酶分離純化層析技術(shù)

1、關(guān)于酶的分離純化層析技術(shù)第一張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第四章 層析技術(shù)引言層析法的基本原理層析法的分類第二張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月引言層析法的發(fā)現(xiàn)與進(jìn)化歷史 思想第三張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月層析法的基本原理根據(jù)引言內(nèi)容,是否可以總結(jié)概括出層析法的基本原理？第四張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月層析法的分類第一節(jié) 吸附層析技術(shù)第二節(jié) 分配層析技術(shù)第三節(jié) 凝膠過濾層析技術(shù)第四節(jié) 離子交換層析法第五節(jié) 親和層析法第六節(jié) 高壓液相層析（HPLC）第五張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月引言1850年德國科學(xué)家朗格首先發(fā)現(xiàn)了色譜分離的現(xiàn)象

2、，當(dāng)他把一種有顏色的物質(zhì)滴到一張濾紙上，觀察到它們擴(kuò)散成一圈圈的圓環(huán)。探索與發(fā)現(xiàn) 1第六張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1906年俄國植物學(xué)家茨維特（Michael Tswett）: 將碳酸鈣細(xì)粉裝入玻璃瓶，石油醚抽提葉子的色素溶液傾入，接著倒入石油醚洗滌，柱上部出現(xiàn)了綠色的葉綠素，中間是黃色的葉黃素，而在下面則是胡蘿卜素橙黃色色帶叫作“色譜”，方法叫色譜法（Chromatography), 層析法 。探索與發(fā)現(xiàn) 2第七張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月概念:固定相, 流動(dòng)相,色譜柱現(xiàn)代色譜柱圖有誤Which is which?第八張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1

3、905-1930. Who cares! Why？1931年德國庫恩(Kuhn)重復(fù)了茨維特實(shí)驗(yàn),用氧化鋁和碳酸鈣分離了-,-,和-胡蘿卜素，此后用這種方法分離了60多種這類色素，1938年他從維生素B中分離出B6.1938年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。探索與發(fā)現(xiàn) 3Why not Tswett?論文發(fā)表在不知名的期刊上第九張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月相同時(shí)期發(fā)生在中國大地的事件1894年：中日甲午戰(zhàn)爭,侵占臺灣。1897年：德國侵占膠州灣。1900年：八國聯(lián)軍侵略中國。1914年：占領(lǐng)青島,奪取膠州灣。1931年：九一八事變,占領(lǐng)東北,建立滿州國。 1937年：盧溝橋事變。第十張，PPT共

4、九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1941年生物化學(xué)家Martin（馬?。┖蚐ynge（辛格）把色譜法應(yīng)用于氨基酸的分離。將淀粉作為色柱里的填料:淀粉色譜法濾紙作為載體: 紙色譜法覆蓋了吸附劑表面的并與流動(dòng)相不發(fā)生混溶的固定液來代替以前的固體吸附劑:Liquid-liquid(partition)Chromatography,LLC). 提出色譜塔板理論;預(yù)測氣相色譜;提出用細(xì)小顆粒作填料,而兩端可以加壓(HPLC).1952年：馬丁，辛格對分配層析的研究和發(fā)現(xiàn)，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)羊毛中的氨基酸分離探索與發(fā)現(xiàn) 4第十一張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月塔板理論將色譜柱看作一個(gè)分餾塔，待分離組分在

5、分餾塔的塔板間移動(dòng)，在每一個(gè)塔板內(nèi)不同組分分子在固定相和流動(dòng)相之間形成平衡，隨著流動(dòng)相的流動(dòng)，組分分子不斷從一個(gè)塔板移動(dòng)到下一個(gè)塔板，并不斷形成新的平衡 第十二張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月分配系數(shù), partition coefficient:在平衡狀態(tài)下，組分在固定相中的濃度和在流動(dòng)相中的濃度之比.例:將MgCl2溶解于辛醇和水的混合液體, 分別測量MgCl2在辛醇和水中的濃度,計(jì)算比值. 好溶解的分配系數(shù)小, 不好溶解的分配系數(shù)大.第十三張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1952年，馬丁同詹姆斯(James)，把LLC技術(shù)原理應(yīng)用在分離氣體上。各種氣體或蒸汽的混合物利

6、用氮或氦一類情性載氣的氣流通過吸收性固體的表面?；旌系臍怏w通過后,在另一端出現(xiàn)時(shí)就分開了。氣相色譜的產(chǎn)生(GC)探索與發(fā)現(xiàn) 5第十四張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月高效液相色譜(HPLC)的應(yīng)用20世紀(jì)60年代以來,氣相色譜作為分析方法已經(jīng)不能滿足對生物成分分析測試的要求。高效液相色譜采用了壓力泵及填有很細(xì)的顆粒高效色譜柱。High Performance Liquid Chromatography.探索與發(fā)現(xiàn) 6第十五張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月液相色譜與氣相色譜法比較 氣相液相對象氣體,沸點(diǎn)低液相,沸點(diǎn)高固定相固體,固體涂層液固體,固液流動(dòng)相惰性氣體,起運(yùn)載作用液體

7、，與組分可產(chǎn)生親和力環(huán)境高溫常溫應(yīng)用化工分析，環(huán)境生物分子，蛋白核酸，醫(yī)藥第十六張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月層析法的基本原理層析法是利用混合物中各組分物理、化學(xué)性質(zhì)（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等）的差異使各組分在兩相（固定相和流動(dòng)相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。 物理、化學(xué)性質(zhì)（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等）第十七張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 （1）按流動(dòng)相狀態(tài)分類： 液相色譜 液-固層析 液-液層析 氣相色譜 氣-固層析 氣-液層析層析法的分類兩種固定相：(固定相不一定是固體)*固體吸附劑

8、作為固定相*吸附在固體上的液體（硅膠吸附的水作固定相，以氯仿作流動(dòng)相，分離羊毛中的氨基酸 ）第十八張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）按層析原理分類：吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能 的差異，達(dá)到分離鑒定的目的。分配層析：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間 的分配系數(shù)（或溶解度）不同。離子交換層析:利用不同組分對離子交換劑親和 力的不同。凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組 分阻滯作用的不同。第十九張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方 向移動(dòng)而達(dá)到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流 動(dòng)

9、相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，類 似紙層析。第二十張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月層析技術(shù)第一節(jié) 吸附層析技術(shù)第二節(jié) 分配層析技術(shù)第三節(jié) 凝膠過濾層析技術(shù)第四節(jié) 離子交換層析法第五節(jié) 親和層析法第六節(jié) 高壓液相層析（HPLC）第二十一張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 吸附層析技術(shù)吸附柱層析薄層層析聚酰胺薄膜層析疏水層析第二十二張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月吸附柱層析吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機(jī)溶劑或緩沖液為流動(dòng)相構(gòu)成柱狀的一種層析方法。常用的吸附劑有羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁、人造沸石和活性炭等。這種層析方法

10、已成為科研、醫(yī)學(xué)、化工及發(fā)酵等部門常規(guī)使用的一種分離手段。第二十三張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月吸附柱層析一、常用術(shù)語1.層析：以基質(zhì)為固定相（柱狀或薄層狀），以液體或氣體為流動(dòng)相，有效成分和雜質(zhì)在這兩個(gè)相中連續(xù)多次地進(jìn)行分配、吸附、交換作用，最終結(jié)果是使混合物得到分離。第二十四張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月吸附柱層析一、常用術(shù)語2.洗脫體積（Ve）：是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)到最大值時(shí)的流動(dòng)相體積。第二十五張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十六張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 吸附層析技術(shù)吸附柱層析吸附薄層層析聚酰胺薄膜

11、層析疏水層析第二十七張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月薄層層析(TLC)薄層層析是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固定相，以液體為流動(dòng)相的一種層析方法。薄層層析可根據(jù)固定相的種類分為吸附薄層層析（吸附劑為固定相）、分配薄層層析（固定在支持劑上的水溶液或有機(jī)溶劑為固定相）和離子交換薄層層析（離子交換劑為固定相）等。第二十八張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月薄層層析薄層層析的優(yōu)點(diǎn)：1.展層時(shí)間短，薄層層析分離混合物一般 僅需15-60min；2.設(shè)備簡單，操作方便，既適用于分析，也適用于制備；3.靈敏度高。第二十九張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十張，PPT共九十

12、五頁，創(chuàng)作于2022年6月薄層層析第三十一張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月紙色譜法（分配TLC，纖維結(jié)構(gòu)，固定相是纖維-水）第三十二張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月吸附TLC固定相是硅膠，氧化鋁等，層析是依據(jù)吸附力不同第三十三張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十四張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第三章 層析技術(shù)第一節(jié) 吸附層析技術(shù)第二節(jié) 分配層析技術(shù)第三節(jié) 凝膠過濾層析技術(shù)第四節(jié) 離子交換層析法第五節(jié) 親和層析法第六節(jié) 高壓液相層析（HPLC)第三十五張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié)分配層析技術(shù)分配層析法（液-液層析法，LLC）原理：利

13、用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動(dòng)相）之間的分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離各組分的目的。固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流動(dòng)相流過固定相。分配系數(shù)：當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在流動(dòng)相和固定相兩相內(nèi)的濃度之比是個(gè)常數(shù)，稱為分配系數(shù)。 K=c1/c2分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動(dòng)相中的分配的數(shù)量多，移動(dòng)慢 ；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相分配的數(shù)量多，移動(dòng)快。因此可彼此分開。hH第三十六張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（分配TLC，纖維結(jié)構(gòu)，固定相是纖維-水）紙色譜法第三十七張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第四章 層析技術(shù)第一節(jié) 吸附層析技術(shù)第二節(jié) 分配層析技術(shù)第三節(jié) 凝膠過

14、濾層析技術(shù)第四節(jié) 離子交換層析法第五節(jié) 親和層析法第六節(jié) 高壓液相層析（HPLC)第三十八張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 凝膠過濾層析技術(shù)一、基本原理 概念：當(dāng)生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時(shí)，因分子大小不同而分離。又名分子篩層析。第三十九張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月原理：凝膠顆粒為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 混合物流過時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動(dòng)速度較慢，最后被洗脫出來。吸收 洗脫體積 ml凝膠第四十張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6

15、月固定相與流動(dòng)相： 凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，流動(dòng)相是流動(dòng)的洗脫液。排阻極限： 指不能進(jìn)入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最小分子的分子量。排阻極限為30000表示30000Da的分子將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。3. 凝膠顆粒大小常以目數(shù)(mesh)或者顆粒直徑(mm)來表示。分辨率和流速都與凝膠顆粒大小有關(guān)。顆粒大，流速快，但分離效果差；顆粒小，分離效果較好，但流速慢。100目0.250毫米。 二 、常用概念第四十一張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、凝膠的種類和性質(zhì) 1.交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex) 1) Sephadex G (Sephadex G-25；Sephade

16、x G-50) G后的數(shù)字為凝膠吸水率（單位是ml/g干膠）的10倍。 2）Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 溶于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。第四十二張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月交聯(lián)葡聚糖凝膠是由葡聚糖和甘油基通過醚橋交聯(lián)而成的。第四十三張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.瓊脂糖凝膠（Sepharose ；Bio-Gel) 依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度 越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。 3.Superdex 是由高交聯(lián)度多孔瓊脂糖與葡聚糖共價(jià)結(jié)合而成 的。分辨率非常高，化學(xué)物理穩(wěn)定性也很好 。 4.聚丙烯酰胺

17、凝膠 一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉 雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。 商品名為生物膠-P（Bio-Gel P)。第四十四張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠技術(shù)參數(shù)指標(biāo)凝膠型號：如SephadexG-10;G-25;粒度范圍：100-200mesh床體積（ml/g）:每克干膠溶漲后的體積有效分離范圍：如1x1031x107工作pH: 4-12最大流速：1 ml/min最大承受壓力: 2MPa第四十五張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、凝膠的選擇和保存1. 凝膠的選擇例如樣品中各個(gè)組分差別較大，則可以選用大顆粒的凝膠，這樣可以很快的達(dá)到分離的目的；

18、如果有個(gè)別組分差別較小，則要考慮使用小顆粒凝膠以提高分辨率。第四十六張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 凝膠的保存凝膠的保存一般是反復(fù)洗滌去除蛋白等雜質(zhì)，然后加入適當(dāng)?shù)目咕鷦ǔ＜尤?.02的疊氮化鈉, 或20%酒精,4C下保存。第四十七張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、 凝膠過濾在試驗(yàn)室中的應(yīng)用1）生物大分子物質(zhì)的分離純化2）分子量的測定3）脫鹽及去除小分子雜質(zhì)4）溶液濃縮5）去熱源物質(zhì)第四十八張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月LogMABCLogM測Ve蛋白質(zhì)通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān)， LogM=（k1-k2）Ve（Ve為洗脫體積）先測得幾

19、種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。第四十九張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第四章 層析技術(shù)第一節(jié) 吸附層析技術(shù)第二節(jié) 分配層析技術(shù)第三節(jié) 凝膠過濾層析技術(shù)第四節(jié) 離子交換層析法第五節(jié) 親和層析法第六節(jié) 高壓液相層析（HPLC)第五十張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、原理:是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法 。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。 第四節(jié) 離子交換層析法纖維素 O CH2 COO

20、-Na+圖 纖維素陽離子交換劑組成示意圖第五十一張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月離子交換層析的基本原理示意圖+第五十二張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、離子交換基質(zhì)的分類及常見種類：（一）分類 陽離子交換劑：磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2 ）、 羧酸（- COOH）、酚羥基（-OH）等 陰離子交換劑：伯胺（-NH2OH）、仲胺（-NHCH3OH ）、 叔胺（-N（CH3）2OH）、季胺（-N（CH3）3OH）等 （二）種類 1）樹脂型離子交換劑 2）纖維素離子交換劑 3）交聯(lián)葡聚糖離子交換劑 4）瓊脂糖離子交換劑第五十三張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三

21、、離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生也可室內(nèi)瓶裝保存。如離子交換纖維素可用2mol/LNaCl淋洗柱，若有強(qiáng)吸附物則可用0.1mol/L NaOH洗柱；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序?yàn)椋?.5mol/L NaOH-水-乙醇-水-20NaOH-水。保存離子交換劑時(shí)要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002洗必泰，陽離子交換劑可用0.02疊氮鈉。第五十四張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、離子交換層析的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用除去離子（純凈水） 聚苯乙烯樹脂廣泛的應(yīng)用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面 分離純化改變成分（青霉素-Na青霉素-K ）濃

22、縮與提?。股?、蛋白質(zhì)、工業(yè)廢液中微量金屬的提取）離子型化合物分離發(fā)展：自動(dòng)化方向與光譜技術(shù)結(jié)合專門用途的綜合性自動(dòng)分析儀與計(jì)算機(jī)相連進(jìn)行自動(dòng)分析與自動(dòng)控制第五十五張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第四章 層析技術(shù)第一節(jié) 吸附層析技術(shù)第二節(jié) 分配層析技術(shù)第三節(jié) 凝膠過濾層析技術(shù)第四節(jié) 離子交換層析法第五節(jié) 親和層析法第六節(jié) 高壓液相層析（HPLC）第五十六張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月原理： 利用生物大分子間特異的親和能力來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體等。親和層析包括三個(gè)共價(jià)結(jié)合的組分：不溶性的基質(zhì)（matrix ）、一個(gè)間隔臂（sp

23、acer）及特異的配基（ligands）第五節(jié) 親和層析法目前親和層析技術(shù)主要運(yùn)用在實(shí)驗(yàn)室中第五十七張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 第五十八張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十九張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Fraction and monitoringVolume of eluentAbsorbanceFractions1 2 3 4 5 6 7 8 9第六十張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月An actual example for gel-filtrationSDSanalysis第六十一張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第四章 層析技

24、術(shù)第一節(jié) 吸附層析技術(shù)第二節(jié) 分配層析技術(shù)第三節(jié) 凝膠過濾層析技術(shù)第四節(jié) 離子交換層析法第五節(jié) 親和層析法第六節(jié) 高壓液相層析（HPLC)第六十二張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第六節(jié) 高壓液相層析（HPLC）特點(diǎn)： 使用的固相支持劑顆粒很細(xì)，表面積很大,因而分辨率很高.（顆粒細(xì)，理論塔板數(shù)多） 溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。（顆粒硬度大、流速快，耐高壓） 重復(fù)性好 色譜柱可以反復(fù)使用 自動(dòng)化操作，分析精確度高許多類型的柱層析都可用HPLC來代替，如分配層析、離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾等。第六十三張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月分類 正相色譜法： 共價(jià)結(jié)合到載體

25、上的集團(tuán)都是極性的集團(tuán)，流動(dòng)相的極性比固定相的極性弱。在這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動(dòng)的速度 ，先從柱中流出來。反相色譜法 共價(jià)結(jié)合到載體上的集團(tuán)是一些直鏈碳?xì)浠衔铮鲃?dòng)相的極性比固定相的極性強(qiáng)。在這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子移動(dòng)的速度 而先從柱中流出。 快快第六十四張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一般來說，分離純化極性大的分子（帶電離子等）采用正相色譜（或正相柱），而分離純化極性小的有機(jī)分子（有機(jī)酸、醇、酚等）多采用反相色譜（或反相柱）。 實(shí)踐中，一種物質(zhì)如蛋白的分離純化往往不是單一實(shí)驗(yàn)技術(shù)能夠達(dá)到的。What does this mean

26、？第六十五張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十六張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十七張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月層析基本原理固相，流動(dòng)相，色譜柱的概念洗脫體積，洗脫曲線的概念凝膠過濾層析 高壓液相層析離子交換層析 親和層析 吸附層析 分配層析 (薄層層析 )第六十八張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月吸附柱層析一、常用術(shù)語1.固定相：是由層析基質(zhì)組成的。其基質(zhì)包括固體物質(zhì)（如吸附劑、離子交換劑）和液體物質(zhì)（如固定在纖維素或硅膠上的溶液），這些物質(zhì)能與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆的吸附、溶解和交換作用。2.流動(dòng)相：在層析過程中推動(dòng)固定相上的物質(zhì)向一定方向移動(dòng)

27、的液體或氣體稱為流動(dòng)相。在柱層析時(shí)，流動(dòng)相又稱洗脫液或洗滌劑。在薄層層析時(shí)流動(dòng)相又稱展層劑。第六十九張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月吸附柱層析一、常用術(shù)語2.操作容量：即在特定條件下，某成分與基質(zhì)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量。一般以每克（或毫升）基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)或毫克數(shù)來表示。其數(shù)值大，表明基質(zhì)對某種成分的結(jié)合力強(qiáng)，否則反之。第七十張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月吸附柱層析二、基本原理吸附層析法（液-固層析法，LSC） 原理：利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解度的差異進(jìn)行分離。成分的極性決定于其分子中所含官能基團(tuán)的極性和分

28、子結(jié)構(gòu)，物質(zhì)的極性越大則越容易被固體吸附劑(硅膠或氧化鋁)吸附。特點(diǎn)：適合分離不同種類（例如分離醇和芳香烴）的化合物。第七十一張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、吸附劑1.吸附劑的選擇及預(yù)處理：活性多孔固體，表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)和成本低廉等性能。常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰石等。羥基羥基磷灰石（HA）Ca10(PO4)6.(OH)2,可用于分離蛋白質(zhì)、酶、核酸及病毒等生命物質(zhì)。其表面有Ca2+和PO43-兩種帶電基團(tuán)。羥基磷灰石層析在實(shí)驗(yàn)室中最大的用途是分離雙鏈DNA和單鏈DNA。亦可除去混合物中的DNA。第七十二張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于20

29、22年6月三、吸附劑硅膠(Silica gel)：略帶酸性，適用于酸性與中性樣品之分離，堿性樣品容易產(chǎn)生反應(yīng)或拖尾。A.含水量活性硅膠是多孔的、表面含有很多硅醇基團(tuán)（-Si-OH）顆粒狀極性吸附劑。含水量高時(shí)，則結(jié)合力?。ɑ蚧钚孕。.粒度供層析用的氧化鋁，用于拄層析的，其粒度要求在100160目之間。粒度大子100目，分離效果差：小于160目，溶濃流速大慢，易使譜帶擴(kuò)散。樣品與氧化鋁的用量比，一般在1：2050之間層析柱的內(nèi)徑與柱長比例在1：10-20之向。第七十三張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、吸附劑活性炭(Silica gel)：是使用較多的一種非極性吸附劑。一般需要先用

30、稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于80干燥后即可供層析用。層析用的活性炭，最好選用顆粒活注炭，若為活性炭細(xì)粉，則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱，以免流速太慢?；钚蕴恐饕糜诜蛛x水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些甙?；钚蕴康奈阶饔?，在水溶液中最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力最弱，而有機(jī)溶劑則較強(qiáng)。例如以醇-水進(jìn)行洗脫時(shí)，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加?；钚蕴繉Ψ枷阕寤衔锏奈搅Υ笥谥咀寤衔?，對大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開，單糖與多糖分開，氨基酸與多肽分開。第七十四張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6

31、月吸附原理: 吸附劑與被吸附物質(zhì)之間的吸引力是范德華力，作用可逆第七十五張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第七十六張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月吸附層析的應(yīng)用氨基酸、肽、糖類、脂類、苷（皂苷）類物質(zhì)的分離、鑒定純凈水、醫(yī)藥用水的制備藥液脫色第七十七張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月薄層層析一、操作及注意事項(xiàng)： 一般層析操作包括薄板制備、點(diǎn)樣、展層、顯色、Rf值測定和結(jié)果分析等步驟。1.薄層板的制備(1)硅膠的分類：硅膠G系含有10%15%鍛石膏和5%淀粉的硅膠，黏性好；硅膠CMC系含有適量羧甲基纖維素的硅膠；硅膠HF254系含有熒光劑的硅膠H；第七十八張，PPT共九

32、十五頁，創(chuàng)作于2022年6月薄層層析(Thin layer chromatography)一、操作及注意事項(xiàng)： 一般層析操作包括薄板制備、點(diǎn)樣、展層、顯色、Rf值測定和結(jié)果分析等步驟。1.薄層板的制備(2)硅膠薄層板的制備玻板：洗凈；20cm20cm； 6cm20cm制板：涂布方法(玻棒涂布法、有機(jī)玻璃尺涂布法、半機(jī)械涂布法)；注意事項(xiàng)：顆粒均勻細(xì)小(200目)；厚度均一適中(0.25mm-0.5mm-1mm)；2.點(diǎn)樣(2mm) 3.展層 4.顯色第七十九張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月聚酰胺薄膜層析1966年之后發(fā)展起來的一種層析方法；特別應(yīng)該指出的是，用此法分析氨基酸衍生物DN

33、P-氨基酸、PTH-氨基酸、DNS-氨基酸時(shí)，具有靈敏度高、分辨力強(qiáng)、展層迅速和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)?？捎糜诜宇悺Ⅴ?、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸堿基、核苷、核苷酸、雜環(huán)化合物、合成染料、磺胺、抗菌素、環(huán)酮、維生素B和殺蟲劑 等16類化合物。第八十張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Gas ChromatographyUsed to determine the chemical composition of unknown substances, such as the different compounds in gasoline shown by each separate pea

34、k in the graph below.Liquid ChromatographyUsed to identify unknown plant pigments & other compounds.Examples of Chromatography第八十一張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Paper ChromatographyCan be used to separate the components of inks, dyes, plant compounds (chlorophyll), make-up, and many other substancesThin-Layer ChromatographyUses thin plastic or glass trays to identify the composition of pigments, chemicals, and other unknown substances.第八十二張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月聚酰胺薄膜層析基本原理：聚酰胺對極性物質(zhì)的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強(qiáng)弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。由己二酸與己二胺聚合而成第八十三張，PPT共九十五頁，創(chuàng)作于2022年6月疏水層