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1、第3章 酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(2學(xué)主要內(nèi)容: 3.1 酶催化反應(yīng)速度 3.2 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響 3.3 抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響 3.4 其它因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響Page 1酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)也稱酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(kinetics of enzyme-catalyzed reactions),是研究酶促反應(yīng)速度以及影響此速度的各種因素的科學(xué)。在研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及酶的作用機(jī)制時(shí),需要酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)證據(jù);為了找到最有利的反應(yīng)條件從而提高酶催化反應(yīng)的效率以及了解酶在代謝過(guò)程中的作用和某些藥物的作用機(jī)制等,也需要我們掌握酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的相關(guān)規(guī)律。因此,對(duì)于酶促反應(yīng)動(dòng)力
2、學(xué)的研究既有要的理論意義又具有相當(dāng)?shù)膶?shí)踐價(jià)值。2酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以化學(xué)動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ),通過(guò)對(duì)酶促反應(yīng)速度的測(cè)定來(lái)討論諸如底物濃度、抑制劑、溫度、pH和激活劑等因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響。酶的動(dòng)力學(xué)研究包括哪些內(nèi)容 ?重 要3溫度、pH及激活劑都會(huì)對(duì)酶促反應(yīng)速度產(chǎn)生十分重要的影響,酶促反應(yīng)不但需要最適溫度和最適pH,還要選擇合適的激活劑。而且在研究酶促反應(yīng)速度以及測(cè)定酶的活力時(shí),都應(yīng)選擇相關(guān)酶的最適反應(yīng)條件。43.1酶催化反應(yīng)速度如果我們以產(chǎn)物生成量(或底物減少量)來(lái)對(duì)反應(yīng)時(shí)間作圖,便可以得到如圖3-1所示的曲線圖。5圖3-1 酶促反應(yīng)的速度曲線該曲線的斜率表示單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物生成量的變化,因此曲線上任
3、何一點(diǎn)的斜率就是相應(yīng)橫坐標(biāo)上時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)速度。從圖中的曲線可以看出在反應(yīng)開(kāi)始的一段時(shí)間內(nèi)斜率幾乎不變,然而隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),曲線逐漸變平坦,相應(yīng)的斜率也漸漸減小,反應(yīng)速度逐漸降低,顯然這時(shí)測(cè)得的反應(yīng)速度不能代表真實(shí)的酶活力。6引起酶促反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而降低的原因很多,如底物濃度的降低、產(chǎn)物濃度增加從而加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行、產(chǎn)物對(duì)酶的抑制或激活作用以及隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)引起酶本身部分分子失活等等。因此在測(cè)定酶活力時(shí),應(yīng)測(cè)定酶促反應(yīng)的初速度,從而避免上述各種復(fù)雜因素對(duì)反應(yīng)速度的影響。由于反應(yīng)初速度與酶量呈線性關(guān)系,因此可以用測(cè)定反應(yīng)初速度的方法來(lái)測(cè)定相關(guān)制劑中酶的含量。7酶活力測(cè)定時(shí)需注意:
4、1 選擇反應(yīng)的最適溫度,根據(jù)不同的底物和緩沖液選擇反應(yīng)的最適pH。2 速度要快,取反應(yīng)的初速度3 底物濃度要足夠大(一般在10Km以上)使酶被底物飽和,以充分反應(yīng)待測(cè)酶的活力8測(cè)定酶活力的基本原理:酶蛋白的含量很低,很難直接測(cè)定其蛋白質(zhì)的含量,且常與其他各種蛋白質(zhì)混合存在,將其提純耗時(shí)費(fèi)力。故不能直接用重量或體積等指標(biāo)來(lái)衡量。測(cè)定產(chǎn)物增加量測(cè)定底物減少量9測(cè)定酶活力常用的方法:分光光度法(spectrophotometry)熒光法(fluorometry)同位素法(isotope method)電化學(xué)方法(electrochemical method)其他方法:如旋光法、量氣法、量熱法和層析法
5、等103.2 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)也稱酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō),最早是由Henri和Wurtz兩位科學(xué)家提出的。在1903年,Henri在用蔗糖酶水解蔗糖實(shí)驗(yàn)研究化學(xué)反應(yīng)中底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)酶濃度不變時(shí),可以測(cè)出一系列不同底物濃度下的化學(xué)反應(yīng)速度,以該反應(yīng)速度對(duì)底物濃度作圖,可得到如圖3-2所示的曲線。 11圖3-2 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響12從該曲線圖可以看出,當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí),反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系呈正比關(guān)系,反應(yīng)表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)。然而隨著底物濃度的不斷增加,反應(yīng)速度不再按正比升高,此時(shí)反應(yīng)表現(xiàn)為混合級(jí)反應(yīng)。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到相當(dāng)高時(shí),底物
6、濃度對(duì)反應(yīng)速度影響逐漸變小,最后反應(yīng)速度幾乎與底物濃度無(wú)關(guān),這時(shí)反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度(Vmax),反應(yīng)表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。13根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果,Henri和Wurtz提出了酶促化學(xué)反應(yīng)的酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為:當(dāng)酶催化某一化學(xué)反應(yīng)時(shí),酶(E)首先需要和底物(S)結(jié)合生成酶底物中間絡(luò)合物即中間復(fù)合物(ES),然后再生成產(chǎn)物(P),同時(shí)釋放出酶。該學(xué)說(shuō)可以用下面的化學(xué)反應(yīng)方程式來(lái)表示: S + E ES P + E14我們根據(jù)中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)很容易解釋圖3-2所示的實(shí)驗(yàn)曲線,在酶濃度恒定這一前提條件下,當(dāng)?shù)孜餄舛群苄r(shí)酶還未被底物所飽和,這時(shí)反應(yīng)速度取決于底物濃度并與之成正比。隨著底物濃度不斷
7、增大,根據(jù)質(zhì)量作用定律,中間復(fù)合物ES生成也不斷增多,而反應(yīng)速度取決于ES的濃度,故反應(yīng)速度也隨之增高但此時(shí)二者不再成正比關(guān)系。15當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到相當(dāng)高的程度時(shí),溶液中的酶已經(jīng)全部被底物所飽和,此時(shí)溶液中再也沒(méi)有多余的酶,雖增加底物濃度也不會(huì)有更多的中間復(fù)合物ES生成,因此酶促反應(yīng)速度變得與底物濃度無(wú)關(guān),而且反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度(Vmax)。當(dāng)我們以底物濃度S對(duì)反應(yīng)速度v作圖時(shí),就形成一條雙曲線。在此需要特別指出的是,只有酶促催化反應(yīng)才會(huì)有這種飽和現(xiàn)象,而與此相反,非催化反應(yīng)則不會(huì)出現(xiàn)這種飽和現(xiàn)象。16酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程式(米氏方程) 1913年Michaelis和Menten兩位科學(xué)家在前
8、人工作的基礎(chǔ)上,根據(jù)酶促反應(yīng)的中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō),推導(dǎo)出一個(gè)數(shù)學(xué)方程式,用來(lái)表示底物濃度與酶反應(yīng)速度之間的量化關(guān)系,通常把這個(gè)數(shù)學(xué)方程式稱為米氏方程:其中Km稱為米氏常數(shù) 17米氏常數(shù)的含義Km值就代表著反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。 18米氏常數(shù)的應(yīng)用價(jià)值Km是酶的一個(gè)特征性常數(shù):也就是說(shuō)Km的大小只與酶本身的性質(zhì)有關(guān),而與酶濃度無(wú)關(guān)。 Km值還可以用于判斷酶的專一性和天然底物,Km值最小的底物往往被稱為該酶的最適底物或天然底物。Km可以作為酶和底物結(jié)合緊密程度的個(gè)度量指標(biāo),用來(lái)表示酶與底物結(jié)合的親和力大小。已知某個(gè)酶的Km值,就可以計(jì)算出在某一底物濃度條件下,其反應(yīng)速度相當(dāng)于Vma
9、x的百分比。 Km值還可以幫助我們推斷具體條件下某一代謝反應(yīng)的方向和途徑,只有Km值小的酶促反應(yīng)才會(huì)在競(jìng)爭(zhēng)中占優(yōu)勢(shì)。 193.3抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì),凡可使酶蛋白變性而引起酶活力喪失的作用都稱為失活作用(inactivation)。如果由于酶必需基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變,但酶并未發(fā)生變性,而引起酶活力降低或喪失的作用則稱為抑制作用(inhibition)。導(dǎo)致酶發(fā)生抑制作用的物質(zhì)稱為抑制劑(inhibitor)。20由于抑制作用與變性作用從本質(zhì)而言是不同的,因此與變性劑對(duì)酶的變性作用無(wú)選擇性不同的是,抑制劑對(duì)酶的抑制作用是有選擇性的,即一種抑制劑只能使某一種酶或?qū)δ骋活?/p>
10、酶產(chǎn)生抑制作用。21對(duì)酶抑制作用的探討是研究酶的結(jié)構(gòu)與功能、酶的催化機(jī)制以及闡明機(jī)體代謝途徑的基本手段,也可以為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中設(shè)計(jì)新藥物和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中設(shè)計(jì)新農(nóng)藥提供重要的理論依據(jù),從這個(gè)角度而言,對(duì)酶抑制作用的研究不僅具有重要的理論意義,而且具有突出的實(shí)踐價(jià)值。223.3.1抑制作用的類型根據(jù)抑制劑與酶的作用方式的區(qū)別以及抑制作用是否可逆,我們可以將抑制作用分為兩大類,即:不可逆的抑制作用可逆的抑制作用。233.3.1.1 不可逆的抑制作用由于抑制劑與酶的必需基團(tuán)以共價(jià)鍵的形式結(jié)合而引起酶活力降低或喪失,因此不能用透析、超濾等物理方法去除抑制劑而使酶復(fù)活,這種抑制作用是不可逆的,我們稱之為不可逆抑制
11、。此時(shí)被抑制的酶分子受到抑制劑對(duì)其不同程度的化學(xué)修飾,因此不可逆抑制從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)就是酶的修飾抑制。24不可逆抑制劑 通常把不可逆抑制劑分為兩種類型,即非專一性不可逆抑制劑和專一性不可逆抑制劑。25非專一性不可逆抑制劑 主要包括以下六大類:a)有機(jī)磷化合物b)有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物:抑制含巰基的酶。c)重金屬鹽:能使酶蛋白變性而失活。d)烷化劑:與酶必需基團(tuán)中的巰基、氨基、羧基、咪唑基和硫醚基等結(jié)合,從而抑制酶活性。e)硫化物、氰化物和CO:這類物質(zhì)能通過(guò)與酶中金屬離子形成較為穩(wěn)定絡(luò)合物的形式,來(lái)抑制酶的活性。f)青霉素(Penicillin):青霉素可通過(guò)與糖肽轉(zhuǎn)肽酶活性部位絲氨酸羥基共價(jià)結(jié)合的
12、方式,使糖肽轉(zhuǎn)肽酶失活,導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁合成受阻,從而損害細(xì)菌生長(zhǎng)。26專一性不可逆抑制劑 可以分為Ks型和Kat型兩大類。a)Ks型不可逆抑制劑:具有與底物相類似的結(jié)構(gòu)b)Kat型不可逆抑制劑:該類抑制劑不但具有與天然底物相類似的結(jié)構(gòu),而且抑制劑本身也是酶的底物,這類不可逆抑制劑的特點(diǎn)是專一性極高,因此也被稱為自殺性底物(suicide substrate)。273.3.1.2 可逆的抑制作用由于抑制劑與酶以非共價(jià)鍵的形式結(jié)合而引起酶活力降低或喪失,但是能用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復(fù)活,這種抑制作用是可逆的,我們稱之為可逆抑制(reversible inhibition)。28根據(jù)
13、可逆抑制劑與底物的關(guān)系,我們將可逆抑制作用分為三種類型,它們分別是競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。29競(jìng)爭(zhēng)性抑制(competitive inhibition) :是最常見(jiàn)的一種可逆抑制作用。抑制劑(I)與底物(S)競(jìng)爭(zhēng)酶(E)的同一結(jié)合部位,因此抑制劑的存在直接影響底物與酶的正常結(jié)合。這是由于酶的活性部位不能同時(shí)既與底物結(jié)合又與抑制劑結(jié)合,所以在底物和抑制劑之間會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng),從而形成一定的平衡關(guān)系。30對(duì)于絕大多數(shù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑而言,其結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)十分類似,因此也能與酶的活性部位結(jié)合形成可逆的酶-抑制劑復(fù)合物EI,但酶-抑制劑復(fù)合物EI不能分解成產(chǎn)物P,導(dǎo)致相應(yīng)的酶促反應(yīng)速度下降。其抑
14、制程度取決于底物和抑制劑的相對(duì)濃度,可以通過(guò)增加底物濃度的方法來(lái)解除這種抑制作用。這類抑制最典型的例子是丙二酸和戊二酸競(jìng)爭(zhēng)與琥珀酸脫氫酶結(jié)合,但不能催化脫氫反應(yīng)。31非競(jìng)爭(zhēng)性抑制(noncompetitive inhibition) :這類抑制作用的特點(diǎn)是底物(S)和抑制劑(I)可以同時(shí)與酶(E)結(jié)合,兩者之間不存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。但是在酶與抑制劑結(jié)合后,還可以進(jìn)一步與底物結(jié)合形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI;酶與底物結(jié)合后,也可以進(jìn)一步與抑制劑結(jié)合形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI。但是這種中間的三元復(fù)合物,即酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解產(chǎn)生產(chǎn)物,因此相應(yīng)的酶促反應(yīng)速度下降。32由于這
15、類抑制劑與酶活性部位以外的基團(tuán)相結(jié)合,因此其結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)并無(wú)相似之處,而且不能用增加底物濃度的方法來(lái)解除這種抑制作用,故稱非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。這類抑制最典型的例子是亮氨酸是精氨酸酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。還有某些重金屬離子如Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等對(duì)酶的抑制作用也屬于這一類。33反競(jìng)爭(zhēng)性抑制(uncompetitive inhibition) :這類抑制作用的特點(diǎn)是只有在酶(E)與底物(S)結(jié)合后,才能與抑制劑(I)結(jié)合,形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI,與非競(jìng)爭(zhēng)性抑制相似,這種中間的三元復(fù)合物,即酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解產(chǎn)生產(chǎn)物,因此相應(yīng)的酶促反應(yīng)速度下降。34這種
16、抑制作用在單底物反應(yīng)中比較少見(jiàn),而常見(jiàn)于多底物反應(yīng)中。目前已經(jīng)證明,肼類化合物對(duì)胃蛋白酶的抑制作用、氰化物對(duì)芳香硫酸酯酶的抑制作用、L-Phe和L-同型精氨酸等多種氨基酸對(duì)堿性磷酸酶的抑制作用都屬于反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。35圖3-3酶與底物或抑制劑結(jié)合的中間物363.3.2可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鑒別鑒別可逆抑制作用和不可逆抑制作用,除了用透析、超濾和凝膠過(guò)濾等物理方法能否除去抑制劑來(lái)判斷外,還可采用化學(xué)動(dòng)力學(xué)的方法來(lái)區(qū)分。37圖3-4 可逆抑制劑與不可逆抑制劑的區(qū)別(一)曲線1,無(wú)抑制劑;曲線2,不可逆抑制劑;曲線3,可逆抑制劑38在測(cè)定酶活力的系統(tǒng)中加入一定量的抑制劑,然后測(cè)定不同酶濃度條件
17、下的酶促反應(yīng)初速度,以酶促反應(yīng)初速度對(duì)酶濃度作圖。在測(cè)定酶活力的系統(tǒng)中不加抑制劑時(shí),以酶促反應(yīng)初速度對(duì)酶濃度作圖得到如圖3-4曲線1所示的一條通過(guò)原點(diǎn)的直線;當(dāng)測(cè)定酶活力的系統(tǒng)中加入一定量的不可逆抑制劑時(shí),由于抑制劑會(huì)使一定量的酶失活,因此只有加入的酶量大于不可逆抑制劑的量時(shí),才表現(xiàn)出酶活力。39以酶促反應(yīng)初速度對(duì)酶濃度作圖得到如圖3-4曲線2所示的一條與曲線1平行的相交于橫坐標(biāo)正側(cè)的直線,所以不可逆抑制劑的作用相當(dāng)于把原點(diǎn)向右移動(dòng);當(dāng)測(cè)定酶活力的系統(tǒng)中加入一定量的可逆抑制劑時(shí),由于抑制劑的量是恒定的,因此以酶促反應(yīng)初速度對(duì)酶濃度作圖得到如圖3-4曲線3所示的一條通過(guò)原點(diǎn),但斜率較低于曲線1的
18、直線。403.3.3可逆抑制作用動(dòng)力學(xué)對(duì)于可逆抑制劑與酶結(jié)合后產(chǎn)生的抑制作用,可以根據(jù)米氏學(xué)說(shuō)基本原理加以推導(dǎo),來(lái)定量說(shuō)明可逆抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響,下面著重討論三種類型可逆抑制作用的化學(xué)動(dòng)力學(xué)。413.3.3.1 競(jìng)爭(zhēng)性抑制在競(jìng)爭(zhēng)性抑制中,底物(S)或抑制劑(I)與酶(E)的結(jié)合都是可逆的,因此存在著如下的化學(xué)平衡式:42在加入競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑后,Vmax不變,Km變大,KmKm,而且Km隨抑制劑濃度I的增加而增加。抑制分?jǐn)?shù)與抑制劑濃度I成正比,而與成反應(yīng)物濃度S反比。雙倒數(shù)作圖所得直線相交于縱軸,這就是競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的特點(diǎn)。43圖3-5 競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線443.3.3.2 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制在非競(jìng)
19、爭(zhēng)性抑制中,抑制劑(I)與酶(E)或酶-底物復(fù)合物(ES)以及底物(S)與酶-抑制劑復(fù)合物(EI)的結(jié)合都是可逆的,因此存在著如下的化學(xué)平衡式:45在加入非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑后,Km值不變,Vmax變小,而且Km= Km,Vmax隨I的增加而減小。抑制分?jǐn)?shù)與抑制劑濃度I成正比,而與底物濃度S無(wú)關(guān),即I不變時(shí),任何S的抑制分?jǐn)?shù)是一個(gè)常數(shù)。雙倒數(shù)作圖所得直線相交于橫軸,這是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的特點(diǎn)。46圖3-6 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線473.3.3.3 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)是,酶(E)必須先與底物(S)結(jié)合,然后才與抑制劑(I)結(jié)合,即抑制劑(I)與酶-底物復(fù)合物(ES)的結(jié)合是可逆的,因此存在著如下
20、的化學(xué)平衡式:48在加入反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑后,Km及Vmax都變小,而且KmKm,VmaxVmax,即表觀Km及表觀Vmax,都隨I的增加而減小。抑制分?jǐn)?shù)既與抑制劑濃度I成正比,也與底物濃度S成正比。雙倒數(shù)作圖為一組平行線,這是反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的特點(diǎn)。49圖3-7 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線50為了方便理解和記憶,我們現(xiàn)將無(wú)抑制劑和有抑制劑等不同情況下的米氏方程和Vmax及Km的變化總結(jié)歸納在表3-1中。51為了便于比較三種抑制類型的區(qū)別,我們可以用Dixon作圖法求Ki,只要以抑制劑濃度I為橫坐標(biāo),以酶促反應(yīng)速度的倒數(shù)1/v為縱坐標(biāo),采用一個(gè)以上的底物濃度S,然后給出不同S時(shí)的直線,再由這些直線的交點(diǎn)即可
21、以得到Ki,如圖3-8所示。 52圖3-8 Dixon作圖法求Ki(S2S1)A. 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制 B. 競(jìng)爭(zhēng)性抑制 C. 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制533.4 其它因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響其它各種影響酶促反應(yīng)速度的因素主要包括溫度、pH和激活劑等。543.4.1溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響和絕大多數(shù)化學(xué)反應(yīng)一樣,酶促化學(xué)反應(yīng)速度也和溫度密切相關(guān)。溫度對(duì)酶促化學(xué)反應(yīng)速度的影響主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面,其一是當(dāng)溫度升高時(shí),與一般化學(xué)反應(yīng)一樣,反應(yīng)速度加快,這種影響可以用反應(yīng)的溫度系數(shù)來(lái)衡量。55所謂反應(yīng)的溫度系數(shù)是指反應(yīng)溫度提高10 ,其反應(yīng)速度與原來(lái)反應(yīng)速度之比,通常用Q10來(lái)表示。對(duì)大多數(shù)酶而言,酶促化學(xué)反應(yīng)的溫度系
22、數(shù)Q10多為2,即溫度每升高10,酶促化學(xué)反應(yīng)速度為原反應(yīng)速度的2倍。其二是由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì),因此隨著溫度逐漸升高,酶蛋白會(huì)因逐漸變性而失活從而導(dǎo)致酶促化學(xué)反應(yīng)速度下降。56在不同溫度條件下進(jìn)行某種酶促化學(xué)反應(yīng),然后將所測(cè)得的酶促反應(yīng)速度相對(duì)于溫度來(lái)作圖,即可得到如圖3-9所示的鐘罩形曲線。從該曲線我們可以看出,在較低的溫度范圍內(nèi),酶促化學(xué)反應(yīng)速度隨溫度升高而增大,但在超過(guò)一定溫度后,酶促化學(xué)反應(yīng)速度不見(jiàn)上升反而下降,因此只有在某一溫度條件下,酶促化學(xué)反應(yīng)速度達(dá)到最大值,通常把這個(gè)溫度稱為酶促化學(xué)反應(yīng)的最適溫度(optimum temperature)。在一定條件下每種酶都有其催化反應(yīng)的最
23、適溫度。57一般來(lái)說(shuō),動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的酶最適溫度一般為3540,植物細(xì)胞中的酶最適溫度較動(dòng)物細(xì)胞中稍高,通常在4050之間,而微生物中的酶最適溫度差別則較大,如用于進(jìn)行PCR反應(yīng)的Taq DNA聚合酶的最適溫度可高達(dá)70。58需要指出的是,最適溫度不是酶的特征物理常數(shù),相反它常常受到其他各種條件如底物種類、作用時(shí)間、pH和離子強(qiáng)度等因素影響。一般而言,酶促反應(yīng)進(jìn)行時(shí)間長(zhǎng)時(shí)酶的最適溫度低,酶促反應(yīng)進(jìn)行時(shí)間短則最適溫度高,所以只有在規(guī)定的酶促反應(yīng)時(shí)間內(nèi)才可確定酶的最適溫度。59圖3-9 溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響 酶在固體狀態(tài)下比在溶液中對(duì)溫度的耐受力更高。酶的冰凍干粉制劑通常在冰箱中可存放幾個(gè)月以上,
24、而酶溶液一般在冰箱中只能保存數(shù)周。所以酶制劑以固體保存為佳。604.5.2 pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響除溫度影響之外,酶的活力還受到環(huán)境pH的影響。通常在一定pH下,酶會(huì)表現(xiàn)出最大活力,而一旦高于或低于此pH,酶活力就會(huì)降低,我們把表現(xiàn)出酶最大活力時(shí)的pH稱為該酶的最適pH,在不同pH條件下進(jìn)行某種酶促化學(xué)反應(yīng),然后將所測(cè)得的酶促反應(yīng)速度相對(duì)于pH來(lái)作圖,即可得到如圖3-10所示的鐘罩形曲線。61圖3-10 pH對(duì)酶活力的影響62與酶促化學(xué)反應(yīng)的最適溫度不同的是,各種酶在一定條件下都有其特定的最適pH,因此最適pH是酶的特性之一。但是酶的最適pH并不是一個(gè)常數(shù),它受諸如底物種類和濃度、緩沖液種類
25、和濃度等眾多因素的影響,因此只有在一定條件下最適pH才有意義。63絕大多數(shù)酶的最適pH在58之間,動(dòng)物體內(nèi)的酶最適pH多在6.58.0之間,植物及微生物中的酶酶最適pH多在4.56.5左右。但并不排除例外,如胃蛋白酶的最適pH為1.5,肝中精氨酸酶最適pH為9.7等等。64pH影響酶活力的原因可能包括以下幾個(gè)方面:(1)過(guò)酸或過(guò)堿使酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞,引起酶變性從而導(dǎo)致酶構(gòu)象的改變、酶活性隨之喪失。(2)當(dāng)pH改變不是十分劇烈時(shí),酶雖未發(fā)生變性,但其活力已經(jīng)受到影響。這是由于pH影響了底物的解離狀態(tài)或酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)或酶-底物復(fù)合物的解離狀態(tài),而使底物不能與酶結(jié)合形成酶-底物復(fù)合物,或者形成酶-底物復(fù)合
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