DB34-T 4203-2022 豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定規(guī)程

1、ICS11.220CCSB 41ICS11.220CCSB 41安徽省地方標準DB34/T42032022豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定規(guī)程Regulation for detection of extraintestinal pathogenic Escherichia coli from swine20222022062920220729安徽省市場監(jiān)督管理局發(fā) 布DB34/T 4203DB34/T 42032022前言本文件按照GB/T 1.12020標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則的規(guī)定起草。 本文件由安徽省農業(yè)農村廳歸口。 I I DB34/T 4203DB34/T

2、42032022DB34/T 42032022麥康凱培養(yǎng)基（MAC）：按照 GB 4789.6 規(guī)定執(zhí)行。革蘭氏染色液：按照 GB 4789.41 規(guī)定執(zhí)行。 三糖鐵（TSI）瓊脂斜面培養(yǎng)基：按照 GB 4789.6 規(guī)定執(zhí)行。蛋白胨水和靛基質試劑：按照 GB 4789.6 規(guī)定執(zhí)行。 緩沖葡萄糖蛋白胨水和甲基紅試劑、V-P 試劑：按照 GB 4789.38 規(guī)定執(zhí)行。枸櫞酸鹽培養(yǎng)基：按照 GB 4789.38 規(guī)定執(zhí)行。 LB 固體培養(yǎng)基：見附錄A 中 A.3。 試驗小鼠：68 周齡，體重 18 g22 g，清潔級。 大腸桿菌 O 抗原單因子標準血清。 DB34/T 42032022麥康凱培

3、養(yǎng)基（MAC）：按照 GB 4789.6 規(guī)定執(zhí)行。革蘭氏染色液：按照 GB 4789.41 規(guī)定執(zhí)行。 三糖鐵（TSI）瓊脂斜面培養(yǎng)基：按照 GB 4789.6 規(guī)定執(zhí)行。蛋白胨水和靛基質試劑：按照 GB 4789.6 規(guī)定執(zhí)行。 緩沖葡萄糖蛋白胨水和甲基紅試劑、V-P 試劑：按照 GB 4789.38 規(guī)定執(zhí)行。枸櫞酸鹽培養(yǎng)基：按照 GB 4789.38 規(guī)定執(zhí)行。 LB 固體培養(yǎng)基：見附錄A 中 A.3。 試驗小鼠：68 周齡，體重 18 g22 g，清潔級。 大腸桿菌 O 抗原單因子標準血清。 豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定規(guī)程范圍 本文件適用于豬腸外致病性大腸桿菌的分離鑒定。 （ GB

4、 4789.6GB 4789.38GB 4789.41 GB 19489 實驗室 生物安全通用要求 SN/T 2984 檢驗檢疫動物病原微生物實驗活動生物安全要求細則 3 術語和定義下列術語和定義適用于本文件。 腸外致病性大腸桿菌 extraintestinal pathogenic SN/T 2984 檢驗檢疫動物病原微生物實驗活動生物安全要求細則 3 術語和定義下列術語和定義適用于本文件。 腸外致病性大腸桿菌 extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC 4 主要設備和材料顯微鏡：10100。 電子天平：感量 0.1 g。 恒溫培養(yǎng)箱：

5、37。冰箱：04。 無菌培養(yǎng)皿：直徑 75 mm 或 90 mm。 無菌試管：12 mm100 mm，15 mm150 mm。麥氏比濁管。 pHpHpH和氯化鈉溶液：見附錄AA.1 30甘油緩沖鹽水溶液：見附錄 A 中 A.2。 1 5 操作規(guī)程 ExPEC分離鑒定的流程示意圖見附錄B。 30 甘油緩沖72 （04）培養(yǎng) 18 h24 （菌1.0 mm2.5 mm）18 h24 （TSI）37 培養(yǎng) 18 h24 h。H2S37 培養(yǎng) 18 h24 h，（I）（MR）、V- P（Vi）（C）IMViCIMViC4789.38、GB 4789.6取1055.2.30.50.3 mL鼠每只腹腔注射

6、 0.3 mL3 d 內小鼠精神狀況及死亡情MAC，37 培養(yǎng) 24 h2 TSMViExPEC。 O見附錄C。見附錄D。 5.2.2，5.2.3，5.2.4，ExPEC 6.15.2.5，OExPCE 6.15.2.6，ExPCE 應按照 GB 19489、SN/T 2984 和 SN/T 2025 的規(guī)定執(zhí)行。 3 3 DB34/T 4203DB34/T 42032022DB34/T 4203DB34/T 42032022附 錄 A（） 成分氯化鈉38.0 g39.0 蒸 餾 水 100 mL 制法將 38.0 g39.0 g 氯化鈉加入 100 mL 蒸餾水中，充分攪拌，待完全溶解混勻后

7、，分裝于采樣管，每管 5 mL10 mL，121 高壓滅菌 15 min 備用。 30成分氯化鈉0.5 中 性 甘 油 30 mL 蒸 餾 水 100 mL A.2.2 制 法5 mL10 15 min 備用。 LB中 性 甘 油 30 mL 蒸 餾 水 100 mL A.2.2 制 法5 mL10 15 min 備用。 LB成分胰蛋胨10.0 酵母取物5.0 氯化鈉10.0 瓊脂15.0 g20.0 蒸 餾 水 1000 mL 制法將 A.3.1 中各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至 7.40.2，121滅菌 20 min，待冷卻至50 左右時傾注平板。 4 圖B.1 圖B.15 附

8、錄 B（資料性）豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定流程見圖B.1。 檢 樣 麥康凱培養(yǎng)基分離培養(yǎng) （菌落呈鮮紅色或粉紅色，中等大小，直徑 1.0 mm2.5 mm，圓形，邊緣整齊，表面光滑） 選取可疑菌落涂片鏡檢、純培養(yǎng) 檢 樣 麥康凱培養(yǎng)基分離培養(yǎng) （菌落呈鮮紅色或粉紅色，中等大小，直徑 1.0 mm2.5 mm，圓形，邊緣整齊，表面光滑） 選取可疑菌落涂片鏡檢、純培養(yǎng) （革蘭氏陰性直短桿菌，兩端鈍圓，無芽孢，多散在，也有成對排列） 生化試驗 （TSI：面底均或變，氣產H2SIMViC + + 腸外大腸桿菌 動物試驗 OPCR 腸外致病性大腸桿菌 系統(tǒng)進化群 PCR 鑒定 結果報告 附 錄 C（資

9、料性）豬腸外致病性大腸桿菌 O 抗原血清型鑒定ExPECO將ExPECLB37 培養(yǎng) 18 h24 h，用 3mL 0.5121 高壓滅菌 2 hKO抗原，儲存于 備用。 ExPECO取O抗原分別與大腸桿菌的O抗原單因子血清進行玻片凝集反應。即O抗原和O抗原單因子血清各取15 L 在玻片上混勻，2 min 內出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應。同時以O抗原與 0.5 石炭酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝集現(xiàn)象。玻片凝集試驗判定標準見表C.1。表C.1 玻片凝集試驗判定標準反應強度 判斷依據(jù) 對應結果 + 液體完全透明，出現(xiàn)大的凝集塊 陽性 + 液體幾乎完全透明，有明顯凝集塊 陽性 + 液體不甚透明，

10、有可見凝集塊 陽性 + 液體渾濁，有小的顆粒狀物 陰性 - 液體渾濁，無凝集現(xiàn)象 陰性 ExPECO1:640O器加入 0.5mL 0.5 石炭酸生理鹽水。用移液器吸取 1:10O mL168mL20.5 mL3770.5 mL8171:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280； 0.5 mL O 37 水浴鍋 4h （以“” “”，100“”75 6 “”，50 “”25 “” 7 7 附 錄 D（資料性）豬腸外致病性大腸桿菌系統(tǒng)進化群 PCR 鑒定PCR1.5 mL 離心管、0.2 mL PCR2PCR Master Mix、超純水、瓊脂糖、10mg/ML

11、溴化乙錠（EB）、TBE 緩沖液、上樣緩沖液（10Loading Buffer）、相對分子質量Marker（DL-2000）。豬腸外致病性大腸桿菌系統(tǒng)進化群PCR鑒定用引物見表D.1。 ExPECExPECDNA采用煮沸法。即取 1 mL 培養(yǎng) 20 h 的新鮮菌液加入 1.5 mL 離心管中，以 12000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入 50 L 超純水混均，置沸水中煮沸 10 min，之后冰浴 5 min，再煮沸 5 min， 以 12000 r/min 離心 5 min，取上清液即為DNA模板。 ExPECPCR擴增AB1B2D PCR25L12.5L 的 PCRMaste

12、rMix，10mol/L上、下游引物各 1 L，1 g/L DNA 模板 2 L，滅菌超純水 8.5 L。 PCR94 5min 94 4560 4572 50環(huán) 35 次；725min。 D.2.3 PCR8 檢測基因引物名稱引物序列（5-3）片段長度（bp）chuAchuA-FchuA-RGACGAACCAACGGTCAGGATTGCCGCCAGTACCAAAGACA279yjaAyjaA-FyjaA-RTGAAGTGTCAGGAGACGCTGATGGAGAATGCGTTCCTCAAC211TspE4.C2TspE4.C2-FTspE4.C2-RGAGTAATGTCGGGGCATTCACGCGCCAACAAAGTATTACG152用 100 mL1TAE1.0