羥基自由基清除能力的抗氧化能力評(píng)價(jià) 脫氧核糖法

1、羥基自由基（0H ）清除能力的評(píng)價(jià)：脫氧核糖法脫氧核糖法檢測(cè)羥基自由基清除能力與溶劑影響【總流程圖】脫組核糖法評(píng)價(jià)（0H ）清除能力的總流程圖說(shuō)明：脫氧核糖降解試驗(yàn)廣泛用于評(píng)估羥基（0H）食物或藥物的自由基清除能力。我們比擬 了在乙醇溶液中制備的25個(gè)抗氧化劑樣品與去除乙醇（殘留物）后制備的樣品的羥自由基 清除活性。數(shù)據(jù)說(shuō)明，乙醇溶液和殘?jiān)鼧悠返臏y(cè)定結(jié)果相差約9倍。這說(shuō)明酒精的強(qiáng)烈干 擾。為了進(jìn)一步研究其機(jī)理，用脫氧核糖法測(cè)定了 18種有機(jī)溶劑（包括乙醇）的清除活性。 大多數(shù)純有機(jī)溶劑（尤其是醇類）都能有效清除羥基自由基?！緦?shí)例】三種典型的抗氧化劑（含阿魏酸、榭皮素和褪黑素）的濃度響應(yīng)曲線，在

2、乙醇溶液和揮干 乙醇后的比照。這說(shuō)明乙醇有嚴(yán)重干擾。圖2阿魏酸的濃度響應(yīng)曲線（揮干乙醇和乙醇溶液的比照）100-圖3榭皮素的濃度響應(yīng)曲線（揮干乙醇和乙醇溶液的比照）圖4褪黑素（Melatonin）的濃度響應(yīng)曲線（揮干乙醇和乙醇溶液的比照）【背景介紹及溶劑影響的原因分析】脫氧核糖降解試驗(yàn)自1987年建立以來(lái)，已廣泛用于評(píng)估食品、營(yíng)養(yǎng)素和藥物的羥自由基 清除能力。在脫氧核糖降解試驗(yàn)中，通過(guò)芬頓反響獲得0H,隨后，-OH攻擊脫氧核糖并打 破其環(huán)味喃環(huán)，生成丙二醛（MDA）。MDA與2-硫代巴比妥酸（TBA）結(jié)合，在530 nm處 產(chǎn)生Lax的有色物質(zhì)。CHOHHHOH 一包一-HCCH2CHOHCH

3、2OHTBA （2-硫代巴比妥勖TBARS （ 2-碇代巴比妥酸反響產(chǎn)物）530 nmHCCH2CH g 2MDA旃二醛）因此，A53m值與生成的羥基自由基的量成正比，A530nm值越高，說(shuō)明OH自由基水平越高。 如果添加抗氧化劑樣品，A530m值將降低，說(shuō)明抗氧化劑清除了一些OH自由基。這是脫氧 核糖降解測(cè)定的原理。與大多數(shù)生化分析一樣，脫氧核糖分析需要在測(cè)量之前使用各種有機(jī)溶劑制備樣品溶液。 然而，據(jù)觀察，通常用于制備這些樣品溶液的有機(jī)溶劑（尤其是醇類）可能會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈干擾， 而這些干擾往往被分析用戶忽視。幾個(gè)研究小組明確表示,他們使用有機(jī)溶劑制備樣品溶液, 樣品溶液直接用于脫氧核糖測(cè)定。例

4、如，至少有七組報(bào)告稱，他們使用酒精溶解樣品，這是 通過(guò)分析直接測(cè)量的。一個(gè)研究小組甚至直接將食用葡萄酒用于檢測(cè)，以評(píng)估葡萄酒中酚類 化合物的羥基清除能力。由于抗氧化劑樣品的水溶性通常缺乏以在室溫下制備樣品儲(chǔ)藏溶液,我們認(rèn)為有更多的研 究小組使用有機(jī)溶劑溶解樣品，因此可能會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。甚至更廣泛。因此，所有這些調(diào)查都 被認(rèn)為是不可靠的。因此，在本研究中，我們系統(tǒng)地研究了各種溶劑的作用，以提高脫氧核 糖分析性能?！緦?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持】在本研究中，我們首先比擬了 25種抗氧化物（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖5）在乙醇溶液中和在緩沖液中 （去除乙醇后）的殘留物的羥自由基清除活性。為了探索酒精干擾的機(jī)制，使用原始的化學(xué)試劑測(cè)定了

5、純乙醇的羥自由基清除能力脫氧 核糖測(cè)定。結(jié)果說(shuō)明，乙醇本身呈現(xiàn)劑量-反響曲線，在800微升的反響體積中，其ICso僅 為1.860.13微升。這意味著少于3微升的乙醇足以清除大多數(shù)羥基自由基（90%）o這些 結(jié)果與之前的報(bào)告一致,即乙醇可以作為自由基清除劑，并可以保護(hù)DNA免受清除羥基自 由基的影響?？傊凭珜?duì)測(cè)定的干擾源于乙醇本身的羥自由基清除能力。OOH5阿葭酸4姜黃素2 BHA1 （十）兒茶素7 8-羥基噎琳衍生物9桑橙素6 GSH13相罟素omH15原兒茶酸18“皮素16品根素23 生育酚24 Trolox25尿眠院20聲丁沉香葉的甲酣提取物11 MEASCHjCCOOH8異阿et戢

6、姣股藍(lán)的甲醇提取物 12 MEGMHOOCCHCH/：H2C-NiNH； y.2 H HC-N-CH?COOH10 廓CH20H17叱哆降COOHHCHy22百里香的19迷送香酸圖5,25種抗氧化劑的結(jié)構(gòu)為了系統(tǒng)地研究溶劑效應(yīng)，使用原始脫氧核糖測(cè)定法測(cè)定了另外17種純有機(jī)溶劑的干擾。 數(shù)據(jù)說(shuō)明，所有溶劑都能有效清除羥基自由基。我們根據(jù)IC的值將有機(jī)溶劑分為四種主要類 型。正己烷和石油酸是最弱的清除劑正己烷和石油酸（低級(jí)烷燒的混合物）是僅包含Q 鍵（C-H和C-C。鍵）的碳?xì)浠衔?，其具有穩(wěn)定性，而且耐羥基自由基的損傷。 此外，這些溶劑的水溶性差也阻礙了與水反響系統(tǒng)中的羥基反響。如所示，環(huán)己烷表

7、現(xiàn)出輕微的OH清除活性，這可能是由于環(huán)狀分子固有的環(huán)應(yīng)變 引起的此外，兩種典型的芳燒溶劑，苯和甲苯，以及三種鹵代燒，四氯化碳、氯仿 和氯甲烷也具有中等活性。芳燒分子含有共趣tt鍵，其穩(wěn)定性不如。鍵，并且可以 與0H自由基反響。然而,三種鹵代煌的輕微活性可歸因于極性C-X。鍵（X=鹵素）。（3）另外三種溶劑，乙睛、丙酮和二硫化碳，表現(xiàn)出較強(qiáng)的羥自由基清除能力。這些分 子中的非共版不飽和鍵（C三N, C=。和C二S分別）比芳香煌分子中的共匏兀鍵。 因此，它們很容易被羥基自由基破壞。（4） 在7個(gè)細(xì)胞中觀察到非常強(qiáng)的0H清除活性有機(jī)溶劑，包括乙酸、DMF（二甲基甲酰 胺）、DMSO（二甲基亞碉）、乙

8、醇、乙酸乙酯、甲醇和四氫味喃。乙醐除外（仍然很可 溶），所有這些溶劑都與水所有這些溶劑都包含至少一個(gè)。原子，其中形成各種活 性化學(xué)鍵（例如00、H-0和S=0）或官能團(tuán)（例如羥基、酯、酰胺、亞碉基和環(huán)狀 乙醛基團(tuán)）。這些反響性化學(xué)鍵或官能團(tuán)。對(duì)這些溶劑具有強(qiáng)大的羥基自由基清除能 力。重要的是，DMSO,它通常用于生物化學(xué)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的樣品溶液制備，顯示出非 常強(qiáng)的清除能力（IGo二5.760.76同）。結(jié)果與先前的研究一致，說(shuō)明DMSO可以作 為羥基清除劑，并可以防止羥基自由基對(duì)DNA的損傷。溶劑對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響源于有機(jī)溶劑本身的羥基自由基清除能力，并且可以最終歸因于羥 基的極端反響性能.羥基自

9、由基將與周圍的溶劑分子快速反響。例如，OH與乙醇和DMSO 的反響速率分別為1.9 x 109 L mol s”和9 x 109 Lmol s。OH與DMSO反響的產(chǎn)物為 CH3o總之，在通過(guò)脫氧核糖降解測(cè)定進(jìn)行測(cè)量之前，應(yīng)完全去除任何有機(jī)溶劑，否那么結(jié)果將 毫無(wú)意義。然而，蒸發(fā)溫度應(yīng)保持在60C。以下，以防止抗氧化劑樣品正在被摧毀。在我們 的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)所有樣品殘留物都可以很好地溶解在水反響系統(tǒng)中。最抗氧化劑是有機(jī) 化合物及其水溶性通常缺乏以制備樣品儲(chǔ)藏溶液（室溫），但通常高到足以溶解在反響系統(tǒng) （50 C。）。例如,兒茶素的水溶性為2.26 mg/mL（25C）。而其ICso值僅為0.

10、200.0025 mg/mL 一些典型的脂溶性抗氧化劑（如BHA、麝香草酚和生育酚）和兩種提取物（MEA和MEGB） 也可以溶解在反響系統(tǒng)中。這是因?yàn)椋海?）這些抗氧化劑含有酚-OH基團(tuán)，可以與修0分 子形成氫鍵，增加水溶性；（2）較高的反響溫度（50C。）增加了水體系中的溶解度；（3） 抗氧化劑殘留量逐漸減少反響過(guò)程中的OH攻擊?；谝陨嫌懻?，脫氧核糖降解試驗(yàn)可以改進(jìn)如下：首先，我們選擇合適的有機(jī)溶劑制備 樣品溶液。將一小份樣品溶液置于管中，并將該樣品溶液蒸發(fā)至干燥（水浴，60C）o然后， 按照上述測(cè)定樣品殘留量。改進(jìn)的脫氧核糖降解試驗(yàn)的整個(gè)過(guò)程如圖1所示。必須強(qiáng)調(diào)的是，（1）,如果抗氧化劑

11、樣品水溶性不好，我們可以用水（或緩沖液）制備 樣品解決方案因?yàn)樗ɑ蚓彌_液）不能和羥基反響自由基、水溶液樣品可以直接測(cè)量；（2）如 果抗氧化劑樣品是熱敏的，那么樣品溶液應(yīng)在室溫下蒸發(fā)至干燥。改進(jìn)的脫氧核糖測(cè)定程序通過(guò)使用參考化合物（+ ）-兒茶素。（+ ）-兒茶素的回歸方程 相關(guān)系數(shù)（R）為0.99887o 1的的RSD%為0.51%,符合FDA（美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局）要求。除（+ ） -兒茶素外,其他24種抗氧化劑也表現(xiàn)出良好的線性（R二。80304-0.99956,平均R值為 0.93335）和較低的RSD值（0.35-9.07%,平均值為3.38射。顯然，改進(jìn)后的方法具有良好 的線性和精密度。此外，在不同的日期獲得的G二值的RSD%為2.26%。（ + ）-兒茶素分析這 說(shuō)明改進(jìn)的方法具有良好的再現(xiàn)性綜上所述，改進(jìn)的脫氧核糖測(cè)定法（尤其是樣品制備） 是合理可行的。如圖5所示，25種選定的抗氧化劑包括所有類型的抗氧化劑，如純化合物和提取物； 天然和合成；外源性和內(nèi)源性，水溶性和脂溶性、維生素、維生素類似物和非維生素、酚、 多酚、酚酸、類黃酮、原花青素、苯丙素、多肽、雜環(huán)酚和堿基對(duì)。作為所有這些的清除能 力在我們的實(shí)驗(yàn)中可以成功地測(cè)量物種，改進(jìn)的方法證明適用于所有類型的抗氧化劑?！窘Y(jié)論】在脫氧核糖降解試驗(yàn)中，任何有機(jī)溶劑測(cè)量前應(yīng)完全蒸發(fā)，否那么結(jié)果將毫無(wú)意義。我們 提出的改