芽孢桿菌的生長條件PH、溫度、時間、接種量為四個影響因素，取各自的三個不同水平進(jìn)展正交試驗，因素水平表見表表3.3正交試驗設(shè)計直觀分析表序列號因素活菌數(shù)107CFU/mlA溫度BpHC接種量濃度D時間(h)11301613%1(16)2.643212725%2(18)3.566313837%3(20)2.26642351233.163522312.916623122.59173401322.162832133.162933212.747K18.4757.9688.3968.306K28.6709.6449.4768.319K38.0717.6047.34

29、48.591R0.1990.6800.7110.095最優(yōu)組合A2B2C2D3由表數(shù)據(jù)可知，因素主次關(guān)系為C(接種量濃度) B(PH) A(溫度) D時間。通過實驗結(jié)果的直觀分析，2號組合A1B2C2D2的菌體含量最高；但是經(jīng)過計算分析的最優(yōu)水平為A2B2C2D3。所以為了確定最優(yōu)水平組合，分別按照這兩個水平組合的培養(yǎng)基配方，配制BPG液體培養(yǎng)基下培養(yǎng)，測定其OD420值，根據(jù)生長量，確定最優(yōu)水平。實驗結(jié)果如表六。 表六 組合活菌數(shù)107CFU/ml 直觀最優(yōu)組合 A1B2C2D2分析的最優(yōu)組合A2B2C2D3A13.5603.768A23.5623.766A33.5613.777平均值3.5

30、613.777 從表六看出直觀的最優(yōu)組合A1B2C2D2與分析得到最優(yōu)組合A2B2C2D3比擬，在直觀的最優(yōu)組合A1B2C2D2下活菌數(shù)量為3.561107CFU/ml，但是分析得到最優(yōu)組合A2B2C2D3下得到的活菌數(shù)量為3.777107CFU/ml。再由表3.3分析可知，因素主次關(guān)系為C(接種量濃度) B(PH) A(溫度) D時間，所以分析的得到的最優(yōu)組合A2B2C2D3較好。即在溫度為35，接種量為5%，PH為7.0培養(yǎng)時間為20h。在這條件下培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌數(shù)量最多。4結(jié)論和討論本文針對的是枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究 ，在培養(yǎng)基BPG的根底上優(yōu)化培養(yǎng)條件PH，時間，溫度，接種量

31、濃度四個因素，再進(jìn)展L934正交試驗確定枯草芽孢桿菌的最正確培養(yǎng)條件。最終確定在保證其他因素不變的情況下枯草孢桿菌在BPG培養(yǎng)基在接種量為5%，PH為7.0，溫度為35攝氏度，時間為20h的時候適合枯草芽孢桿菌的生長，在此培養(yǎng)條件下得到的活菌液量為3.785107CFU/ml，相比在LB培養(yǎng)基下培養(yǎng)時的菌液量3.2106CFU/ml提高了10倍左右，進(jìn)一步提高的枯草芽孢桿菌的產(chǎn)量。在本次實驗過程中，有以下幾點心得體會1本文在優(yōu)化培養(yǎng)條件時，得到接種量濃度為最主要的因素，相對而言時間為次要的因素。接種量濃度對于枯草芽孢桿菌的生長影響較大，從而工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)時候需要注意接種量的濃度。培養(yǎng)的時間從

32、圖4可以看出18h到20h之間活菌數(shù)相對穩(wěn)定，如果需要得到是枯草芽孢桿菌的菌體或者產(chǎn)物時，需要控制發(fā)酵時間在18h到20h之間有利于菌體和產(chǎn)物的積累。2本文是枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件的優(yōu)化，在培養(yǎng)基BPG的根底上優(yōu)化培養(yǎng)條件PH，時間，溫度，接種量濃度四個因素，再進(jìn)展L934正交試驗確定枯草芽孢桿菌的最正確培養(yǎng)條件得到的活菌量為3.785107CFU/ml，但是唐家毅23等在一株水產(chǎn)芽孢桿菌的鑒定及其培養(yǎng)基優(yōu)化的研究得到的最正確細(xì)胞濃度為8.42109CFU/ml，相比對于培養(yǎng)條件對于枯草芽孢桿菌的影響，沒有培養(yǎng)基對枯草芽孢桿菌的影響明顯。3相對與普通培養(yǎng)基得到的活菌量3.2106CFU/ml，

33、本實驗優(yōu)化得到的活菌量3.785107CFU/ml還有有明顯的提高10倍，所以本文枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件的優(yōu)化對于工業(yè)化大規(guī)模的培養(yǎng)枯草芽孢桿菌還是能夠提供一些依據(jù)。4由于條件的因素本實驗操作相對簡單，各因素水平的跨度相對較大，如溫度的變化梯度為5，時間的變化梯度2h，接種量變化跨度為2%，PH的變化梯度為1。對于以后的實驗可以繼續(xù)縮小這變化的跨度，來進(jìn)一步研究枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化。5參考文獻(xiàn)1惠明,竇麗娜,田青等.枯草芽孢桿菌的應(yīng)用研究進(jìn)展J.農(nóng)業(yè)科2008,36(27)11623-11624.2尚智,胡勇有.枯草芽孢桿菌對微污染水體的凈化作用J.環(huán)境科學(xué)報,2011(8):1594-

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