生物技術(shù)常用技術(shù)技術(shù)以及應(yīng)用

1、關(guān)于生物技術(shù)常用技術(shù)技術(shù)及應(yīng)用第一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、PCR的用途體外擴增特異DNA片段的技術(shù)，能快速、特異地擴增目的DNA片段。能通過試管內(nèi)的數(shù)小時反應(yīng)將特定的DNA 片段擴增數(shù)百萬倍。迅速獲取大量的單一核酸片段，為分子生 物學(xué)研究提供了強大的工具。第二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月1953年，Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模型。1958年，Meselson和Stahl用實驗證實DNA半保留復(fù)制模型。70年代以來，人們采用兩種思路去嘗試建立基因的無性繁殖體系，一是基因克隆技術(shù)，二是體外擴增技術(shù)。二、發(fā)展歷程第三張，PPT共一

2、百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月1971年，Khorana（美國MIT教授，1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎得主）：“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。”核酸體外擴增最早設(shè)想被遺忘原因:（1）很難進(jìn)行測序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年Smith等發(fā)現(xiàn)了II型限制性內(nèi)切酶，體外克隆基因已成為可能。第四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月1976年，臺籍科學(xué)家錢嘉韻（Alice Chien）從黃石國家公園的嗜熱菌Thermus aquaticus中分離出熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶。1985年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的Mull

3、is發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），Saiki等首次應(yīng)用PCR法成功地擴增了人-珠蛋白的DNA，并應(yīng)用于鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前診斷。第五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月1988年Saiki開始將耐熱性Taq DNA聚合酶應(yīng)用于PCR，整個反應(yīng)只加一次酶即可，擴增特異性和效率都明顯改善，操作大為簡化。1989年被譽為“分子年”，列PCR為十余項發(fā)明之首。1993年，Mullis榮獲諾貝爾化學(xué)獎。 Kary Mullis 1993第六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、PCR的基本原理試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，依據(jù)DNA半保

4、留復(fù)制的機理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì)；通過人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度，使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。第七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月待擴增片段第八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月高溫變性第十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月低溫退火第十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月中溫延伸第十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第十四張，PPT共一百零八頁，

5、創(chuàng)作于2022年6月第十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR每一步的轉(zhuǎn)換通過溫度的改變控制。DNA模板解鏈（變性）、引物與模板結(jié)合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三個步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個循環(huán)。此循環(huán)反復(fù)進(jìn)行，可使目的DNA得以迅速擴增。第二十二張，PPT共一百

6、零八頁，創(chuàng)作于2022年6月理論擴增率：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），2530循環(huán)，目標(biāo)DNA可增加109倍。實際擴增率：()n，X為PCR的實際擴增率，平均約為75%。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實際上進(jìn)行30個循環(huán)后，擴增倍數(shù)一般可達(dá)106107。以上“變性、退火、延伸”三部曲為PCR一輪循環(huán)。第二十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR擴增曲線第二十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月必須的儀器設(shè)備第二十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月四、PCR 反應(yīng)體系與流程反應(yīng)體系模板（DNA或RNA）引

7、物Taq DNA聚合酶10PCR緩沖液1.54 mM Mg2+0.2 mM dNTP反應(yīng)流程預(yù)變性變性退火延伸延伸完全終止2535循環(huán)第二十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）PCR 的反應(yīng)體系引物（primer）酶 （Taq DNA polymerase） dNTP模板 （template） Mg2+ （magnesium）第二十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月1、引物引物：決定PCR反應(yīng)的特異性PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，用 PCR就可將模板DNA在體外大量擴增

8、第二十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月基本原則是最大限度地提高擴增效率和特異性，同時盡可能抑制非特異性擴增。引物設(shè)計的原則第二十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月引物長度： 15-30bp，常用20bp左右 引物的有效長度不能大于 38 bp，否則最適 延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度 （74），不能保證PCR擴增產(chǎn)物的特異性引物擴增跨度：以500bp為宜 特定條件下可擴增長至10kb的片段第三十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月引物堿基：G+C含量以40-60%為宜 G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶 ATGC最好隨機分布，避免

9、5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3端不應(yīng)超過3 個連續(xù)的G或C，因為這樣會使引物在G+C富集區(qū) 引發(fā)錯誤延伸避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)和引物間互補 特別避免 3端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴增條帶 第三十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月引物 3端的堿基要求嚴(yán)格配對（不能做任何修飾） 特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端 堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗引物5端可修飾 引物5端限定著PCR產(chǎn)物的長度，但對擴增特 異性影響不大；引物5端堿基可不與模板DNA 互補而呈游離狀態(tài)；引物5端最多可加10個堿 基而對P

10、CR反應(yīng)無影響 第三十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月3535限制性內(nèi)切酶的識別序列啟動子序列定點突變探針標(biāo)記第三十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月引物的特異性： 引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性引物量： 每條引物的濃度0.1 0.5M，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會第三十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月2、酶及其濃度目前有兩種 Taq DNA 聚合酶供應(yīng)天然酶：從水生嗜熱桿菌中提純基因工程酶：大腸桿菌合成一個典型的 PCR反應(yīng)約需酶量1- 2.5U/100 ul體系濃

11、度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少第三十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA聚合酶 Klenow片段 T4 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶（應(yīng)用最廣） 其他DNA聚合酶：Tth DNA聚合酶 Vent DNA聚合酶 Pfu DNA聚合酶等第三十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月Taq 酶的保真性不高53聚合酶活性和53外切酶活性，無35外切活性;在PCR反應(yīng)中如發(fā)生某些堿基的錯配，該酶是沒有校正功能的。保真性不如Pfu DNA聚合酶等。第三十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月3、dNTP 的質(zhì)量與濃度在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為502

12、00M，濃度過低會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制 ）,如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配高濃度的dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性 第三十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月4、模板DNA模板DNA的來源： 微生物中提取DNA 從細(xì)胞中提取DNA：血細(xì)胞、絨毛、尿樣、毛 發(fā)、精斑、口腔上皮細(xì)胞 固定和包埋的組織標(biāo)本：脫蠟、蛋白酶K消化模板DNA的濃度： 0.12ug/100ul體系 PCR產(chǎn)量隨模板DNA濃度的增加而顯著升高 模板DNA濃度過高導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加第四十張，PPT共一百零

13、八頁，創(chuàng)作于2022年6月5、Mg2+濃度Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般的 PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.52.0 mmol/L為宜Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增， 濃度過低會降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少第四十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月PCRAgarose gel electrophoresis產(chǎn)物分析UV 檢測3-4 hours（二）、PCR 的反應(yīng)流程第四十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月溫度與時間的設(shè)置循環(huán)次數(shù)常見問題第四十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作

14、于2022年6月1、溫度與時間的設(shè)置設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至4060退火，然后快速升溫至7075延伸，對于較短靶基因（長度100300bp）可采用二溫度點法， 將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸。第四十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 變性溫度與時間：一般9394，1min足以使模板變性若低于93則需延長時間但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。第四十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的重要因素退火溫度與時間，取

15、決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基因序列的長度對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55作為選擇最適退火溫度的起點較為理想第四十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月引物的復(fù)性溫度通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm（解鏈溫度）4(G+C)+2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值（510）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時間一般為3060s，足以使引物與模板之間完全結(jié)合第四十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性： 7080 150核苷酸/S/酶分子 70

16、 60核苷酸/S/酶分子 55 24核苷酸/S/酶分子 高于90時，DNA合成幾乎不能進(jìn)行第四十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 延伸溫度與時間：延伸溫度：一般選擇在7075之間常用溫度為72過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時間：根據(jù)待擴增片段長度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min（足夠） 34kb的靶序列需34min擴增10kb需延伸至15min延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴增對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些第四十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月2、循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數(shù)：選在3040

17、次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多第五十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月如何提高PCR中的DNA聚合酶的保真性？在PCR反應(yīng)體系中，除使用Taq DNA聚合酶，摻入少量的具有35外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，如Pfu，Vent，Pwo等，錯配率可降為原來的 1/10；Mg2+濃度盡可能低，但不影響DNA合成；減少高溫反應(yīng)時間，這樣DNA熱損傷將減少；減少循環(huán)數(shù)。第五十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月如何提高PCR擴增的特異性？升高退火溫度可增加引物與模板結(jié)合的特異性；縮短退火和延伸時間，可減少錯誤引發(fā)及多余的DNA聚合酶分子參與酶促延伸的機會；降低引物和酶

18、的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是能減少引物二聚體的引發(fā)；改變Mg2+的濃度可進(jìn)一步提高擴增的特異性。第五十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月引物設(shè)計的特異性；減少循環(huán)次數(shù)；熱啟動（Hot Start）。即首先將模板變性，然后在較高溫度時加入Taq DNA聚合酶、引物及MgCl2等一些重要成分，這樣使得引物在較高溫度下與模板退火，提高了反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性，使擴增更特異；采用二對引物即外引物和內(nèi)引物進(jìn)行擴增來提高擴增的特異性。第五十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）、 PCR 擴增產(chǎn)物的檢測方法 凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳法 、聚丙烯酰胺凝膠電泳法 PCR-限制性片段長度多態(tài)

19、性分析法（PCR-RFLP） 單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-SSCP）核酸探針雜交法 PCR產(chǎn)物測序 PCR-OLA（PCR-oligonucleotide ligation assay)熒光PCR 第五十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.瓊脂糖凝膠電泳 制膠加樣電泳紫外光檢測第五十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月特點：分辨力高，長度僅相差1bp的DNA分子即可分開；上樣量遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠；回收的DNA純度高；采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱點。用途：PCR擴增指紋圖、多重PCR、PCR產(chǎn)物限制性片

20、段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析。2.聚丙烯酰胺凝膠電泳第五十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) 據(jù)目的基因序列可查出所包含的酶切位點，用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶消化PCR擴增產(chǎn)物，然后進(jìn)行電泳，觀察消化片段的大小是否與序列資料相符。用途：傳染病病原體基因分型人類基因的變異性研究。第五十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism, PCR-SSCP） 將PCR

21、 產(chǎn)物雙鏈DNA（dsDNA）變性為單鏈DNA （ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，由于DNA 分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，而空間結(jié)構(gòu)又與ssDNA序列有關(guān)。因此，電泳結(jié)束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產(chǎn)物序列的差異。第五十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月5.核酸探針雜交法點雜交反向點雜交微孔板雜交Southern印跡雜交第五十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月點雜交（dot blot）原理：將擴增產(chǎn)物變性后直接點在尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的寡核苷酸探針與之雜交。探針：放射性同位素標(biāo)記探針檢

22、測的敏感、特異，具有不穩(wěn)定性和放射性危害。非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛、熒光素等）標(biāo)記的探針穩(wěn)定性高、使用安全、檢測速度快用途：主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。第六十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月反向點雜交(reverse dot blot)原理：使用帶有標(biāo)記物的引物進(jìn)行PCR擴增，然后將擴增產(chǎn)物變性。將不同的寡核酸探針固定在尼龍膜上，用變性的PCR產(chǎn)物與之雜交。探針：嚴(yán)格設(shè)計，具有相同的雜交反應(yīng)條件。用途：反向點雜交特別適用于遺傳性疾病多個位點的點突變分析。結(jié)果分析：正常純合子突變純合子雜合子第六十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月微孔板雜交( micro

23、plate hybridization) 夾心雜交第六十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 熒光探針雜交法目前臨床上常用熒光探針法來檢測PCR產(chǎn)物，主要的方法有TaqMan技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)、復(fù)合探針法等。（定量PCR詳述）。第六十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月Southern印跡雜交(Southern blot) 第六十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月6. PCR-ELISA引物雙標(biāo)記：生物素/地高辛、熒光素引物5端標(biāo)記生物素+RNA探針標(biāo)記地高辛將一寡核酸探針固定于微孔板作為捕獲探針，變性的PCR產(chǎn)物單鏈的某一區(qū)域與之雜交后，此單鏈間接地固定于微孔

24、板上。再用一非放射性標(biāo)記物標(biāo)記（如生物素）的檢測探針與固定于微孔板的PCR產(chǎn)物單鏈的另一區(qū)域雜交。第六十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月7. PCR產(chǎn)物測序 方法：雙脫氧核苷酸鏈末端終止法化學(xué)裂解法用途：目前一般多用于科研第六十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月五、 PCR常見問題 無擴增產(chǎn)物 非特異性擴增 拖尾 假陽性第六十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR常見問題之一無擴增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設(shè)計不當(dāng)或者發(fā)生降解反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時間太短 原因?qū)Σ呒兓０寤蛘呤褂迷噭┖刑崛∧０錎NA或加大模板的用量更

25、換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間現(xiàn)象：正對照(marker?)有條帶，而樣品則無；第六十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR常見問題之二 非特異性擴增 現(xiàn)象：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。第六十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR常見問題之二引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多 原因?qū)Σ咧匦略O(shè)計引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或

26、使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù) 非特異性擴增第七十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR常見問題之三 拖尾(與非特異性擴增條帶明顯不同，非特異性擴增帶有明顯的條帶分隔。) 現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。 M 1 2第七十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR常見問題之三模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多 原因?qū)Σ呒兓０甯鼡QBuffer適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù) 拖尾第七十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR常見問題之四 假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達(dá)情況)

27、 原因：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染打開標(biāo)本管蓋時樣品飛濺，造成樣品間相互污染。使用帶有污染的試劑。公用試劑如液體石蠟等污染。操作時手套引起的交叉污染。加樣器通道易形成氣溶膠，氣溶膠常帶有PCR產(chǎn)物污染，可用有濾篩的吸頭避免此類污染。實驗室污染。 現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物第七十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 對策：PCR前后工序分室操作，試劑器材分室存放低溫貯存。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，凡耐高溫的試劑器材均高壓滅菌。Tip頭、Eppendorf管等最好一次性使用。操作人員必須戴手套進(jìn)行操作。試劑小量分裝保存，用前先離心，操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心

28、管外防止開蓋時液體濺出。第七十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月引物二聚體 兩個相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對，特別是引物3端有互補區(qū)。引物模板比例太高，可增加模板用量。退火溫度過低。熱循環(huán)次數(shù)過多。PCR常見問題之五第七十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月9.7 PCR技術(shù)的發(fā)展 巢式PCR（nested PCR ） 逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 多重PCR(multiplex PCR) 重組PCR(recombinant PCR) 錨定PCR（anchored PCR, A-PCR） 不對稱PCR（as

29、ymmetric PCR） 反向PCR（inverse PCR） 擴增長片段PCR（long PCR，long-distance PCR） 免疫PCR(immuno-PCR) 定量PCR 六、PCR技術(shù)的主要類型第七十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）巢式PCR（nested PCR）第七十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR（reverse transcription-PCR）原理：先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下、以mRNA為模板合成互補的cDNA（complementary DNA），再以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。是一種快速、簡便、敏感性極高的

30、檢測mRNA表達(dá)的方法。第七十八張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月逆轉(zhuǎn)錄酶：AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為42）和MoMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為37）逆轉(zhuǎn)錄引物：隨機引物；Oligo(dT)；特異性引物。one-step RT-PCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、Taq DNA聚合酶、PCR引物、dNTP和緩沖液，直接以mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，稱為一步法RT-PCR。第七十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）多重PCR(multiplex PCR) 第八十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（4） 重組PCR(recombinant PCR

31、) 第八十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（5） 錨定PCR（anchored PCR, A-PCR） 基本原理：抽提細(xì)胞總RNA或mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA 3端加上poly(dG)尾。據(jù)此設(shè)計錨定引物poly(dC)，為提高擴增特異性，poly(dC)在十二聚以上，錨定引物5端可加上某些限制性內(nèi)切酶識別序列或其它序列信息。根據(jù)已知的3端序列設(shè)計基因特異性引物，與錨定引物一起進(jìn)行PCR擴增。用途：檢測T細(xì)胞受體和免疫球蛋白基因的多態(tài)性。第八十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（6）不對稱PCR（asymmetric PCR

32、） 基本原理：采用兩條不同濃度的引物，即非限制引物(高濃度引物)與限制性引物(低濃度引物)，二者之比為50-100：1。在PCR最初10-15個循環(huán)中，擴增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA(dsDNA)；第15個循環(huán)以后，限制性引物已被耗盡，非限制性引物介導(dǎo)的PCR就會產(chǎn)生大量的單鏈DNA(ssDNA)。關(guān)鍵：控制限制性引物的絕對量，需多次摸索優(yōu)化兩條引物的比例。也有人先用等濃度的引物PCR擴增，制備雙鏈DNA；然后以雙鏈DNA為模板，再以其中的一條引物進(jìn)行第二次PCR，制備單鏈DNA。 第八十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（7）反向PCR（reverse PCR） 反向PCR用于快速擴增

33、已知序列以外的未知DNA片段，從而對未知序進(jìn)行分析研究。該法首先用已知序列和待擴增序列都沒有切點的限制性核酸內(nèi)切酶將模板DNA消化，再用連接酶使酶切產(chǎn)物環(huán)化，使已知的和待擴增的未知序列都包含在環(huán)中。在已知序列內(nèi)設(shè)計一對反向的引物，即可擴增已知序列以外的區(qū)域。第八十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月反向PCR已知序列PCR用途：未知序列的研究限制酶切點（X）限制酶切點（X）限制酶X酶切連接未知序列第八十五張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（8）擴增長片段PCR（long PCR）模板完整性：應(yīng)用瓊脂糖包埋細(xì)胞抽提法模板DNA 。引物：一般較長（22-35nt），Tm值較大。

34、DNA聚合酶：長片段PCR應(yīng)采用錯配率低的耐熱DNA聚合酶：如Ampli Taq、rTth、Hot Tube、Vent、Deen Vent、Pfu、rTma等。Vent、Deen Vent、Pfu、rTma等聚合酶有3-5外切酶活性。PCR緩沖液：增加Tris的濃度或改用Tricine緩沖液以增強緩沖能力，并使緩沖液pH適度升高，以補償升溫時pH值的降低。此外，加入適量的甘油、DMSO（二甲亞砜）、明膠、聚乙二醇、Tween 20等物質(zhì)，有助于模板變性和維持DNA聚合酶的穩(wěn)定。熱循環(huán)：增加延伸時間（一般1kb/min），提高退火溫度，同時采用熱啟動。熱循環(huán)后期，更應(yīng)適當(dāng)增加延伸時間，以保證產(chǎn)物

35、充分延伸。第八十六張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（9）免疫PCR(immuno-PCR)第八十七張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（10）原位PCR（in situ PCR ） 直接法：使用標(biāo)記（放射性同位素、生物素、地高辛、熒光素等）的引物或脫氧三磷酸核苷酸（如dUTP）進(jìn)行PCR擴增，則標(biāo)記物摻入到PCR 產(chǎn)物中。最后用放射自顯影、免疫組化或熒光法檢測 PCR 產(chǎn)物及其在細(xì)胞內(nèi)位置。間接法：先進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA的原位擴增，然后用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行原位雜交。原位逆轉(zhuǎn)錄PCR（in situ reverse transciption PCR）第八十八張，PPT共一百零八頁

36、，創(chuàng)作于2022年6月第八十九張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（11）定量RT-PCR（qRT-PCR）：利用RT-PCR對mRNA水平進(jìn)行半定量或絕對定量分析。第九十張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月半定量RT-PCR選用在組織中普遍表達(dá)、表達(dá)量比較恒定的管家基因mRNA作為內(nèi)源性基因模板標(biāo)準(zhǔn)。管家基因mRNA和目的mRNA混合物共同進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在各自的引物引導(dǎo)下擴增。計算出擴增后目的基因擴增子/管家基因擴增子的比值，從而達(dá)到半定量的目的。第九十一張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月 實時熒光定量PCR常規(guī)定量PCR技術(shù)： 對PCR擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量 重復(fù)性差 半定量實時定量PCR技術(shù)： 對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量 第九十二張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月實時熒光定量PCR原理在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。第九十三張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）Ct 值是熒光定量PCR的一個重要的概念，C代表Cycle，t代表threshold域值。含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 第九十四張，PPT共一百零八頁，創(chuàng)作于