微生物操作培訓(xùn)大綱

1、精品資料可編輯修改精品資料可編輯修改微生物檢驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)大綱.玻璃器皿準(zhǔn)備（ 1 ）玻璃器皿的清洗新購(gòu)進(jìn)玻璃器皿處理新構(gòu)進(jìn)的玻璃器皿，均含有游離堿，故應(yīng)先浸于洗液或20ml/L 鹽酸內(nèi)數(shù)小時(shí)，再用自來(lái)水沖洗干凈。待干燥后，滅菌備用。日常清洗注意事項(xiàng)一切使用過(guò)得玻璃器皿，用完后先用清水沖洗干凈，然后用熱的肥皂水洗刷清潔，再用清水沖數(shù)次，蒸餾水沖洗兩次，自然風(fēng)干，備用。如果肥皂水洗刷仍未清潔，可用洗液浸泡，洗出后用清水沖洗5 次以上，再用蒸餾水沖洗兩次。吸管用完后應(yīng)立即用清水和蒸餾水沖洗干凈即可，如附有污物可用洗液浸泡。附有油污的器皿，若用熱的肥皂水不能洗凈時(shí)，切不可用洗液浸泡，而應(yīng)先用熱的酒精、汽

2、油或丙醇洗滌;或用氫氧化鈉熱溶液2（）浸泡10-15 分鐘，然后再用稀鹽酸洗一次，用水沖洗數(shù)次。油污如仍未出去，再重復(fù)以上手續(xù)一次。洗液的配制和使用：在 35ml 重鉻酸鉀飽和液（重鉻酸鉀180g 溶于 100ml 水中，或63g 重鉻酸鉀溶于 35g 水中），慢慢加入粗制濃硫酸1000ml 玻璃器皿一般在這種洗液中浸泡 2h 以上即可除污。如將其加熱至80-100 （但不可加熱至發(fā)煙或煮沸，此時(shí)溫度達(dá)240-250 ），浸泡10-15 分鐘，效力更大。溶解 80g 重鉻酸鉀于1000ml 溫水中，待涼后，徐徐加入粗制濃硫酸100ml于水中即成含硫酸10 的清洗液，使用時(shí)，將玻璃器皿先浸于這種

3、洗液中24h ，然后清水和蒸餾水沖洗。溶 60g 重鉻酸鉀于300ml 熱水中，慢慢加入粗制濃硫酸460ml ，邊加邊用玻璃棒攪拌，因?yàn)榇艘寒a(chǎn)生大量熱，在配制時(shí)應(yīng)用耐熱容器，并放在水槽中以便冷卻。一般玻璃器皿在此溶液中浸泡6h 以上即可。如何判定清洗干凈既不聚成水滴，也不成股流下。（ 2 ）微生物檢測(cè)常用玻璃器皿及規(guī)格所用玻璃儀器及規(guī)格：吸管： 1ml 和 10ml ，標(biāo)有 0.1ml 刻度平皿：皿底直徑為9cm試管：15 x 150mm、18 x 180mm、20 x 200mm、酒精燈三角瓶：250ml、300ml廣口瓶：用于采樣大腸菌群：雙料：、單料、復(fù)發(fā)酵單料乳糖膽鹽發(fā)酵管：20g蛋白

4、月S、10g乳糖、5g膽鹽、1.6 %澳甲酚紫乙醇溶液0.6ml （0.04 %澳甲酚紫水溶液25ml ）、蒸儲(chǔ)水100制法：將各成分溶于1000ml水中，溶解后將PH值調(diào)至7.4分裝于18 X 180mm 試管中，115C高壓滅菌15分鐘。雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管：?jiǎn)瘟铣馄渌鞒煞旨颖叮盅b于18 x 180mm 試管中.乳糖發(fā)酵管：20g蛋白陳10g乳糖1.6 %澳甲酚紫乙醇溶液0.6ml （0.04 %澳甲酚紫水溶液25ml ）蒸儲(chǔ)水1000ml PH 值調(diào)至7.4取3ml分裝于 12 X 120mm 試管中，1150c高壓滅菌15分鐘。（3）玻璃器皿的準(zhǔn)備、包扎、高壓滅菌條件棉塞制備：用

5、普通棉花紗布做成所需大小的棉塞，高壓滅菌固定。吸管：在吸管的上端塞上一小段棉花，防止吸管中的菌液、酸液、堿液等吸入口中。塞入的棉花應(yīng)與吸管口保持 5mm左右的距離棉花全長(zhǎng)不短于10mm ,賽好棉花后用截成條的舊報(bào)紙包裝，先把吸管的尖端放在紙條的一端，45度角折疊紙條，包住尖端。以螺旋式包扎剩余的紙條折疊打 結(jié)，也可把塞好棉花的吸管放入鐵皮筒中，加蓋密封121 0c高壓滅菌15分鐘。平皿：用過(guò)的培養(yǎng)皿中有廢棄的培養(yǎng)基，為了防止雜菌傳播污染環(huán)境，也應(yīng)先經(jīng) 高壓滅菌或沸水煮沸半小時(shí)后，倒掉污物洗滌。新的培養(yǎng)皿可直接洗刷， 洗凈后用蒸儲(chǔ)水沖洗三次，培養(yǎng)皿全部向下，一個(gè)接一個(gè)壓著皿邊，然后 扣在桌子上空

6、凈水。用報(bào)紙包好或裝在鐵皮筒中，1210c15分鐘。三角瓶：洗刷干凈的三角瓶塞上塞子用截成方塊的舊報(bào)紙包好，用繩子捆住。.培養(yǎng)基選用、配制、成分作用、高壓滅菌條件（表格）檢驗(yàn)項(xiàng)目A口加工配制成分作用高壓滅菌條件菌落總數(shù)營(yíng)養(yǎng)瓊脂按說(shuō)明分裝于300ml 二角瓶中瓊脂：凝固劑1210C15 分大腸菌群乳糖膽鹽 發(fā)酵管蛋白陳：氮源 乳糖：碳源 膽鹽：抑菌劑1150C15 分伊紅美蘭 瓊脂按說(shuō)明分裝于300ml 二角瓶中伊紅美蘭：鑒 別性培養(yǎng)基1210C15 分乳糖發(fā)酵 管1150c15 分毒菌、酵 母菌孟加拉紅 瓊脂按說(shuō)明分裝氯霉素：抑制 雜菌生長(zhǎng)菌121 0C15 分嗜冷菌 (常規(guī))營(yíng)養(yǎng)瓊脂按說(shuō)明分

7、裝于300ml 二角瓶中1210C15 分嗜冷菌 (快速)酵母提取物2.5g胰蛋白陳5.0g脫脂奶粉1.0g葡錮糖1.0g瓊脂10-15g蒸儲(chǔ)水 1000mlPH 值 6.9121 0C15 分芽抱及耐 熱芽抱營(yíng)養(yǎng)瓊脂同上121 0C15 分三.高壓鍋正確使用方法及注意事項(xiàng)使用規(guī)則松開緊固螺桿，將器蓋翻開，放入消毒物后，為膽內(nèi)注水，并觀測(cè)水位至最高水位線即可，在順時(shí)針方向擰緊螺桿后，消毒器就可以接通 電源。加熱時(shí)，應(yīng)把放氣閥推向垂直放氣的位置，使冷空氣加熱由筒內(nèi)逸出。等較急的蒸汽冒出時(shí)，關(guān)閉蒸汽閥直至壓力表指針上升至消毒物所需壓力后開始記消毒滅菌時(shí)間。消毒完畢，切斷電源，開啟上邊放氣閥，待汽排

8、盡壓力表指針回到0時(shí)才能打開器蓋，開啟下面放水閥，排放膽內(nèi)熱水。對(duì)瓶裝溶液消毒完畢壓力表指針回到 0后，必須在放汽水咀打開下，等冷卻20分鐘左右，方能打開器蓋，否則溶液瓶回因突然遇冷而發(fā) 生爆炸事故。每次使用完畢應(yīng)擦干各部件，以防生銹。注意事項(xiàng)嚴(yán)禁使用不在有效期內(nèi)的或其它型號(hào)的壓力表和安全閥該儀器使用一年時(shí)必須進(jìn)行外部檢查，使用三年時(shí)，必須進(jìn)行內(nèi)外部檢查；使用六年時(shí)，必須進(jìn)行全面檢查。嚴(yán)禁在消毒器內(nèi)有壓力時(shí)打開器蓋。蓋上器蓋時(shí)應(yīng)輕旋，并在橡膠圈上涂上滑石粉，提高密封圈使用壽命。不用時(shí)消毒器應(yīng)放在通風(fēng)處。精品資料可編輯修改四.滅菌后培養(yǎng)基的存放注意事項(xiàng)最好及時(shí)用完，不宜保存過(guò)久，以免減低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)

9、值或化學(xué)變化。培養(yǎng)基在 儲(chǔ)存期間，因能吸收空氣中的二氧化碳而變?yōu)樗嵝?。五無(wú)菌室注意事項(xiàng)（人員、環(huán)境、滅菌要求）無(wú)菌室要保持清潔整齊，室內(nèi)僅存放最必須的檢驗(yàn)用品，如：酒精燈、酒精棉、火柴、鑷子、接種針、接種環(huán)、記號(hào)鉛等。室內(nèi)檢驗(yàn)用具及桌凳應(yīng)保持固定位置，不隨便移動(dòng)。每 2 3 周用2%石碳酸水溶液擦拭工作臺(tái)、門、窗、桌凳及地面，然后用2% 石碳酸水溶液噴霧消毒空氣，最后紫外燈殺菌半小時(shí)。定期檢查室內(nèi)空氣無(wú)菌狀態(tài)，進(jìn)行細(xì)菌和霉菌的檢查。無(wú)菌室殺菌前應(yīng)將所有物品置于操作之部位，然后打開紫外燈殺菌半小時(shí)，時(shí)間一到，關(guān)閉紫外燈待用。進(jìn)入無(wú)均室以前，必須于緩沖間更換消毒過(guò)的工作服、工作帽及工作鞋。操作應(yīng)嚴(yán)

10、格按照無(wú)菌操作規(guī)定進(jìn)行，操作少說(shuō)話，不喧嘩，以保持環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)。六無(wú)菌室常用消毒方式及消毒劑紫外線殺菌）紫外線燈的安裝一般懸空吊裝在接種室或培養(yǎng)室的上方，吊裝紫外燈的個(gè)數(shù)，應(yīng)根據(jù)房間的大小而定，容1-2 人操作的接種室，吊裝一個(gè)30 瓦的紫外燈就可以了。如果有的接種室或培養(yǎng)室的空間較大，則除懸空吊裝紫外燈之外，還可以在房間的不同角度，安裝紫外線燈（開關(guān)需要設(shè)置在殺菌區(qū)室外），以達(dá)到比較徹底殺菌的目的。）紫外線燈的作用一般在接種室使用之前，應(yīng)打開紫外燈，照射約20-30 分鐘，就基本上可以使室內(nèi)空氣和室壁表面上無(wú)菌。）使用紫外線應(yīng)注意的事項(xiàng)紫外線對(duì)物質(zhì)的穿透很小，對(duì)普通玻璃也不能透過(guò)，因此，紫

11、外線只能進(jìn)行空氣和室壁表面的殺菌。紫外線對(duì)人體皮膚，尤其是對(duì)人的眼睛具有殺傷力，所以，不要對(duì)著紫外線進(jìn)行操作，以免眼睛受到傷害。噴灑石炭酸）常用濃度為 50ml/L 石炭酸（酚）溶液，配制時(shí)，可先將盛石炭酸的瓶放在水浴中，使之溶解，再用吸管吸取，配制為50ml/L 的石炭酸溶液。）噴灑方式最后退出房間，關(guān)門，稍等片刻，即可使用，對(duì)于較大的房間，以背負(fù)式噴霧器較好，以利于房間死角的消毒。）注意事項(xiàng)石要接觸炭酸對(duì)于皮膚有很強(qiáng)烈的毒害作用，使用時(shí)不皮膚。噴灑石炭酸可以與紫外線殺菌結(jié)合使用，這樣可增加其殺菌效果。硫磺熏蒸）用量每立方米空間需用硫磺3-4g ，熏蒸前，須把硫磺放在金屬容器內(nèi)加熱，利用產(chǎn)生

12、的二氧化硫進(jìn)行熏蒸。熏蒸前需將地面和墻壁撒水少許，以增加滅菌效果，熏蒸完畢，房間需要密封過(guò)夜后才能使用。次方法滅菌效果比較好，但比較麻煩。熏蒸時(shí)，硫磺蒸汽刺鼻，影響操作和身體健康，應(yīng)適當(dāng)注意。二氧化硫?qū)饘倨髅笥懈g性，熏蒸前應(yīng)把金屬器皿事前搬出，以免發(fā)生腐蝕。乳酸加熱熏蒸按熏蒸空間計(jì)算，以1ml/m 3 的量，量取80% 的乳酸溶液，盛在可加熱的容器內(nèi)，用鐵架或其他加熱架支好。在酒精燈或酒精爐內(nèi)加入適量酒精（以能蒸干所有乳酸溶液為宜，不要超過(guò)太多）。確認(rèn)待處理區(qū)域內(nèi)沒有生產(chǎn)原料、包裝材料、成品及半成品，以及所有的生產(chǎn)用容器均以有效保護(hù)（蓋緊或覆蓋嚴(yán)密）。關(guān)閉所有門窗，以及空調(diào)、通風(fēng)系統(tǒng)。點(diǎn)燃

13、酒精燈或酒精爐，所有人員迅速撤離，關(guān)閉出口的門。任乳酸溶液煮沸揮發(fā)。酒精燈或酒精爐應(yīng)能在乳酸蒸發(fā)完后即自行熄滅。熏蒸后保持門窗關(guān)閉12h 以上，再進(jìn)行通風(fēng)，放出剩余有刺激性的氣體。通風(fēng)時(shí)間大約需要12h 。甲醛加熱熏蒸甲醛使用量為2-6ml/m 3，常用濃度為36%-40% 。方法步驟同乳酸加熱熏蒸甲醛氧化熏蒸）使用量：按甲醛加熱熏蒸所需的用量量取定量的甲醛溶液。按甲醛溶液用量的 1/2 稱取高錳酸鉀，置于一個(gè)非金屬容器內(nèi)。）使用方式：同乳酸加熱熏蒸法，確認(rèn)處理區(qū)域內(nèi)準(zhǔn)備完全后，把甲醛溶液到入盛有高錳酸鉀的容器內(nèi)，人員迅速撤離，關(guān)閉出口。在與高錳酸鉀作用產(chǎn)熱下，甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。熏蒸后保持門

14、窗關(guān)閉12h 以上，再進(jìn)行通風(fēng)，防出剩余有刺激性的氣體。通風(fēng)時(shí)間大約需要12h 。七超凈工作臺(tái)工作原理、注意事項(xiàng)工作原理進(jìn)風(fēng)經(jīng)過(guò)初、中效過(guò)濾器后（中效過(guò)濾器金屬框架內(nèi)饒無(wú)紡布制成，其過(guò)濾對(duì)象是1-10mm 的塵埃，使用一段時(shí)間后積塵增多阻力增大效率降低要定期修理或更換; 高效過(guò)濾器金屬框架內(nèi)饒超細(xì)玻璃纖維濾紙制成過(guò)濾對(duì)象為小于 1um 塵埃，為主要部件）吸入風(fēng)機(jī)，經(jīng)過(guò)風(fēng)機(jī)加壓后，經(jīng)過(guò)頂部的高效過(guò)濾器過(guò)濾的潔凈空氣垂直送到工作區(qū)，然后一部分排至室內(nèi)，大部分通過(guò)臺(tái)面上的孔回風(fēng)進(jìn)行循環(huán)。注意事項(xiàng)） . 超凈工作臺(tái)操作區(qū)為垂直層流區(qū)，因此出風(fēng)面操作位置不應(yīng)置多余的物品，以免防礙氣流的正常流動(dòng)，影響潔凈

15、度。.操作人員應(yīng)穿潔凈的工作服，不宜在工作區(qū)附近快速行走，避免把工作區(qū)外的空氣帶入操作區(qū)，操作時(shí)手的動(dòng)作要盡量減少潔凈空氣外流。.超凈工作臺(tái)面板上的孔作為回風(fēng)用，使用時(shí)要避免有液體或其它物漏入孔中。4）打開風(fēng)機(jī)后5 分鐘可以自凈。8 無(wú)菌操作、注意事項(xiàng)（酒精燈、接種針或環(huán)）無(wú)菌操作培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過(guò)滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無(wú)菌條件 下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過(guò)程叫做無(wú)菌接 種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無(wú)菌操作。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面不論是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒劑擦 洗；水平是倒瓊脂培養(yǎng)基時(shí)利于培養(yǎng)皿內(nèi)平板的厚度保持一致。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)

16、上方， 空氣流動(dòng)應(yīng)緩慢，雜菌應(yīng)盡量減少，其周圍雜菌也應(yīng)越少越好。為此，必須清掃 室內(nèi)，關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室的門窗，并用消毒劑進(jìn)行空氣消毒處理，盡可能地減少雜菌的 數(shù)量。空氣中的雜菌在氣流小的情況下，隨著灰塵落下，所以接種時(shí)，打開培養(yǎng)皿 的時(shí)間應(yīng)盡量短。用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌。接種環(huán)的火焰滅菌 方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉(zhuǎn)動(dòng)一邊慢慢地來(lái)回通過(guò)火精品資料可編輯修改焰三次），冷卻，先接觸一下培養(yǎng)基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來(lái)挑取 含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。（圖3 - 4）然后，將接種環(huán)從 柄部至環(huán)端逐漸通過(guò)火焰滅菌，復(fù)原。不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上

17、的菌 體爆濺而污染空間。平板接種時(shí)，通常把平板的面傾斜，把培養(yǎng)皿的蓋打開一小 部分進(jìn)行接種。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時(shí)，試管口或瓶壁外面不要接觸底 皿邊，試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過(guò)。圖3 4 斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作（1）接種滅菌（2）開啟棉塞（3）管口滅菌（4）挑起菌苔（5）接種（6）塞好棉塞二、分離純化含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（ Mixed culture ）。如果在 一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來(lái)自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)（Pureculture ）。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到 純培養(yǎng)的過(guò)程稱為分離純化，方法有許多種。1、傾注平板

18、法首先把微生物懸液通過(guò)一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在 4050 0左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無(wú)菌的培養(yǎng)皿 中，待凝固之后，把這平板倒置在包箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次增殖后形成一 個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。九.具體檢測(cè)項(xiàng)目（步驟、注意事項(xiàng)），接種、培養(yǎng)，1）、菌落總數(shù)檢樣程序檢樣精品資料可編輯修改菌落計(jì)數(shù)2）大腸菌群檢樣程序報(bào)告檢樣11乳糖樨恪酵管242h, 36 1C3).霉菌酵母菌檢樣程序做成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液選;f 3個(gè)適宜稀釋度各以1ml之量加入滅菌平皿中每皿加入適量培254）乳酸菌檢驗(yàn)程序做成幾個(gè)適當(dāng)稀釋倍數(shù)

19、選才23個(gè)適當(dāng)稀釋度各以1ml的量加入滅菌平皿內(nèi)每皿內(nèi)加入適量改良TJA或改良MC培36 1 C 72 3h菌 落 計(jì) 數(shù)涂抹檢驗(yàn)方法1、材料150ml 三角燒瓶75% 酒精棉球鑷子5cm x 5cm的涂抹紙平皿 ,直徑為 9cm試劑生理鹽水：8.5g 氯化鈉溶于1000ml 蒸餾水中（如檢樣用氯消過(guò)毒，需加10%硫代硫酸鈉以除氯）。高壓滅菌：生理鹽水50ml 分裝于三角瓶中，涂抹紙置于平皿中，在121 下，高壓滅菌20 分鐘。操作步驟以無(wú)菌操作向高壓滅菌后的裝有涂抹紙的平皿中倒入少量生理鹽水，潤(rùn)濕即可。涂抹前，用酒精棉球?qū)⑹趾丸囎硬潦萌?，進(jìn)行徹底消毒。3 涂抹時(shí)，用無(wú)菌鑷子取潤(rùn)濕涂抹紙，平

20、鋪在被檢測(cè)物品的表面（有效面積50 cm 2），然后將此涂抹紙放入鹽水瓶中，充分潤(rùn)洗紙片。不能及時(shí)檢測(cè)，應(yīng)暫時(shí)置于冰箱中，在于4 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。4 細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群檢測(cè)步驟同前。3.5 報(bào)告：細(xì)菌總數(shù)報(bào)告為cfu/cm 2大腸菌群報(bào)告為MPN/100 cm 2?？諝鈨舳?設(shè)備和材料）生化培養(yǎng)箱，36 1 OC）天平）恒溫水浴鍋，46 1 OC4）平皿，直徑為9cm）菌落計(jì)數(shù)器）酒精燈）三角瓶，容量為300ml）記號(hào)筆o辰關(guān)宜培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按GB4789.28-94 中 4.7 規(guī)定或購(gòu)買制好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，按說(shuō)明配制后，分裝于300ml 三角瓶中，高壓滅菌121 、15 分鐘。方法）在無(wú)菌

21、條件下，將涼至46 的營(yíng)養(yǎng)瓊脂注入平皿約15ml ，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使之混勻，營(yíng)養(yǎng)瓊脂凝固后，待用。）根據(jù)采樣室面積的大小放置營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿，一般規(guī)定：面積0 30m 2,按對(duì)角線位置放置3個(gè)皿；面積30m2,按采樣室四個(gè)角加中間放置 5 個(gè)皿。（放置時(shí)應(yīng)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿蓋打開，放置15 分鐘）3）加蓋，翻轉(zhuǎn)平板，置于36 1C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)482h,取出計(jì)數(shù)。（同 菌落總數(shù)測(cè)定的計(jì)數(shù)方法）4）報(bào)告：以cfu/平板進(jìn)行報(bào)告。十、分離培養(yǎng)（劃線）、復(fù)發(fā)醉，判定平板劃線法最簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無(wú)菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許 在平板上進(jìn)行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法

22、有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖3 6）當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng) 基表面上往后移動(dòng)時(shí)，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個(gè) 細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成一個(gè)菌落。圖3 6 平板劃線分離法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法觀察菌落形態(tài)，挑取符合下列特征的菌落；深紫黑色，具有金屬光澤的菌落。紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落。淡紫紅色，中心較深的菌落。作革蘭氏染色、鏡檢和證實(shí)試驗(yàn)。復(fù)發(fā)酵判定：產(chǎn)酸產(chǎn)氣為陽(yáng)性十一.顯微鏡原理、注意事項(xiàng)，操作原理顯微鏡的放大效能是有所用光波長(zhǎng)短和物鏡數(shù)值口徑?jīng)Q定，縮短使用光波波長(zhǎng)或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率，可見光的波長(zhǎng)幅度比較窄，紫

23、外光波長(zhǎng)短可以提高分辨率，但不能直接用肉眼觀察。所以利用減小光波波長(zhǎng)來(lái)提高光學(xué)顯微鏡分辨率是有限的，提高數(shù)值口徑是提高分辨率的理想措施。要增加數(shù)值口徑，可以提高介質(zhì)折射率，當(dāng)空氣為介質(zhì)時(shí)折射率為1 ，而香柏油的折射率為1.51 ，和載玻片的玻璃折射率1.52 相近，這樣光線可以不發(fā)生折射而直接通過(guò)載玻片、香柏油進(jìn)入物鏡，從而提高分辨率。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。注意事項(xiàng)使用顯微鏡時(shí)，必須端坐勿將鏡臺(tái)傾斜，以免液體標(biāo)本的鏡油流出。香柏油要潔凈聚光鏡要提高到最高點(diǎn)，并放大聚光鏡下的虹彩光圈，否則會(huì)降低數(shù)值口徑而影響分辨率。以天然光為光源時(shí)，反光

24、鏡用平面，以燈光為光源時(shí)，反光鏡用凹面。將鏡片標(biāo)本置載物臺(tái)上，用移動(dòng)器或固定夾固定，先用低倍鏡對(duì)好光線，然后使用油鏡，放大光圈和升高集光器。使用油鏡時(shí)，先在標(biāo)本上滴一滴香柏油目的在于減少光線通過(guò)玻片與物鏡間的空氣時(shí)所引起的散光現(xiàn)象。玻片與載玻片的擇光率相近似。觀察標(biāo)本時(shí)，兩眼同時(shí)睜開左眼看鏡筒，右眼繪圖或記錄油鏡用畢先用擦鏡紙擦去香柏油，再用擦鏡紙蘸1 ： 1的乙醇、乙醚混合液擦去香柏油，再用擦鏡紙擦去1 ： 1 的乙醇、乙醚混合液然后將接物鏡轉(zhuǎn)成“八”字型，下降鏡筒和集光器。關(guān)閉電源，將防塵罩蓋好。顯微鏡使用時(shí)動(dòng)作要穩(wěn)準(zhǔn)，輕拿輕放，平時(shí)置干燥處保存，避免陽(yáng)光爆曬。十二革蘭氏染色，操作染色方法

25、革蘭氏染色原理革蘭氏染色有各種學(xué)說(shuō)(如化學(xué)學(xué)說(shuō)、滲透學(xué)說(shuō)、等電點(diǎn)學(xué)說(shuō)等)，但任何一種學(xué)說(shuō)均未能單獨(dú)圓滿地解釋革蘭氏反應(yīng)，綜合各學(xué)說(shuō)觀點(diǎn)，革蘭氏染色反應(yīng)可能與以下各因素有關(guān)：)細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)上的差異G + 菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，細(xì)胞壁肽聚糖含量高，脂類含量低。在乙醇中處理，染料和碘的復(fù)合物不容易被乙醇析出，使菌體留有紫色。G - 菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)梳松，肽聚糖含量低，含有大量的脂類物質(zhì)，乙醇容易滲入而脫色。）細(xì)胞膜滲透性不同G +菌表面結(jié)構(gòu)內(nèi)含有核糖核酸鎂鹽，而G -菌表面結(jié)構(gòu)內(nèi)不含有核糖核酸鎂鹽。這種核糖核酸鎂鹽能強(qiáng)力地與染料的碘復(fù)合物結(jié)合，不易滲出菌體外，染成紫色。）等電點(diǎn)學(xué)說(shuō)G+菌的等電點(diǎn)在PH值

26、2-3 , G-菌的等電點(diǎn)在PH值4-5 ,所以在同樣PH 值條件下，等電點(diǎn)愈低，則與堿性染料結(jié)合力亦愈強(qiáng)，其抵抗脫色的能力亦愈強(qiáng)，所以不易被脫色，呈紫色。相反，G-菌等電點(diǎn)偏高，與堿性染料結(jié)合力弱，對(duì)脫色抵抗力不強(qiáng)，易被脫色，再染成紅色。試劑結(jié)晶紫染色液： TOC o 1-5 h z 結(jié)晶紫1g95% 乙醇20ml1%草酸銨水溶液80ml將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。革蘭氏碘液碘1g碘化鉀2g蒸餾水300ml將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至 300ml.沙黃復(fù)染液沙黃0.25g95% 乙醇10ml蒸餾水90ml將沙黃溶解于乙醇中，然后

27、用蒸餾水稀釋。染色法涂片的制作：取一張潔凈無(wú)油脂的載玻片，加上一環(huán)生理鹽水（如系液體標(biāo)本或液體培養(yǎng)物可不加鹽水）用滅菌的接種環(huán)，取菌落（純培養(yǎng)者可取菌苔）少許，與生理鹽水混勻，涂布成薄膜。液體培養(yǎng)物直接挑取菌液涂片。干燥一般在室溫中使自然干燥。若須加速干燥，可在火焰上方的熱空氣中加溫干燥，但切勿緊靠火焰，以免標(biāo)本烤焦，不易鏡檢。固定目的：使細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)凝固，殺死細(xì)菌；使菌體與玻片粘附的較牢，防止標(biāo)本被水沖洗掉；改變菌體對(duì)染料的通透性，因?yàn)樗赖脑|(zhì)比活的原生質(zhì)易于脫色。方法：一般均用加熱法，即將涂片迅速通過(guò)火焰2-3 次，以玻片反面接觸皮膚，熱而不燙為度。染色：滴加的染液以覆蓋標(biāo)本為度。初染：

28、滴加結(jié)晶紫染色液，作用1min ，水洗。助染：革蘭氏碘液，作用1min ，水洗。脫色：滴加95% 乙醇脫色，約30s ；或?qū)⒁掖嫉螡M整個(gè)涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個(gè)涂片，脫色10s 。復(fù)染：滴加復(fù)染液，復(fù)染1min 。水洗，待干，鏡檢。革蘭氏染色過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)接種環(huán)接的菌不能太多，防止涂片太厚，不易脫色。結(jié)果判定：革蘭氏陽(yáng)性菌為藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌為粉紅色。十三壞包分析注意事項(xiàng)、操作啟動(dòng)條件包裝無(wú)明顯破損。由微生物污染引起的壞包。目地樣：同一批次，同一取樣原因，取壞包表現(xiàn)性狀相同的任意1 2 包進(jìn)行 TOC o 1-5 h z 細(xì)菌的培養(yǎng)及初步鑒定。如表現(xiàn)性狀不同，針對(duì)不同表現(xiàn)性狀的壞

29、包分別取1 2 包進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)及初步鑒定；如不同取樣原因，針對(duì)取樣原因分別取表現(xiàn)性狀相同的壞包任意1 2 包進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)及初步鑒定。隨機(jī)樣：不同時(shí)段出現(xiàn)壞包，針對(duì)時(shí)段分別取表現(xiàn)性狀相同的壞包任意1 2包進(jìn)行細(xì)菌初步鑒定；相同時(shí)段出現(xiàn)壞包，針對(duì)不同表現(xiàn)性狀的壞包分別取1 包進(jìn)行細(xì)菌初步鑒定。記錄樣品：名稱、批號(hào)、取樣原因、時(shí)間、樣品感官、PH 值、酸度、氣體形成，包裝密封性，微生物鑒定結(jié)果等。樣品處理準(zhǔn)備.酸包：檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品感官及PH 值有明顯變化時(shí)，需快速將酸包產(chǎn)品的內(nèi)容物移入無(wú)菌容器內(nèi)（移入時(shí)需用75% 的酒精棉對(duì)操作員手及開包產(chǎn)品的移出口進(jìn)行擦試滅菌），并需快速檢測(cè)。如不能檢測(cè)，需冷

30、藏保存2 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。. 脹包：使用75% 酒精棉對(duì)樣品外表面擦試消毒后放于超凈臺(tái)內(nèi)待檢。檢測(cè)時(shí)，以無(wú)菌操作在無(wú)橫縱封處剪一半圓或三角取樣。檢測(cè)（劃線，接種培養(yǎng)）：以無(wú)菌操作進(jìn)行檢測(cè)細(xì)菌：取1ml 混合均勻的樣品接種于培養(yǎng)皿中，及時(shí)將涼至46 的營(yíng)養(yǎng)瓊脂注入平皿約15ml ，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使之混勻；同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂注入加有1ml 滅菌生理鹽水的平皿內(nèi)做空白對(duì)照；36 1 /48 小時(shí)條件下培養(yǎng)；另用接種環(huán)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上作劃線培養(yǎng)（36 1 /48h ）。芽孢、耐熱芽孢：取5ml 樣品于兩個(gè)小試管（15*150 ）中，分別在80和100 的水浴中保溫10min ，冷卻。分別取1ml 樣品接種于培

31、養(yǎng)皿中，用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂分別作芽孢（36 1 /72h ）和耐熱芽孢（55 1 /72h ）的接種培養(yǎng)；另用接種環(huán)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分別作芽孢（36 1 /72h ）和耐熱芽孢（ 55 1 /72h ）的劃線培養(yǎng)。霉菌、酵母菌：取1ml 混合均勻的樣品接種于培養(yǎng)皿中，用虎紅（孟加拉紅）瓊脂于 25 28 /5 天條件下培養(yǎng)；另用接種環(huán)于虎紅（孟加拉紅）瓊脂平板上作劃線培養(yǎng)（25 28 /5 天）五、初步鑒定：（挑取菌落一一對(duì)應(yīng)）菌落記錄：形態(tài)、大小、邊緣、表面、透明度、隆起度、顏色、氣味等。初染：選取不同形態(tài)的單一菌落。滴一滴苯胺黑（2% 水溶液）或結(jié)晶紫染液于載玻片上，用接種環(huán)挑取少量菌于涂液的

32、載玻片處,完全涂勻.待自然干燥后 , 滴香柏油,使用顯微鏡的油鏡觀察,主要鑒別球菌、桿菌，微生物不著色，在黑背景處觀察清晰、閃亮點(diǎn)。G 菌易扭曲變形，造成鑒別困難。細(xì)菌形態(tài)的鑒定球菌：對(duì)于球菌，不一定需要G 染色，因?yàn)镚 球菌不會(huì)成為液體食品中的腐敗菌，可直接進(jìn)行 H2O2酶實(shí)驗(yàn)。鑒別H2O2酶陽(yáng)性、陰性球 菌。桿菌：需進(jìn)行G 染色，鑒別G 或 G +，有無(wú)芽孢形成。4.H2O2酶試驗(yàn)：是一個(gè)裂解H2O2,產(chǎn)生。2的過(guò)程。鑒別H2O2酶試驗(yàn)陰 性或陽(yáng)性的G+桿菌。方法：滴一滴10%的H2O2酶溶液于載玻片上，使用接種環(huán)挑取與菌 落形態(tài)、初染、G染色均對(duì)應(yīng)的菌落（少量），于涂有 H2O2的載玻 片，完全涂開觀察。結(jié)果：有氣體生成fH2O2酶陽(yáng)性； 無(wú)氣體生成fH2O2酶陰性。氧化酶試驗(yàn)：鑒別氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性、陰性的G 桿菌。方法：取一試紙條，使用接種環(huán)挑取少量相對(duì)應(yīng)的菌落涂于氧化酶試 紙條有藥品的一端，觀察。結(jié)果：不變色氧化酶陰性 變色氧化酶陽(yáng)性檢測(cè)范圍、項(xiàng)目：低酸產(chǎn)品：檢測(cè)細(xì)菌、芽孢、耐熱芽孢，必要時(shí)檢測(cè)霉菌、酵母 菌。高酸產(chǎn)品：檢測(cè)細(xì)菌、霉菌、酵母菌。菌落形態(tài) 細(xì)菌a.大小：6mm 為巨大菌落。形態(tài)：圓形、不規(guī)則狀，假根狀等。隆起度