




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文檔簡介
1、DB62/ T 草類植物香豆素含量測定Determination of coumarin content in herbage plant(征求意見稿)(本稿完成日期:2022-05-06)ICS FORMTEXT CCS FORMTEXT FORMTEXT DB 甘肅省地方標準DB / FORMTEXT FORMTEXT FORMTEXT FORMTEXT - FORMTEXT - FORMTEXT 發(fā)布甘肅省市場監(jiān)督管理局 發(fā)布 FORMTEXT - FORMTEXT - FORMTEXT 實施IIIIIDB62/ T 目 次 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _To
2、c107844389 前言 PAGEREF _Toc107844389 h III HYPERLINK l _Toc107844390 1 范圍 PAGEREF _Toc107844390 h 1 HYPERLINK l _Toc107844391 2 規(guī)范性引用文件 PAGEREF _Toc107844391 h 1 HYPERLINK l _Toc107844392 3 術(shù)語和定義 PAGEREF _Toc107844392 h 1 HYPERLINK l _Toc107844393 3.1 香豆素 coumarin PAGEREF _Toc107844393 h 1 HYPERLINK
3、l _Toc107844394 4 原理 PAGEREF _Toc107844394 h 1 HYPERLINK l _Toc107844395 4.1 色譜法 PAGEREF _Toc107844395 h 1 HYPERLINK l _Toc107844396 4.2 熒光光譜法 PAGEREF _Toc107844396 h 1 HYPERLINK l _Toc107844397 4.3 紫外光譜法 PAGEREF _Toc107844397 h 1 HYPERLINK l _Toc107844398 4.4 近紅外光譜法 PAGEREF _Toc107844398 h 2 HYPERL
4、INK l _Toc107844399 4.5 電化學(xué)傳感法 PAGEREF _Toc107844399 h 2 HYPERLINK l _Toc107844400 5 試劑或材料 PAGEREF _Toc107844400 h 2 HYPERLINK l _Toc107844401 5.1 甲醇 PAGEREF _Toc107844401 h 2 HYPERLINK l _Toc107844402 5.2 乙醇 PAGEREF _Toc107844402 h 2 HYPERLINK l _Toc107844403 5.3 標準品溶液 PAGEREF _Toc107844403 h 2 HYP
5、ERLINK l _Toc107844404 5.4 標準品儲備液 PAGEREF _Toc107844404 h 2 HYPERLINK l _Toc107844405 5.5 微孔濾膜 PAGEREF _Toc107844405 h 2 HYPERLINK l _Toc107844406 5.6 乙醇/水溶液 PAGEREF _Toc107844406 h 2 HYPERLINK l _Toc107844407 5.7 四丁基四氟硼酸銨 PAGEREF _Toc107844407 h 2 HYPERLINK l _Toc107844408 5.8 N,N-二甲基甲酰胺 PAGEREF _T
6、oc107844408 h 2 HYPERLINK l _Toc107844409 5.9 電解質(zhì)溶液 PAGEREF _Toc107844409 h 2 HYPERLINK l _Toc107844410 6 儀器設(shè)備 PAGEREF _Toc107844410 h 2 HYPERLINK l _Toc107844411 6.1 高效液相色譜儀 PAGEREF _Toc107844411 h 3 HYPERLINK l _Toc107844412 6.2 分析天平 PAGEREF _Toc107844412 h 3 HYPERLINK l _Toc107844413 6.3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 PA
7、GEREF _Toc107844413 h 3 HYPERLINK l _Toc107844414 6.4 振蕩器 PAGEREF _Toc107844414 h 3 HYPERLINK l _Toc107844415 6.5 超聲波清洗器 PAGEREF _Toc107844415 h 3 HYPERLINK l _Toc107844416 6.6 穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀 PAGEREF _Toc107844416 h 3 HYPERLINK l _Toc107844417 6.7 紫外分光光度計 PAGEREF _Toc107844417 h 3 HYPERLINK l _Toc107844
8、418 6.8 近紅外光譜儀 PAGEREF _Toc107844418 h 3 HYPERLINK l _Toc107844419 6.9 電化學(xué)工作站 PAGEREF _Toc107844419 h 3 HYPERLINK l _Toc107844420 6.10 三電極 PAGEREF _Toc107844420 h 3 HYPERLINK l _Toc107844421 7 試樣制備與保存 PAGEREF _Toc107844421 h 3 HYPERLINK l _Toc107844422 8 分析步驟 PAGEREF _Toc107844422 h 3 HYPERLINK l _T
9、oc107844423 8.1 提取 PAGEREF _Toc107844423 h 3 HYPERLINK l _Toc107844424 8.2 標準曲線的制備 PAGEREF _Toc107844424 h 3 HYPERLINK l _Toc107844425 9 測定 PAGEREF _Toc107844425 h 4 HYPERLINK l _Toc107844426 9.1 色譜法測定 PAGEREF _Toc107844426 h 4 HYPERLINK l _Toc107844427 9.2 熒光光譜法測定 PAGEREF _Toc107844427 h 5 HYPERLIN
10、K l _Toc107844428 9.3 紫外光譜法測定 PAGEREF _Toc107844428 h 5 HYPERLINK l _Toc107844429 9.4 近紅外光譜法測定 PAGEREF _Toc107844429 h 5 HYPERLINK l _Toc107844430 9.5 電化學(xué)傳感法測定 PAGEREF _Toc107844430 h 5 HYPERLINK l _Toc107844431 10 試驗數(shù)據(jù)處理 PAGEREF _Toc107844431 h 5 HYPERLINK l _Toc107844432 11 精密度 PAGEREF _Toc1078444
11、32 h 6 HYPERLINK l _Toc107844433 附錄A (資料型附錄) 香豆素標準樣品色譜圖 PAGEREF _Toc107844433 h 7 HYPERLINK l _Toc107844434 附錄B (資料性附錄) 香豆素標準樣品熒光光譜圖 PAGEREF _Toc107844434 h 8 HYPERLINK l _Toc107844435 附錄C (資料性附錄) 不同樣品香豆素近紅外圖譜 PAGEREF _Toc107844435 h 9 HYPERLINK l _Toc107844436 附錄D (資料性附錄) 香豆素標準樣品電化學(xué)差分脈沖伏安圖(DPV) PAG
12、EREF _Toc107844436 h 10前言本文件按照GB/T 1.12020給出的規(guī)則起草。本文件由甘肅省林業(yè)和草原局提出并監(jiān)督實施。本文件由甘肅省草業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位: 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院、中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所、農(nóng)業(yè)部牧草與草坪草種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(蘭州)、蘭州市農(nóng)業(yè)科技研究推廣中心。本文件主要起草人: 張吉宇、董樹清、王藝蒙、彭文靜、閆啟、王彥榮、邵士俊、王朋磊、張正社。DB62/ T 草類植物香豆素含量測定范圍本文件規(guī)定草類植物中香豆素含量的色譜、光譜、電化學(xué)測定方法。本文件適用于草類植物中香豆素含量的測定和定量分析。規(guī)范性引用文件下列文件
13、中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T 14699.1 飼料 采樣術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件香豆素 coumarin2H-1-苯并吡喃-2-酮,分子式為C9H6O2,相對分子質(zhì)量146.13,呈白色結(jié)晶固體,具有抗腫瘤、抗菌、抗真菌、抗凝血等作用,可提高植物的抗逆性。原理色譜法以液體為流動相,采用高壓輸液系統(tǒng),將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱,
14、在柱內(nèi)各成分被分離后,進入檢測器進行檢測。長期以來作為最常見的主流分析方法。用80%乙醇提取草類植物樣品中的待測物質(zhì)香豆素,用液相色譜法檢測,外標法定量。熒光光譜法利用熒光激發(fā)光譜、發(fā)射光譜和三維熒光光譜,可以鑒定植物中含量高且熒光強度大的香豆素活性成分,可通過低濃度溶液熒光分析測定其含量。是強熒光物質(zhì)測定最適用的方法。紫外光譜法利用香豆素在300600nm光譜區(qū)的分子吸收來進行分析測定的方法,這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價電子和分子軌道上的電子在電子能級間的躍遷。近紅外光譜法利用香豆素中的化學(xué)鍵的泛頻振動或轉(zhuǎn)動對近紅外光的吸收特性,以漫反射或投射方式獲得在近紅外區(qū)的吸收光譜或投射光譜,建立香豆素近
15、紅外光譜模型,計算植物中香豆素的含量。電化學(xué)傳感法香豆素進入電解槽,在電解液中發(fā)生氧化還原反應(yīng),并產(chǎn)生電流,在一定范圍內(nèi),電流大小與香豆素濃度成正比。試劑或材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純;水均為GB/T 6682中規(guī)定的一級水。甲醇CH3OH, CAS號: 65-56-1,色譜純;光譜純;分析純。乙醇C2H6O, CAS號: 64-17-5,色譜純;光譜純;分析純。標準品溶液香豆素,C9H6O2, CAS號: 91-64-5,純度98%。標準品儲備液香豆素為干態(tài)標準品,準確稱量標準香豆素0.0146 g,用甲醇定容至100 mL的容量瓶中,并稀釋1000倍至濃度為0.146 g/m
16、L,超聲處理10 min后經(jīng)0.45 m濾膜過濾并作為標準品儲備液備用,現(xiàn)配現(xiàn)用。微孔濾膜尼龍濾膜或性能相當者,孔徑0.45 m。乙醇/水溶液800 mL乙醇與200 mL水超聲混勻。四丁基四氟硼酸銨C16H36BF4N, CAS號: 429-42-5,純度98%。N,N-二甲基甲酰胺C3H7NO, CAS號: 68-12-2,純度98%。電解質(zhì)溶液稱取相應(yīng)重量的四甲基四氟硼酸銨,以N,N-二甲基甲酰胺為溶劑配制成1 mol/L的電解質(zhì)。儀器設(shè)備高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器(DAD)。分析天平精確度0.0001g。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀振蕩器超聲波清洗器穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀發(fā)射波長范圍:350800n
17、m。紫外分光光度計波長范圍:300600nm。近紅外光譜儀波長范圍:14002600 nm。電化學(xué)工作站電壓范圍:48V。三電極玻碳電極、對電極、參比電極。試樣制備與保存按GB/T 14699.1的規(guī)定采集牧草樣品。將鮮草樣品于常溫通風干燥或自然曬干制成干草樣品,用四分法縮至50 g100 g,經(jīng)粉碎機粉碎,全部通過0.45 mm孔徑篩,常溫儲存?zhèn)溆?。分析步驟提取稱取干草樣品1 g(精確到0.001 g)試樣于25 mL離心管中,加入25 mL 80%乙醇溶液,振蕩10 min,常溫下超聲提取30 min后過濾,共提取2次,合并濾液,濾液減壓濃縮至干,殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中,加
18、甲醇至刻度,搖勻,經(jīng)0.45 m微孔濾膜過濾。標準曲線的制備色譜法分別準確吸取標準品儲備液0.5、1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度。準確吸取20 L,在色譜條件下進樣,以對照品峰面積(Y)作為縱坐標,進樣濃度(X)為橫坐標作圖,得線性回歸方程。熒光光譜法分別準確吸取標準品儲備液0.5、1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度。用甲醇稀釋500倍后,設(shè)定激發(fā)波長(Ex)為660 nm,采樣間隔(Inc)為 5 nm,激發(fā)狹縫(Ex Slit)為2 nm;發(fā)射波長的(Em)范圍取650-750 nm,采樣間隔(Inc)為5 nm,發(fā)射狹縫(E
19、m Slit)為2 nm;積分時間設(shè)置為(integration time):0.2 s,于S1c模式下進行二維熒光圖譜測定,以熒光強度(Y)作為縱坐標,進樣濃度(X)為橫坐標作圖,得線性回歸方程。紫外光譜法 分別準確吸取標準品儲備液0.5、1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度。用甲醇稀釋500倍,在300800 nm紫外波長范圍內(nèi)直接進樣,以吸光度(Y)作為縱坐標,進樣濃度(X)為橫坐標作圖,得線性回歸方程。近紅外光譜法將粉碎的樣品在儀器上進行多次掃描,收集每個樣品光譜值。通過光譜值與經(jīng)典分析方法測定值的對應(yīng)關(guān)系,建立預(yù)測模型,以樣品的近紅外預(yù)測值(X)為橫坐標,
20、經(jīng)典分析方法測定值(Y)為縱坐標,得線性回歸方程。電化學(xué)傳感法分別準確吸取標準品儲備液0.5、1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度。采用三電極體系,稱取適量的四丁基四氟硼酸銨作為溶質(zhì),以N,N-二甲基甲酰胺為溶劑制備1.0 mol/L電解質(zhì);測量前,用氮氣將溶液脫氣5 min。在5.0 mL電解液中加入10.0 L樣品溶液。將玻碳電極在砂紙上打磨,將氧化鋁(0.1 m)和水混合后用于電極拋光,之后超聲清洗并晾干備用。在電解池中加入5 mL的電解質(zhì)溶液,在-2.0-0.0 V電位范圍內(nèi)以1.0 mv/s的掃速進行掃描,待曲線穩(wěn)定后加入標準溶液,在上述條件下用差分脈沖伏
21、安法(DPV)測定不同樣品的氧化峰電流。每次掃描結(jié)束后,要重新超聲清洗后再檢測,這是為了保持電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。以電流(Y)作為縱坐標,進樣濃度(X)為橫坐標作圖,得線性回歸方程。測定色譜法測定高效液相色譜參考條件色譜柱: C18(填充劑:十八烷基硅烷鍵合硅膠),柱長250 mm,柱內(nèi)徑4.6 mm。流動相: A相為甲醇,B相為水,A:B為65:35。流速:1.0 mL/min。檢測波長: 280 nm。柱溫: 35 。進樣量: 20 L。色譜法定量測定取樣品溶液上機分析,通過標準曲線作多點校準,用外標法定量測定。熒光光譜法測定熒光光譜法參考條件二維熒光光譜激發(fā)波長600 nm,發(fā)射波長672 nm,狹縫4 nm,步徑2 nm,樣品量2 mL。光譜法定量測定 待測樣品按照8.1方法制備好樣品溶液,使用熒光分光光度計進行測定,由8.2.2的標準曲線查得樣品中香豆素的濃度。紫外光譜法測定紫外光譜法參考條件紫外波長范圍: 300800 nm, 樣品量
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