蛋白質(zhì)和酶工程

1、關(guān)于蛋白質(zhì)與酶工程第一張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 酶的固定化方法一、固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn) 1、優(yōu)點(diǎn) 酶與底物、產(chǎn)物易分開(kāi)，簡(jiǎn)化了提純工藝； 可反復(fù)使用，利于連續(xù)化、管道化； 反應(yīng)過(guò)程可控，利于自動(dòng)化； 提高了酶的穩(wěn)定性（絕大多數(shù)情況）； 酶的使用效率高、產(chǎn)率高、產(chǎn)品質(zhì)量高、成本低。 2、缺點(diǎn) 損失酶活力2）不適應(yīng)非水溶性底物和大分子底物 不適于多酶反應(yīng)第二張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、酶的固定化方法 吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法 第三張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1、吸附法 吸附法分為物理吸附法和離子交換吸附法。 物理吸附法 通過(guò)氫鍵、疏水

2、作用和、電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上，從而制成固定化酶。 常用的載體有： 有機(jī)載體：纖維素(玻璃紙或膠棉膜 )、淀粉等，吸附量大 無(wú)機(jī)載體：氧化鉛、皂土、多孔玻璃等，吸附量小，易脫落 第四張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 離子交換吸附法 將酶與含有離子交換基的水不溶載體相結(jié)合而達(dá)到固定化。 陰離子交換劑：二乙基氨基乙基（DEAE）-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠 DEAE-Sephadex A25固定氨基酰化酶：溶脹，然后用0.5mol/LNaOH和水洗滌，加酶混勻，于低溫下攪拌過(guò)夜，吸去上清液，再用蒸餾水和0.15molL醋酸鈉水溶液洗滌固定化酶，置4備用。 陽(yáng)離子交

3、換劑：羧甲基（CM）-纖維素第五張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 吸附法的優(yōu)點(diǎn)：a、操作簡(jiǎn)單；b、載體選擇范圍廣；c、吸附過(guò)程可以同時(shí)純化酶；d、固定化酶在使用過(guò)程失活后可重新活化；e、載體可以回收再利用。 吸附法的缺點(diǎn)：a、由于有些機(jī)理不十分明了，在給酶量、吸附程度與固定化酶活力回收的關(guān)系不可預(yù)見(jiàn)性大。b、由于吸附法制備的固定化酶酶易脫落，影響產(chǎn)物純度和酶的操作穩(wěn)定性。 第六張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2、包理法 包埋法是將載體聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進(jìn)劑（包括交聯(lián)劑）的作用進(jìn)行單體聚合，酶被包埋在載體聚合物中以達(dá)到固定化。 分為凝膠包理法和微囊包埋

4、法 凝膠包理法 凝膠包埋法（基質(zhì)包埋法）是將酶分子包埋在凝膠網(wǎng)絡(luò)的格子中。 海藻酸鈣凝膠（海藻酸鈉）、聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠、卡拉膠 第七張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 微囊包埋法 微囊包埋法是將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊內(nèi)。此法在醫(yī)療上極為有用 人造細(xì)胞、紅血球包埋法、脂質(zhì)體包埋法 包埋法是目前應(yīng)用最多的一種較理想的方法。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，條件溫和；無(wú)反應(yīng)，不改變酶的空間結(jié)構(gòu)，固定化酶的活力高；適用性廣。 缺點(diǎn)： 只適宜于小分子底物，對(duì)大分子底物不適宜； 凝膠網(wǎng)絡(luò)對(duì)物質(zhì)擴(kuò)散的阻力導(dǎo)致固定化酶動(dòng)力學(xué)行為的變化。 第八張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 3、共價(jià)結(jié)合法

5、（共價(jià)偶聯(lián)法） 就是酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載體表面上的功能基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵而固定的方法。 優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，酶不易脫落。 缺點(diǎn)：但反應(yīng)條件較激烈，酶易失活，同時(shí)，制作手續(xù)亦較繁瑣。 酶分子和載體連接的功能基團(tuán) 酶分子：-NH3、-COOH、苯環(huán)基、 -OH、-SH、咪唑基、吲哚基 載體：芳香氨基，羧基，羧甲基等第九張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 載體的選擇 載體直接關(guān)系到固定化酶的性質(zhì)和形成。對(duì)載體的一般要求是： a、一般親水載體都優(yōu)于疏水載體（結(jié)合量、活力、穩(wěn)定性） ； b、載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機(jī)械強(qiáng)度； c、載體必須帶有在溫和條件與酶共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)； d、載

6、體沒(méi)有或很少有非專(zhuān)一性吸附； e、載體來(lái)源容易，便宜，并能反復(fù)使用。 第十張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 如:天然高分子衍生物: 纖維素 葡聚糖凝膠 親和性好，機(jī)械性能差 瓊脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 性能好，但有疏水結(jié)構(gòu) 尼龍第十一張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 偶聯(lián)反應(yīng) 有13類(lèi)反應(yīng)，但必須考慮偶聯(lián)效率，固定化酶總活力，操作簡(jiǎn)便以及成本等因素。 常用的偶聯(lián)反應(yīng)：重氮化法、疊氮法、溴化氰法、芳香烴化法等。 a、重氮法 是將帶芳香族氨基的載體，先用NaNO2和稀鹽酸酸處理成重氮鹽衍生物，再在偏堿(pH8-9)條件下與酶蛋白的氨基、酚基、咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，

7、得到固定化酶。第十二張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十三張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月多糖類(lèi)的芳香族氨基衍生物載體（對(duì)-硫酸脂乙砜基胺多糖）第十四張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月氨基酸共聚體如L-Leu和對(duì)氨基-DL-苯丙氨酸共聚物第十五張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月聚丙烯酰胺衍生物第十六張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月苯乙酰樹(shù)脂第十七張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月多孔玻璃的氨基硅烷衍生物Y-氨基丙基三氧乙烷硅第一步：第十八張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二步：對(duì)硝基苯酚氯第十九張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022

8、年6月 b、疊氮法 將帶有羧基或羥基、羧甲基等的載體在酸性條件下用甲醇處理使之酯化，再用水合肼處理形成酰肼，最后在HNO3作用下轉(zhuǎn)變成疊氮衍生物。在低溫下可與酶蛋白的氨基、羥基、酚基、巰基等反應(yīng)羧甲基纖維素、CMSephadex第二十張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 c、溴化氰法 含有羥基的載體（如纖維素、葡聚糖、瓊脂等）在堿性條件下，載體的羥基與CNBr反應(yīng)，生成活潑的亞胺碳酸鹽，在弱堿條件下，可與酶分子的氨基偶聯(lián)，產(chǎn)生固定化酶。 第二十一張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 d、芳香烴化法 具有羥基的載體可以通過(guò)烷基化、芳香基化引入活潑的鹵素基后，在堿性條件下，與酶分子上的

9、氨基、酚基、巰基等反應(yīng)。 纖維素載體均三氯三嗪3-F-4，6-二硝基苯第二十二張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 4、交聯(lián)法 利用雙功能或多功能試劑在酶分子間或酶與惰性蛋白間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)制備固定化酶。 最常用的交聯(lián)試劑是戊二醛，其他如苯基二異硫氰、雙重氮聯(lián)苯胺-2，2-二磺酸、1，5-二氟-2，4-二硝苯、己二酰二胺二甲脂等。 戊二醛有兩個(gè)醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng)，使酶蛋白交聯(lián)。 第二十三張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 缺點(diǎn)： 反應(yīng)條件激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失大。 制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來(lái)不便。第二十四張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于202

10、2年6月各種固定化方法的比較交聯(lián)法常與吸附法、包埋法結(jié)合使用。 第二十五張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 固定化酶的性質(zhì) 由于固定的方法不同，固定化酶的活力和性質(zhì)也有所不同。 一、固定化酶的活力下降 原因：酶的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象發(fā)生變化(特別是酶活性中心)；酶與底物間的相互作用受到空間位阻(屏蔽效應(yīng))；微環(huán)境影響；底物、產(chǎn)物的分配不均效應(yīng)；底物、產(chǎn)物的擴(kuò)散限制效應(yīng) 活力測(cè)定、偶聯(lián)效率、活力回收、相對(duì)活力 第二十六張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、固定化酶的穩(wěn)定性提高 原因： 固定化增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度， 可防止酶分子伸展變形； 抑制蛋白酶降解； 固定化部分阻擋了外界不

11、利因素對(duì)酶的侵襲。 但如果固定化觸及到酶穩(wěn)定性區(qū)域，也可能導(dǎo)致酶穩(wěn)定性下降。 1、熱穩(wěn)定性提高 氨基?；福喝芤好冈?5保溫15min，活力為0；DEAE-Sephadex固定化酶在同樣條件下仍有80；DEAE-纖維素固定化酶在同樣條件下還有60活力。 第二十七張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2、對(duì)蛋白酶的抵抗力提高 氨基酰化酶：在胰蛋白酶作用下活力僅存20，而將其固定于DEAE纖維素上在同樣條件下仍有80的活力。 3、對(duì)變性劑、抑制劑的抵抗能力提高 氨基?；福喝芤好冈?mol、2mol弧、1 SDS和4mmol丙酮溶液中相對(duì)活力分別為 9、49、1和55，而后者在相應(yīng)溶液中相對(duì)

12、活力則分別為146%、117%、35%和138%。 第二十八張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 4、操作穩(wěn)定性提高 固定化酶在操作中可以長(zhǎng)期使用，半衰期較長(zhǎng)。 青霉素?；福?7 催化77天，活力仍為100% 5、貯藏穩(wěn)定性提高 木瓜蛋白酶：在4下，120天溶液酶活力只保留有70%，而固定化酶（瓊脂）活力無(wú)變化。三、固定化酶的催化特性改變 1、最適溫度 固定化酶反應(yīng)的溫度一般較溶液酶的高，如用CM-纖維素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度比溶液酶高515。 （但也有例外）第二十九張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2、最適pH 最適pH的變動(dòng)依據(jù)載體的電荷性質(zhì)而定。 帶負(fù)電荷載

13、體：最適pH 向堿性偏移。 帶正電荷載體：最適pH 向酸性偏移。 DEAE-纖維素或DEAE-葡聚糖固定化氨基?；概c其游離酶比較，低0.5個(gè)pH而偏向酸性方向。CM-纖維素固定化的胰蛋白酶、糜蛋白酶的最適pH與游離酶比較，向堿性方向偏移0.51個(gè)pH單位。 第三十張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 3、Km（反應(yīng)動(dòng)力學(xué)） 多數(shù)固定化酶的Km有一定變化，與活性中心的構(gòu)象改變及載體的電荷性質(zhì)有關(guān)。 載體與底物電荷相反，固定化酶的Km值降低。 載體與底物電荷相同，固定化酶的Km值顯著增加。 4、專(zhuān)一性 大多數(shù)固定化酶的專(zhuān)一性與溶液酶相同，但也有例外。 第三十一張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2

14、022年6月第六章 酶(蛋白質(zhì))分子的化學(xué)修飾（蛋白質(zhì)水平的分子改造） 酶分子的化學(xué)修飾就是在體外通過(guò)人工的方法將酶分子與一些化學(xué)基團(tuán)或化學(xué)物質(zhì)(修飾試劑 )進(jìn)行共價(jià)連接從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。 基礎(chǔ)研究：探測(cè)酶活性必需氨基酸的性質(zhì)和數(shù)目；探測(cè)酶蛋白的結(jié)構(gòu)變化與功能的關(guān)系；測(cè)定酶蛋白部分區(qū)域的構(gòu)象狀態(tài)；探索酶的作用機(jī)理和催化反應(yīng)歷程；研究酶的固定化技術(shù)。 應(yīng)用研究： 提高酶的穩(wěn)定性； 改善酶的催化特性；提高蛋白藥物在體內(nèi)不穩(wěn)性、 消除免疫原性及靶向性（病灶細(xì)胞）。 第三十二張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 酶化學(xué)修飾的基本條件 必須對(duì)被修飾酶的性質(zhì)、修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件等

15、方面有足夠的了解 一、被修飾酶的性質(zhì) 1、基本性質(zhì) 熱、酸堿穩(wěn)定性，最適溫度、pH，pI，抑制劑，蛋白酶水解部位等。 2、酶活性中心 氨基酸殘基數(shù)目、性質(zhì)及其地位、有無(wú)輔助因子及種類(lèi)。 第三十三張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 3、被修飾氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的性質(zhì)及反應(yīng)性 常被修飾的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基、氨基、羧基、咪唑基、羥基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫鍵等 巰基的修飾試劑 烷基化試劑：碘乙酸、碘乙酸胺、巰基乙醇、谷胱甘肽 汞試劑：HgCl2、對(duì)氯汞苯甲酸、2-氯汞硝基苯酚 Ellman試劑：5，5-二硫-二-2-硝基苯甲酸 第三十四張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 氨基的修飾

16、試劑 乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、苯異硫氰酸酯、碘乙酸 羧基的修飾試劑 甲醇、硼氟化三甲鋅鹽（-COOCH3） 咪唑基的修飾試劑 碘乙酸、碘乙酸胺 吲哚基的修飾試劑 光敏試劑（打開(kāi)吲哚環(huán)）、4-硝基苯硫氯 第三十五張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 甲硫氨酸側(cè)鏈基團(tuán)的修飾試劑 碘代乙酰胺、H2O2或光敏試劑(E-S-CH3的硫氧化) 二硫鍵的修飾試劑 二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇 酚基的修飾試劑 N-乙酰咪唑、二異丙基氟磷酸 胍基的修飾試劑 丁二酮、苯乙二醛（結(jié)合在胍基的兩個(gè)氨基上） 第三十六張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、修飾反應(yīng)的條件 酶穩(wěn)定、修

17、飾率高、活力回收高(實(shí)驗(yàn)探索確定) 1、pH與離子強(qiáng)度 決定了側(cè)鏈基團(tuán)的解離狀態(tài)和反應(yīng)性能 有些修飾試劑在不同pH條件下與同一基團(tuán)可形成不同產(chǎn)物。 2、修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間 嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除一些非專(zhuān)一性的修飾反應(yīng)。 3、反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例 第三十七張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 酶化學(xué)修飾的方法 酶表面修飾、酶內(nèi)部修飾 金屬離子置換修飾,大分子修飾(共價(jià)/非共價(jià))側(cè)鏈基團(tuán)修飾（小分子修飾）肽鏈有限水解修飾固定化修飾 第三十八張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1、金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變

18、的修飾方法稱(chēng)為金屬離子置換修飾。-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過(guò)氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，?；被崦阜肿又械匿\離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+) 若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會(huì)喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。第三十九張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月金屬離子置換修飾的過(guò)程 a. 酶的分離純化：首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)

19、過(guò)分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。 b. 除去原有的金屬離子：在經(jīng)過(guò)純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過(guò)透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時(shí)，酶往往成為無(wú)活性狀態(tài)。 c. 加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過(guò)金屬離子置換后的酶。 金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來(lái)含有金屬離子的酶。 用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。 第四十張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于202

20、2年6月 2、大分子修飾 大分子非共價(jià)修飾 大分子物質(zhì)與酶非共價(jià)地相互作用，有效地保護(hù)酶的活力和穩(wěn)定性 修飾試劑：聚乙二醇、多元醇、多糖、多聚氨基酸、蛋白質(zhì)等 大分子共價(jià)修飾 大分子物質(zhì)通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶分子的表面形成一層覆蓋層有效地保護(hù)酶的活力和穩(wěn)定性。 修飾試劑：聚乙二醇。右旋糖苷、肝素等第四十一張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月大分子共價(jià)修飾的過(guò)程修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：作為修

21、飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過(guò)活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。 修飾：將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過(guò)分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。 分離：需要通過(guò)凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開(kāi)，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。 第四十二張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 3、側(cè)鏈基團(tuán)修飾 利用一些適宜的小分子修飾劑通過(guò)化學(xué)法使酶蛋白表面的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法。 非催化活性基團(tuán)修飾：最主要的，側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。 催化活性基團(tuán)修飾：氨基酸轉(zhuǎn)變(化學(xué)突變法 )， 例如Ser轉(zhuǎn)變?yōu)镃ys(-OH-SH)。現(xiàn)在已被蛋白工程所取代。 操作過(guò)程繁瑣復(fù)雜，一般用于基礎(chǔ)研究，但也可提高酶的穩(wěn)定性。 經(jīng)這種方法修飾后的蛋白酶和脂肪酶在洗滌劑工業(yè)中顯示出巨大潛力。 第四十